專利名稱：吲哚基馬來酰亞胺衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及吲哚基馬來酰亞胺衍生物、它們的制備方法以及包含它們的藥物組合物。
更具體地，本發(fā)明提供了式I化合物 其中Ra為H；C1-4烷基；或被OH、NH2、NHC1-4烷基或N(二-C1-4烷基)2取代的C1-4烷基；Rb、Rc、Rd和Re之一為鹵素；C1-4烷氧基；或C1-4烷基，且其他三個取代基各自為氫；或Rb、Rc、Rd和Re全為氫；且R為式(a)的基團(tuán) 其中R1為-(CH2)n-NR3R4，其中R3和R4各自獨立為H或C1-4烷基；或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)殘基；n為0、1或2；且R2為H；鹵素；C1-4烷基；CF3；OH；SH；NH2；NO2；C1-4烷氧基；C1-4烷硫基；NHC1-4烷基；N(二-C1-4烷基)2或CN。
式I化合物可為游離形式或鹽形式。
烷基和烷氧基可為直鏈或支鏈。
鹵素可為F、Cl、Br或I，優(yōu)選F、Cl或Br。
雜環(huán)殘基指3至8元、優(yōu)選5至8元飽和、不飽和或芳族雜環(huán)，含有1或2個優(yōu)選選自N、O和S的雜原子，并任選被取代。
適宜的R1實例包括例如吡啶基，如3-或4-吡啶基；哌啶基，如哌啶-1-基、3-或4-哌啶基、高哌啶基；哌嗪基、高哌嗪基、咪唑基、咪唑烷基、吡咯基、吡咯烷基或嗎啉-4-基，任選被取代，如單或多取代。當(dāng)雜環(huán)殘基被取代時，取代可在一個或多個環(huán)碳原子上和/或當(dāng)存在時的環(huán)氮原子上。環(huán)碳原子上取代基的實例包括例如C1-4烷基，如CH3；C3-6環(huán)烷基，如環(huán)丙基，任選進(jìn)一步被C1-4烷基取代； 其中p為1、2或3，優(yōu)選1；CF3；鹵素；NH2；-CH2-NR7R8，其中R7和R8各自獨立地為H或C1-4烷基，或R7和R8與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)殘基或雜芳基；-CH2-OH；-CH2-O-C1-4烷基；-CH2-鹵素；或-CH2-CH2-鹵素。環(huán)氮原子上取代基的實例為例如C1-6烷基；?；?，如R’x-CO，其中R’x為H、C1-6烷基，或苯基，任選被C1-4烷基、C1-4烷氧基或氨基取代，例如甲酰基；C3-6環(huán)烷基；C3-6環(huán)烷基-C1-4烷基；苯基；苯基-C1-4烷基，如芐基；雜環(huán)殘基，例如如上所公開，例如包含1或2個氮原子的芳族雜環(huán)殘基；或式β的殘基-R5-Y’(β)其中R5為被O中斷的C2-4亞烷基或C1-4亞烷基，且Y’為OH、NH2、NH(C1-4烷基)或N(C1-4烷基)2。被O中斷的C2-4亞烷基可為例如-CH2-CH2-O-CH2-CH2-。
式I化合物可以以游離形式或鹽形式存在，例如與有機酸或無機酸、例如鹽酸、乙酸、三氟乙酸的鹽。
應(yīng)該理解，式I化合物可以以光學(xué)異構(gòu)體、外消旋物或非對映異構(gòu)體形式存在。例如，哌嗪殘基3位上帶有取代基的環(huán)碳原子是不對稱的，可具有R或S構(gòu)型。應(yīng)該理解，本發(fā)明包含所有的對映體和它們的混合物。對映體比外消旋體優(yōu)選。類似的考慮也適用于顯示如上所述不對稱碳原子的原料。
在式I化合物中，優(yōu)選單獨或任何亞組合的下列含義1.Ra為H或甲基；2.Rb、Rc、Rd和Re之一為甲基或乙基，且其他三個取代基各自為H；或Rb、Rc、Rd和Re全為H；3.R2為H、Cl、NO2、CF3、F或甲基4.n為1；且5.R3和R4各自獨立地為H、甲基、乙基或異丙基；或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)殘基，例如任選取代的哌嗪基或吡咯烷基。
本發(fā)明也包括式I化合物的制備方法，該方法包括使式II化合物 其中Ra、Rb、Rc、Rd和Re如上所定義，與式III化合物反應(yīng)R-CH2-CO-NH2(III)其中R如上所定義，并且如有需要，適當(dāng)?shù)貙@得的游離形式的式I化合物轉(zhuǎn)化為鹽形式，或反之亦然。
該方法可方便地在強堿如t-BuOK存在下進(jìn)行，如其內(nèi)容在此處引用作為參考的WO02/38561或WO 03/08259所公開以及如實施例中所闡明。
式II和式III化合物可根據(jù)已知方法制備，如其內(nèi)容在此處引用作為參考的WO02/38561或WO 03/08259所公開以及如實施例中所闡明。
在原料的制備沒有具體描述的情況下，則該化合物是已知的或可類似于本領(lǐng)域已知方法或此后所述的方法制備。
下列實施例說明而非限制本發(fā)明。
RT＝室溫THF＝四氫呋喃DMF＝二甲基甲酰胺EtOAc＝乙酸乙酯Pd2(dba)3＝Pd(0)-二(二亞芐基丙酮)FCC＝快速柱色譜法TLC＝薄層色譜法實施例13-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮 在氬氣氛下，將經(jīng)活化的3分子篩(50mg)加入到2-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酰胺(54.6mmol，0.20mmol)和(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-氧代-乙酸甲酯(55.7mg，0.26mmol)在干燥THF(2.5ml)中的溶液中。然后在室溫下一次性加入1.0M KOtBu在THF(0.59ml，0.59mmol)中的溶液。室溫下30分鐘后，TCL分析表明原料完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋并傾入飽和NH4Cl水溶液中。分離有機層，用鹽水洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并將有機溶劑蒸發(fā)。殘余物經(jīng)FCC純化(EtOAc/AcOH/H2O700∶110∶90)，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)δ2.12(s，6H)，3.46(s，2H)，3.82(s，3H)，6.16(d，J＝8.8Hz，1H)，6.45-6.51(m，1H)，6.96-7.02(m，1H)，7.32-7.40(m，2H)，7.60-7.68(m，2H)，7.88(s，1H)，8.06(d，J＝10Hz，1H)，8.15(s，1H)。ES+-MS445.5，446.6[M+H]+。
2-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酰胺的制備在氬氣氛下，將2-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸(276mg，0.99mmol)溶解于DMF(3ml)中。加入1，1-羰基二咪唑(177mg，1.09mmol)，并將澄清的溶液在室溫攪拌3小時。加入濃氨水溶液(25％，6ml)，在室溫繼續(xù)攪拌10分鐘。TCL分析表明原料完全消耗。將反應(yīng)混合物傾至水中。水層用乙酸乙酯萃取，然后用鹽水洗滌并用Na2SO4干燥。在除去溶劑后，發(fā)現(xiàn)殘余物為純的標(biāo)題化合物，無需純化。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)δ2.18(s，6H)，3.53(s，2H)，4.08(s，2H)，6.96-7.08(br，2H)，7.48-7.68(m，2H)，7.78-7.86(m，2H)，7.96-8.00(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS277.3，279.2[M+H]+。
(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸的制備將(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸乙酯(223mg，0.73mmol)溶解于二烷(2.6ml)中。然后加入水(0.96ml)和氫氧化鋰(21mg，0.88mmol)，將反應(yīng)混合物溫至60℃達(dá)4小時，HPLC分析表明原料完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)用水稀釋，通過加入1M NaHSO4水溶液將pH調(diào)節(jié)至6-7，并用乙酸乙酯萃取。然后濃縮水層，將固體殘余物反復(fù)用甲醇萃取，得到純的標(biāo)題化合物。ES+-MS278.3，280.1[M+H]+。
(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛下，將二甲胺(5.6M乙醇中的溶液，0.28ml，1.53mmol)加入到(2-氯-6-甲?；?萘-1-基)-乙酸乙酯(284mg，1.02mmol)在THF(10ml)中的溶液中。將混合物在室溫攪拌18小時，然后加入氰基氫硼化鈉(78mg，1.23mmol)在甲醇(2ml)中的溶液和冰醋酸(0.29ml，5.13mmol)。在室溫攪拌1小時后，TCL分析表明原料完全消耗。將反應(yīng)混合物用水稀釋并通過加入濃NaHCO3水溶液調(diào)節(jié)pH至8-9。用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并除去溶劑，得到反應(yīng)產(chǎn)物粗品。通過FCC(CH2Cl2/EtOH/NH3190∶9∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.26(t，J＝9Hz，3H)，2.30(s，6H)，3.59(s，2H)，4.18(q，J＝9Hz，2H)，4.30(s，2H)，7.49(d，J＝10Hz，1H)，7.54-7.58(m，1H)，7.69-7.76(m，2H)，7.91(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS306.4，308.3[M+H]+。
(2-氯-6-甲?；?萘-1-基)-乙酸乙酯的制備將(2-氯-6-氰基-萘-1-基)-乙酸乙酯(1.39g，5.07mmol)溶解于水(17ml)、吡啶(33ml)和冰醋酸(17ml)的混合物中。然后在室溫加入次磷酸鈉(4.30g，40.62mmol)和阮內(nèi)鎳(3.2g)。將反應(yīng)混合物加熱至100℃達(dá)1小時。TCL分析表明原料完全消耗。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并通過硅藻土過濾。加入硅膠后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去溶劑。通過FCC(己烷/乙酸乙酯5∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.17(t，J＝8Hz，3H)，4.10(q，J＝8Hz，2H)，4.24(s，2H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)，7.82(d，J＝10Hz，1H)，7.94-7.98(m，2H)；8.26(s，1H)，10.09(s，1H)。ES--MS275.2，277.3[M-H]-。
(2-氯-6-氰基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛下，將(2-氯-6-三氟甲磺酰氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯(3.59g，9.04mmol)溶于DMF(30ml)中。在加入四(三苯膦)鈀(0)(418mg，0.36mmol)和氰化鋅(II)(2.12g，18.09mmol)后，將反應(yīng)混合物加熱至125℃。1小時后，TCL分析表明原料完全消耗。將混懸液冷卻至室溫并傾入水中。用乙酸乙酯萃取，然后用1M HCl水溶液、飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌有機層。用Na2SO4干燥并除去溶劑后，通過FCC(己烷/乙酸乙酯3∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)δ1.06(t，J＝8Hz，3H)，3.98(q，J＝8Hz，2H)，4.24(s，2H)，7.66(d，J＝10Hz，1H)，7.79(d，J＝10Hz，1H)，7.96(d，J＝10Hz，1H)，8.13(d，J＝10Hz，1H)，8.54(s，1H)。
(2-氯-6-三氟甲磺酰氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛下，將(2-氯-6-羥基-萘-1-基)-乙酸乙酯(3.39g，12.80mmol)溶于吡啶(35ml)中。冷卻至0℃后，在15分鐘內(nèi)滴加三氟甲磺酸酐(2.32ml，14.08mmol)。在0℃攪拌15分鐘和室溫攪拌1小時后，TCL分析表明原料完全消耗。將反應(yīng)混合物傾入1M NaHCO3水溶液中。用乙酸乙酯萃取后，用鹽水洗滌并用Na2SO4干燥有機層，濃縮，生成反應(yīng)產(chǎn)物的粗品。通過FCC(己烷/乙酸乙酯4∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.48(t，J＝9Hz，3H)，4.41(q，J＝9Hz，2H)，4.52(s，2H)，7.68(d，J＝10Hz，1H)，7.82(d，J＝10Hz，1H)，7.98-8.00(m，2H)，8.27(d，J＝10Hz，1H)。
(2-氯-6-羥基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛下，將(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯(5.43g，19.48mmol)和四丁基碘化銨(9.35g，25.32mmol)溶解于CH2Cl2(110ml)中。將反應(yīng)混合物冷卻至-78℃，在15分鐘內(nèi)加入1M BBr3的CH2Cl2溶液(48.7ml，48.7mmol)。在-78℃攪拌10分鐘和室溫攪拌10分鐘后，TCL分析表明原料完全消耗。將反應(yīng)混合物傾入濃NaHCO3水溶液中，并將混合物在室溫劇烈攪拌20分鐘。用CH2Cl2萃取后，有機層用鹽水洗滌并用Na2SO4干燥。通過FCC(己烷/乙酸乙酯2∶1)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.19(t，J＝9Hz，3H)，4.12(q，J＝9Hz，2H)，4.18(s，2H)，5.35-5.60(br，1H)，6.93(s，1H)，6.99(d，J＝10Hz，1H)，7.33(d，J＝10Hz，1H)，7.42(d，J＝10Hz，1H)，7.70(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS265.2，266.8[M+H]+。
(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛下，將(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯和(2-氯-6-甲氧基-3，4-二氫-萘-1-基)-乙酸乙酯的混合物(4.07g，約14.6mmol)溶解于二烷(40ml)中。加入2，3-二氯-5，6-二氰基-對-苯醌(DDQ，7.30g，32mmol)，將反應(yīng)混合物回流4小時。冷卻至室溫后，加入甲醇使得反應(yīng)混合物均勻。加入硅膠，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。通過FCC(己烷/乙酸乙酯980∶20至960∶40)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.32(t，J＝9Hz，3H)，4.00(s，3H)，4.26(q，J＝9Hz，3H)，4.34(s，2H)，7.21(s，1H)，7.30(d，J＝10Hz，1H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)，7.71(d，J＝10Hz，1H)，7.92(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS279.1，280.9[M+H]+。
(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯和(2-氯-6-甲氧基-3，4-二氫-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛下，將(2-氯-1-羥基-6-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-1-基)-乙酸乙酯(5.0g，16.64mmol)、1，1-二苯基乙烯(3.2ml)、1-甲基-萘(3ml)和披鈀炭(10％，500mg)的混合物加熱至180℃。3小時后，TCL分析表明原料完全消耗。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋并過濾。除去乙酸乙酯并通過FCC(己烷100至己烷/乙酸乙酯980∶20至960∶40)純化，得到標(biāo)題化合物混合物。
(2-氯-1-羥基-6-甲氧基-1，2，3，4-四氫-萘-1-基)-乙酸乙酯的制備在氬氣氛、-78℃下，將乙酸乙酯(7.2ml，73.96mmol)在THF(20ml)中的溶液緩慢加入到二異丙胺鋰(從10.5ml二異丙胺(73.96mmol)和46.2ml1.6M n-BuLi的己烷溶液(73.96mmol)制得)在THF(20ml)的溶液中。在-78℃攪拌30分鐘后，在30分鐘內(nèi)緩慢加入2-氯-6-甲氧基-3，4-二氫-2H-萘-1-酮(7.79g，36.98mmol)在THF(20ml)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-78℃攪拌24小時。TCL分析表明原料完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋并傾入飽和NH4Cl水溶液中。分離有機層并用鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，除去溶劑。通過FCC(己烷/乙酸乙酯920∶80至880∶120)純化，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.22(t，J＝9Hz，3H)，2.33-2.41(m，2H)，2.80-3.12(m，4H)；3.12(s，1H)，3.78(s，3H)，4.12(q，J＝9Hz，2H)，5.01-5.04(m，1H)，6.60-6.62(m，1H)，6.78-6.82(m，1H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)。
2-氯-6-甲氧基-3，4-二氫-2H-萘-1-酮的制備在氬氣氛、-78℃下，將6-甲氧基-3，4-二氫-2H-萘-1-酮(5.0g，28.37mmol)在THF(25ml)中的溶液緩慢加入到二異丙胺鋰在THF中的溶液中(25ml；從4.0ml二異丙胺(28.37mmol)和17.7ml 1.6M n-BuLi的己烷溶液(28.37mmol)制得)。在-78℃30分鐘后，在20分鐘內(nèi)加入對-甲苯磺酰氯(5.41g，28.37mmol)在THF(25ml)中的溶液。移去干冰冷卻浴，并任反應(yīng)混合物升至室溫。1小時后，TCL分析表明原料完全消耗。加入飽和NH4Cl水溶液(100ml)，并將混合物在室溫攪拌15分鐘。分離有機層，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。通過FCC純化(己烷/乙酸乙酯920∶80至880∶120)，得到標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.54-2.63(m，1H)，2.68-2.75(m，1H)，3.04-3.12(m，1H)，3.38-3.46(m，1H)，4.02(s，3H)；4.72-4.76(m，1H)，6.87(s，1H)，7.00-7.04(m，1H)，8.22(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS279.1，280.9[M+H]+。
按照實施例1的方法，但使用適當(dāng)?shù)脑希色@得式A化合物，其中Ra、Rb、R2、R3和R4如下表2所示。
表2
游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物呈現(xiàn)有價值的藥理性質(zhì)，例如抑制蛋白激酶C(PKC)如PKC同工型如α、β、δ、ε、η或θ、抑制T細(xì)胞活化和增殖，例如通過抑制T細(xì)胞或細(xì)胞因子如IL-2的生成、通過抑制T細(xì)胞對細(xì)胞因子如IL-2的增殖反應(yīng)，例如體外和體內(nèi)實驗所示，因此適應(yīng)于治療。
A.體外1.蛋白激酶C測定按照下列方法測定本發(fā)明化合物對不同PKC同工型的活性。測定在透明底、無結(jié)合表面的白色384孔微量滴定板中進(jìn)行。反應(yīng)混合物(25μl)在20mM Tris-HCl緩沖液pH7.4+0.1％BSA中含有1.5μM用丙氨酸→絲氨酸替換模擬PKCα假底物序列的十三肽受體底物、10μM33P-ATP、10mMMg(NO3)2、0.2mM CaCl2、蛋白質(zhì)濃度從25至400ng/ml的PKC(取決于使用的同工型)、最終脂質(zhì)濃度為0.5mM的脂囊泡(含有30mol％磷脂酰絲氨酸、5mol％DAG和65mol％磷脂酰膽堿)。在室溫進(jìn)行孵育60分鐘。加入50μl終止混合物(100mM EDTA、200μM ATP、0.1％ Triton X-100、0.375mg/孔鏈霉抗生物素包衣的SPA珠，在膦酸鹽緩沖的鹽水w/o Ca、Mg中)，使反應(yīng)停止。在室溫孵育10分鐘后，將混懸液在300g離心10分鐘。在Trilux計數(shù)器中測定所摻入的放射活性達(dá)1分鐘。通過孵育濃度為1-1000μM的抑制劑系列稀釋液，基于常規(guī)進(jìn)行IC50測定。IC50值用XLfit軟件進(jìn)行曲線擬合由圖中計算。
2.蛋白激酶Cα測定人重組PKCα得自O(shè)xford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的測定條件下使用。在本測定中，式I化合物抑制PKCα的IC50≤1μM。例如，實施例6化合物抑制PKCα的IC50為1.1nM，實施例5化合物的IC50為0.9nM。
3.蛋白激酶Cβ1測定人重組PKCβ1得自O(shè)xford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的測定條件下使用。在本測定中，式I化合物抑制PKCβ1的IC50≤1μM。例如，實施例5化合物抑制PKCβ1的IC50為2.3nM，實施例7化合物的IC50為2.8nM。
4.蛋白激酶Cδ測定人重組PKCδ得自O(shè)xford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的測定條件下使用。在本測定中，式I化合物抑制PKCδ的IC50≤1μM。例如，實施例4化合物抑制PKCδ的IC50為9.4nM，實施例5化合物的IC50為4.5nM。
5.蛋白激酶Cε測定人重組PKCε得自O(shè)xford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的測定條件下使用。在本測定中，式I化合物抑制PKCε的IC50≤1μM。例如，實施例1化合物抑制PKCε的IC50為17.6nM，實施例6化合物的IC50為2.3nM。
6.蛋白激酶Cη測定人重組PKCη得自PanVera，并在上述A.1部分所述的測定條件下使用。在本測定中，式I化合物抑制PKCη的IC50≤1μM。例如，實施例3的化合物抑制PKCη的IC50為53.9nM，實施例4化合物的IC50為7.2nM。
7.蛋白激酶Cθ測定人重組PKCθ在以上所述的測定條件下使用。在本測定中，式I化合物抑制PKCθ的IC50≤1μM。例如，實施例1化合物抑制PKCθ的IC50為19.2nM，實施例7化合物的IC50為6.4nM。
8.CD28共刺激測定使用經(jīng)人白細(xì)胞介素-2啟動子/報道基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行測定，如Baumann G等人在Transplant.Proc.1992；2443-8中所述，β-半乳糖苷酶報道基因被熒光素酶基因所替代(de Wet J.等人，Mol.Cell Biol.1987，7(2)，725-737)。如下通過固相偶聯(lián)抗體或佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和Ca++離子載體離子霉素刺激細(xì)胞。對于抗體介導(dǎo)的刺激，將Microlite TM1微量滴定板(Dynatech)用含3μg/ml山羊抗鼠IgG Fc抗體(Jachson)的55μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)/每孔在室溫包被3小時。除去抗體后，通過與含2％牛血清白蛋白(BAS)的PBS(300μl每孔)于室溫孵育2小時將板封閉。每孔用300μl PBS洗滌3次后，加入50μl 2％ BSA/PBS中的10ng/ml抗T細(xì)胞受體抗體(WT31，Becton&Dickinson)和300ng/ml抗CD28抗體(15E8)作為刺激抗體，并在4℃孵育過夜。最后，將板中每孔用300μl PBS洗滌三次。在單獨的板中制備供試化合物在測定介質(zhì)(PRMI1640/10％胎牛血清(FCS)，含有50μM 2-巰基乙醇、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中的7份3倍系列稀釋液，一式兩份，與轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞(克隆K22 290 H23)混合并在37℃、5％CO2中孵育30分鐘。然后將含有1×105個細(xì)胞的100μl該混合物轉(zhuǎn)移至抗體包被的測定板。平行地將100μl與40ng/ml PMA和2μM離子霉素孵育。在37℃、5％CO2中孵育5.5小時后，通過生物發(fā)光法確定熒光素酶的水平。將板在500g離心10分鐘，輕輕拂去上清液。加入溶胞緩沖液，其含有25mM Tris-磷酸鹽pH7.8、2mMDTT、2mM 1.2-二氨基環(huán)己烷-N，N，N’，N-四乙酸、10％(v/v)甘油和1％(v/v)Triton X-100(20μl每孔)。在持續(xù)振搖中將板在室溫孵育10分鐘。在自動添加50μl每孔熒光素酶反應(yīng)緩沖液后，用生物發(fā)光讀取器(Labsystem，Helsinki，芬蘭)評價熒光素酶活性，所述緩沖液含有20mM Tricine、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2x5H2O、2.67mM MgSO4、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、270μM輔酶A、470μM熒光素(Chemie Brunschwig AG)、530μM ATP pH7.8。延遲時間為0.5秒，總測定時間為1或2秒。低對照值為經(jīng)抗T細(xì)胞受體或PMA刺激的細(xì)胞的光單位，高對照來自無任何供試樣品的經(jīng)抗T細(xì)胞受體/抗CD28-或PMA/離子霉素刺激的細(xì)胞。從所有值中減去低對照值。在供試化合物存在下獲得的抑制計算為高對照的抑制百分?jǐn)?shù)。產(chǎn)生50％抑制的供試化合物濃度(IC50)由劑量反應(yīng)曲線確定。在本測定中，式I化合物抑制抗T細(xì)胞受體/抗CD28和PMA/離子霉素刺激的Jurkat細(xì)胞，其IC50≤1μM。
例如，實施例5化合物抑制抗T細(xì)胞受體/抗CD28和PMA/離子霉素刺激的Jurkat細(xì)胞，IC50為11.5nM，實施例7化合物的IC50為27.5nM。
9.同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Immunol.Methods，1973，2，279和Meo T.等人，Immunological Methods，紐約，Academic Press，1979，227-39)進(jìn)行雙向MLR。簡言之，將來自CBA和BALB/c小鼠的脾細(xì)胞(在平底組織培養(yǎng)微量滴定板中每個細(xì)胞株每孔含有1.6×105個細(xì)胞，共計3.2×105個細(xì)胞)在RPMI介質(zhì)中孵育，所述介質(zhì)含有10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(Gibco BRL，Basel，瑞士)、50μM 2-巰基乙醇(Fluka，Buchs，瑞士)和連續(xù)稀釋的化合物。每種供試化合物進(jìn)行7個3倍稀釋步驟，一式兩份。孵育4天后，加入1μCi3H-胸苷。在額外5個小時的孵育期后，收獲細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法確定摻入的3H-胸苷。MLR的背景值(低對照)是單獨BALB/c細(xì)胞的增殖。從所有值中減去低對照。無任何樣品的高對照作為100％增殖。計算樣品的抑制百分?jǐn)?shù)，并確定50％抑制所需濃度(IC50值)。
例如，實施例5化合物抑制的IC50為183nM，實施例7化合物的IC50為528nM。
B.體內(nèi)大鼠心臟移植使用的品系組合雄性Lewis(RT1單倍型)和BN(RT1單倍型)。使用吸入性異氟烷麻醉動物。通過腹部下腔靜脈、同時經(jīng)由主動脈放血將供體大鼠肝素化后，打開胸腔，將心臟迅速冷卻。于第一分枝遠(yuǎn)端結(jié)扎主動脈并離斷，在第一分岔離斷頭臂干。結(jié)扎左肺動脈并離斷，右側(cè)離斷但左側(cè)開放。所有其他血管自由切開、結(jié)扎并離斷，并將供體心臟移至冰鹽水中。
通過解剖和交叉夾緊腎下腹部主動脈和腔靜脈準(zhǔn)備受體。使用10/0單絲縫合線，在供體頭臂干和受體主動脈之間以及供體右肺動脈至受體腔靜脈之間，以末端到側(cè)面吻合植入移植物。除去夾子，移植物栓系于后腹，腹部內(nèi)容物用熱鹽水沖洗，閉合動物并令其在加熱燈下恢復(fù)。移植物的存活通過每日腹壁觸診搏動的供體心臟而監(jiān)測。當(dāng)心臟搏動停止時視為完全排斥。在用式I化合物以日劑量1至100mg/kg bid、優(yōu)選1至30mg/kg bid口服施用處理的動物中獲得了移植物存活的增加。
移植物抗宿主模型將來自Wistar/F大鼠的脾細(xì)胞皮下注射入F1雜交大鼠的右后足墊(Wistar/F x Fischer 344)。左足墊不予處理。連續(xù)4天(0-3)用供試化合物處理動物。在第7天移去腿彎部淋巴結(jié)，確定兩個相應(yīng)的淋巴結(jié)之間重量的差別。結(jié)果以淋巴結(jié)擴(kuò)大的抑制表示(以百分?jǐn)?shù)表示)，其比較了在試驗組中淋巴結(jié)重量的差別與相應(yīng)的未用供試化合物處理組動物中淋巴結(jié)重量之間的差別。用式I化合物以日劑量1至100mg/kg bid口服施用的動物中獲得了對淋巴結(jié)擴(kuò)大的作用。
因此，式I化合物可用于治療和/或預(yù)防由T淋巴細(xì)胞和/或PKC介導(dǎo)的疾病或病癥，例如器官或組織同種或異種移植物的急性或慢性排斥、移植物抗宿主疾病、動脈粥樣硬化、由于血管損傷如血管成形術(shù)造成的血管阻塞、再狹窄、肥胖癥、X綜合癥、葡萄糖耐量受損、多囊卵巢綜合征、高血壓、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病、CNS疾病如阿爾茨海默病或肌萎縮側(cè)索硬化、癌癥、感染性疾病如AIDS、膿毒性休克或成人呼吸窘迫綜合征、缺血/再灌注損傷如心肌梗塞、中風(fēng)、腸道缺血、腎衰竭或出血性休克，或創(chuàng)傷性休克如外傷性腦損傷。式I化合物也可用于治療和/或預(yù)防由T-細(xì)胞介導(dǎo)的急性或慢性炎性疾病或病癥或自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、I型或II型糖尿病以及與其有關(guān)的病癥、呼吸疾病如哮喘或炎性肺損傷、炎性肝損傷、炎性腎小球損傷、免疫學(xué)介導(dǎo)的病癥或疾病的皮膚表現(xiàn)、炎性和高增殖性皮膚疾病(如牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)接觸性皮炎、刺激性接觸性皮炎以及濕疹性皮炎、脂溢性皮炎)、炎性眼病如斯耶格倫綜合征、角膜結(jié)膜炎或葡萄膜炎、炎性腸病、局限性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎。對于上述用途，所要求的劑量當(dāng)然取決于施用的方式、待治療的具體病癥和所需效果而異。通常，約0.1至約100mg/kg體重的日劑量可系統(tǒng)地獲得滿意的效果。在較大的哺乳動物如人中，適用的日劑量約0.5mg至約2000mg，以不超過一日四次的分劑量或以延遲形式方便地施用。
式I化合物可以通過任何常規(guī)的途徑施用，尤其是經(jīng)腸，如口服，例如以片劑或膠囊的形式；或經(jīng)腸胃外，例如以注射溶液或混懸液形式；經(jīng)局部，例如以洗劑、凝膠劑、軟膏劑或乳膏劑形式，或以鼻用或栓劑形式。包含游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可以以常規(guī)方式、通過與可藥用載體或稀釋劑混合而制備。口服施用的單位劑型含有例如約0.1mg至約500mg的活性物質(zhì)。
局部施用例如用于皮膚。局部施用另外的形式是用于眼部。
式I化合物可以以游離形式或可藥用鹽形式施用，如上所述。這類鹽可以以常規(guī)方式制備，并呈現(xiàn)與游離化合物相同級別的活性。
根據(jù)前述內(nèi)容，本發(fā)明還提供1.1在需要這種治療的個體中預(yù)防或治療由T淋巴細(xì)胞和/或PKC介導(dǎo)的病癥或疾病(例如如上所示)的方法，該方法包括向所述個體施用有效量的式I化合物或其可藥用鹽；1.2在需要這種治療的個體中預(yù)防或治療急性或慢性移植排斥或由T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫疾病(例如如上所示)的方法，該方法包括向所述個體施用有效量的式I化合物或其可藥用鹽；2.用作藥物的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物，例如在1.1和1.2中所述的任何方法中。
3.藥物組合物，例如用于上述1.1和1.2的任何方法中的藥物組合物，包含游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及可藥用的稀釋劑或載體。
4.式I化合物或其可藥用鹽，用于制備用于上述1.1和1.2中任意方法中的藥物組合物。
式I化合物可作為唯一的活性成分或與免疫調(diào)節(jié)治療方案中的其他藥物或其他的抗炎劑一起施用，例如用于治療或預(yù)防同種或異種移植物急性或慢性排斥或炎性或自身免疫病癥。例如，它們可以與以下藥物聯(lián)合使用環(huán)孢菌素或子囊霉素或它們的免疫抑制類似物或衍生物，例如環(huán)孢菌素A、ISA Tx247、FK-506、ABT-281、ASM 981；mTOR抑制劑，例如雷帕霉素、40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578，或雷帕霉素類似物，例如AP23573、AP23464、AP23675、AP23841、TAFA-93、biolimus 7或biolimus 9等；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞歸巢性質(zhì)的EDG受體激動劑，例如FTY 720或其類似物；來氟洛米或其類似物；咪唑立賓；麥可酚酸或其鹽，例如鈉鹽；麥可酚酸嗎啉乙酯；15-脫氧精胍菌素或其類似物；免疫抑制單克隆抗體，例如對白細(xì)胞受體的單克隆抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD 11a/CD18、CD7、CD25、CD 27、B7、CD40、CD45、CD58、CD 137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或它們的配體，例如CD154；或其他免疫調(diào)節(jié)化合物，例如重組結(jié)合分子，其具有CTLA4或其突變體的至少部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，例如結(jié)合至非CTLA4蛋白質(zhì)序列如CTLA4Ig(例如指定的ATCC 68629)或其突變體如LEA29Y的CTLA4或其突變體的至少細(xì)胞外部分，或其他粘著分子抑制劑，例如mAbs，或低分子量抑制劑，包括LFA-1拮抗劑、選擇蛋白拮抗劑和VLA-4拮抗劑。式I化合物也可與抗增殖藥物共同施用，如用于癌癥治療的化療藥，包括但并不限于芳香酶抑制劑、抗雌激素劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑、微管活性劑、烷化劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、COX-2抑制劑、MMP抑制劑、mTOR抑制劑、抗腫瘤抗代謝物、鉑化合物、降低蛋白激酶活性的化合物以及抗血管生成的化合物、促性腺激素釋放因子激動劑、抗雄激素劑、bengamides、雙膦酸類、抗增殖抗體和替莫唑胺，或在糖尿病治療中與抗糖尿病藥物、胰島素促分泌素或胰島素分泌促進(jìn)劑一起使用，如磺酰脲，例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、4-氯-N-[(1-吡咯烷基氨基)羰基]-苯磺酰胺(glycopyramide)、格列苯脲(優(yōu)降糖)、格列齊特、1-丁基-3-間氨基苯磺酰脲、氨磺丁脲、格列波脲、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列丁唑、glibuzole、格列茚脲、格列嘧啶、氯磺氮脲、苯磺丁脲或甲苯基醋磺環(huán)己脲(tolylcyclamide)；口服促胰島素劑衍生物，例如短效胰島素增強劑，例如氯茴苯酸、瑞格列奈；苯基乙酸衍生物，例如納格列奈；DPP IV抑制劑，例如1-{2-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基氨基}乙?；?(2S)-氰基-吡咯烷二鹽酸鹽、LAF237、GLP-1或GLP-1激動劑類似物；或胰島素增敏劑，例如過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑(PPARγ)，例如格列酮(glitazone)、非格列酮類如N-(2-苯甲?；交?-L-酪氨酸類似物，例如GI-262570；或oxolidinedione，例如JTT501；雙重PPARγ/PPARα激動劑，例如DRF-554158、NC-2100或NN-622；類視色素X受體激動劑或rexinoid，例如2-[1-(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氫-2-萘基)-環(huán)丙基]-吡啶-5-羧酸、4-[(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氫-2-萘基)-2-羰基]-苯甲酸、9-順視黃酸或類似物、衍生物或其可藥用鹽。
5.如上所定義的方法，包括共同施用、例如同時(concomitantly)或依次施用治療有效量的PKC或T細(xì)胞活化和增殖抑制劑、例如游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及第二種藥物物質(zhì)，所述第二種藥物物質(zhì)為免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、抗增殖劑或抗糖尿病藥物，例如如上所述。
6.治療組合，例如藥盒，包含a)PKC或T細(xì)胞活化和增殖的抑制劑，例如游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物，和b)至少一種第二種活性劑，選自免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、抗增殖劑和抗糖尿病藥物。組分a)和組分b)可同時使用或依次使用。該藥盒可包括施用說明書。
當(dāng)PKC或T細(xì)胞活化和增殖抑制劑如式I化合物與其他免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、抗增殖劑或抗糖尿病治療聯(lián)合施用時，例如用于預(yù)防或治療以上指定的急性或慢性移植物排斥或炎性或自身免疫病癥時，共同施用的免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、抗增殖劑或抗糖尿病化合物的劑量當(dāng)然取決于所應(yīng)用的共同藥的類型，例如其是甾體還是環(huán)孢菌素；所應(yīng)用的特定藥物、所治療的病癥等等而變化。
式I化合物擁有令人關(guān)注的藥動學(xué)特性以及令人關(guān)注的體外和體內(nèi)活性。
權(quán)利要求
1.式I化合物 其中Ra為H；C1-4烷基；或被OH、NH2、NHC1-4烷基或N(二-C1-4烷基)2取代的C1-4烷基；Rb、Rc、Rd和Re之一為鹵素；C1-4烷氧基；或C1-4烷基；且其他三個取代基為氫；或Rb、Rd和Re全為氫；且R為式(a)的基團(tuán) 其中R1為-(CH2)n-NR3R4，其中R3和R4各自獨立地為H或C1-4烷基；或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)殘基；n為0、1或2；且R2為H；鹵素；C1-4烷基；CF3；OH；SH；NH2；NO2；C1-4烷氧基；C1-4烷硫基；NHC1-4烷基；N(二-C1-4烷基)2或CN；或其鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物或其鹽，其中Ra為H或甲基；Rb、Rc、Rd和Re之一為甲基或乙基，且其他三個取代基為H；或Rb、Rc、Rd和Re全為H；R2為H、Cl、甲基或NO2；n為1；且R3和R4各自獨立地為H、甲基、乙基或異丙基；或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其選自3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(2-氯-6-甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(6-氨基甲基-萘-1-基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(2-氯-6-甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(6-氨基甲基-萘-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；3-(6-氨基甲基-萘-1-基)-4-(7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；或其鹽。
4.用作藥物的根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物。
5.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物，以及可藥用的稀釋劑或載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物或根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防由T淋巴細(xì)胞和/或PKC介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物或根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性或慢性炎癥疾病或病癥、自身免疫疾病、移植物排斥、癌癥或感染性疾病。
8.藥物組合，包含根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的游離形式或可藥用鹽形式的化合物，以及進(jìn)一步的活性劑，選自免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、化療劑、抗增殖劑和抗糖尿病劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的式I化合物的制備方法，該方法包括使式II化合物 其中Ra、Rb、Rc、Rd和Re如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所定義，與式III化合物反應(yīng)，R-CH2-CO-NH2(III)其中R如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所定義，并且如有需要，適當(dāng)?shù)貙@得的游離形式的式I化合物轉(zhuǎn)化為鹽形式，或反之亦然。
10.在需要這種治療的個體中治療或預(yù)防由T淋巴細(xì)胞和/或PKC介導(dǎo)的病癥或疾病的方法，該方法包括向所述個體施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的化合物或其可藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了式I化合物，其中R、R
文檔編號C07D209/00GK1910174SQ200580002734
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日
發(fā)明者M·范艾斯, P·馮馬特, J·韋格納, J-P·埃弗努 申請人:諾瓦提斯公司