專利名稱：作為蛋白激酶抑制劑的化合物和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一類新的化合物、包含這類化合物的藥物組合物和使用這類化合物來治療或預(yù)防與激酶活性異?；蚴Э赜嘘P(guān)的疾病或紊亂、特別是涉及Abl、BCR-Abl、lck、SAPK2α、PDGF-R、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4激酶異常激活的疾病或紊亂的方法。
背景技術(shù)：
蛋白激酶代表一大家族蛋白質(zhì)，其在調(diào)節(jié)廣泛多樣的細胞過程和維持對細胞功能的控制方面起關(guān)鍵作用。這些激酶非限定性的部分列表包括受體酪氨酸激酶，例如血小板衍生生長因子受體激酶(PDGF-R)、TGFβ、VEGF-受體激酶(如KDR、Flt-1和Flt-4)、干細胞因子受體激酶、c-kit；非受體酪氨酸激酶，例如Abl和融合激酶BCR-Abl；以及絲氨酸/蘇氨酸激酶，例如p38、b-RAF和c-RAF。在許多疾病狀態(tài)中已經(jīng)觀察到異常的激酶活性，包括良性和惡性增殖性紊亂以及免疫和神經(jīng)系統(tǒng)不恰當?shù)募せ钜碌募膊　?br> 本發(fā)明的新化合物抑制一種或多種蛋白激酶的活性，因此被期望用于治療與激酶相關(guān)的疾病。
發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明提供了式I化合物及其N-氧化物衍生物、前藥衍生物、被保護的衍生物、單一異構(gòu)體及異構(gòu)體混合物，以及該化合物可藥用的鹽和溶劑化物(例如水合物)。
其中R1和R2獨立地選自氫、-XR3、-XC(O)R3、-XSR3、-XS(O)R3、-XS(O)2R3、-XOR4、-XNC(O)NHR3R4和-XOC(O)NR3R4；其中X是鍵或C1-4亞烷基；R4選自氫和C1-6烷基；R3選自C6-10芳基、C5-10雜芳基、C3-12環(huán)烷基和C3-8雜環(huán)烷基；其中R3的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基任選被1至3個選自羥基、鹵素、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷氧基、-XC(O)OR4和-NR4R5的基團取代；其中X是鍵或C1-4亞烷基且R4和R5獨立地選自氫和C1-6烷基；其中吡啶環(huán)A可以有至多3個-C＝基團替換為-N＝基團；其中萘環(huán)B可以有至多4個-C＝基團替換為-N＝基團。
在第二方面，本發(fā)明提供了含有式I化合物或N-氧化物衍生物、單一異構(gòu)體及其異構(gòu)體混合物或者它們的可藥用鹽以及一種或多種適宜賦形劑的藥物組合物。
在第三方面，本發(fā)明提供了治療動物的其中抑制激酶活性、特別是抑制Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4的活性可以預(yù)防、抑制或改善疾病的病理學和/或癥候?qū)W的疾病的方法，該方法包含給予動物治療有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、單一異構(gòu)體及其異構(gòu)體混合物或者它們的可藥用鹽。
在第四方面，本發(fā)明提供了式I化合物在制備藥物中的用途，所述的藥物用于在動物中治療其中激酶的活性、特別是Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4的活性促成該疾病的病理學和/或癥候?qū)W的疾病。
在第五方面，本發(fā)明提供了制備式I化合物及其N-氧化物衍生物、前藥衍生物、被保護的衍生物、單一異構(gòu)體及異構(gòu)體混合物以及它們的可藥用鹽的方法。
發(fā)明詳述定義“烷基”作為基團和作為其它基團(例如鹵素取代的烷基和烷氧基)的結(jié)構(gòu)元件，可以是直鏈的或支鏈的。C1-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等等。鹵素取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等等。
“芳基”表示含有六至十個環(huán)碳原子的單環(huán)或稠合雙環(huán)芳香環(huán)系。例如，芳基可以是苯基或萘基，優(yōu)選苯基。“亞芳基”表示衍生自芳基的二價基團?！半s芳基”被定義為其中一個或多個環(huán)成員為雜原子的芳基。例如雜芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、唑基、異唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“環(huán)烷基”表示含有指定數(shù)目環(huán)原子的飽和或部分不飽和的單環(huán)、稠合雙環(huán)或橋連多環(huán)系。例如，C3-10環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等?！半s環(huán)烷基”表示如本申請所定義的環(huán)烷基，條件是一個或多個指定的環(huán)原子被選自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的基團代替，其中R是氫、C1-4烷基或氮保護基。例如，被用于本申請來描述本發(fā)明化合物的C3-8雜環(huán)烷基包括嗎啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基(piperidinylone)、1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸-8-基等。
“鹵素”(或鹵代)優(yōu)選代表氯或氟，但還可能是溴或碘。
“治療”涉及減輕或緩解疾病和/或其伴隨癥狀的方法。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明提供了用于治療與激酶相關(guān)的疾病、特別是與Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4激酶相關(guān)的疾病的化合物、組合物和方法。例如，可以通過抑制Bcr-Abl的野生型和突變型來治療涉及BCR-Abl的白血病和其它增殖性紊亂。
在一項實施方案中，對于式I化合物，R1和R2獨立地選自氫、-XR3和-XOC(O)NR3R4；其中X是鍵或C1-4亞烷基；R4選自氫和C1-6烷基；R3選自C6-10芳基、C5-10雜芳基和C3-8雜環(huán)烷基；其中R3的任意芳基、雜芳基或雜環(huán)烷基任選被1至3個選自鹵素、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基、-XC(O)OR4和-NR4R5的基團取代；其中X是鍵或C1-4亞烷基且R4和R5獨立地選自氫和C1-6烷基。
在另一項實施方案中，R1選自氫和苯基；其中所述的苯基任選被1至3個選自三氟甲基、二甲基氨基、甲氧基、鹵素、乙氧基和硝基的基團取代。
在其它的實施方案中，R2選自氫、-OH和-OC(O)NHR4；其中R4選自苯基和苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基；其中所述R4的苯基任選被1至3個選自-C(O)OCH3和二甲基氨基的基團取代。
優(yōu)選的式I化合物選自苯基-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-3H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；4-(5-萘-1-基-2-苯基-3H-咪唑-4-基)-吡啶；4-[2-(3，5-雙三氟甲基苯基)-5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基]-吡啶；二甲基-[4-(4-萘-1-基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-苯基]-胺；4-[5-萘-1-基-2-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-[2-(2-氟苯基)-5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-[2-(2-乙氧基苯基)-5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-[5-萘-1-基-2-(3-硝基苯基)-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-(5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基)-吡啶；苯基-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-酚；4-[6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基氧羰基氨基]-苯甲酸甲基酯；苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；5-[6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基氧羰基氨基]-間苯二酸二甲基酯；(4-二甲基氨基苯基)-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；5-[8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基氧羰基氨基]-間苯二酸二甲基酯；及(4-二甲基氨基苯基)-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯。
其它優(yōu)選的式I化合物在下文實施例和表I中詳述。
藥理學和效用本發(fā)明的化合物調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸激酶的活性，照此可用于治療其中蛋白酪氨酸激酶、特別是Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4激酶促成該疾病病理學和/或癥候?qū)W的疾病或紊亂。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl，c-Abl)參與細胞周期的調(diào)控、對基因毒性應(yīng)激的細胞應(yīng)答，并通過整聯(lián)蛋白發(fā)信號來參與有關(guān)細胞環(huán)境的信息傳遞。大體上，Abl蛋白作為這樣一種細胞模塊來起復(fù)雜作用該細胞模塊整合多種胞外和胞內(nèi)來源的信號并影響關(guān)于細胞周期和凋亡的決定。Abelson酪氨酸激酶包括多種亞型衍生物，例如具有失控的酪氨酸激酶活性的嵌合融合體(癌蛋白)BCR-Abl或v-Abl。BCR-Abl在95％的慢性髓性白血病(CML)和10％的急性淋巴細胞白血病的發(fā)病機制中是重要的。STI-571(Gleevec)是致癌的BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制劑，用于治療慢性髓性白血病(CML)。但是，有些處于CML原始細胞危象期的患者由于BCR-Abl激酶的突變而對STI-571有耐受性。迄今為止，已報道了超過22種的突變體，最常見的是G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本發(fā)明的化合物抑制abl激酶、尤其是v-abl激酶。本發(fā)明的化合物還抑制野生型BCR-Abl激酶和BCR-Abl激酶的突變體，因此適于治療BCR-Abl陽性癌癥和腫瘤疾病，例如白血病(尤其是慢性髓性白血病和急性淋巴細胞白血病，其中尤其發(fā)現(xiàn)有細胞凋亡的作用機制)，它們還表現(xiàn)出對白血病干細胞亞群的作用以及在抽取上述細胞(例如抽取骨髓)后體外純化這些細胞和清除癌細胞后再移植這些細胞(例如經(jīng)純化骨髓細胞的再移植)的可能性。
PDGF(血小板衍生生長因子)是非常常見的生長因子，它在正常生長和病理細胞增殖中均起重要作用，例如致癌作用和在血管平滑肌細胞疾病中可見，例如動脈粥樣硬化和血栓形成。本發(fā)明的化合物能夠抑制PDGF受體(PDGFR)的活性，因此適于治療腫瘤疾病，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、前列腺腫瘤以及結(jié)腸、乳房、卵巢腫瘤。
本發(fā)明的化合物不僅可用作腫瘤抑制物(例如在小細胞肺癌中)，而且還可用作治療非惡性增殖紊亂(例如動脈粥樣硬化、血栓形成、牛皮癬、硬皮病、纖維變性)、保護干細胞(例如抵抗化療劑如5-氟尿嘧啶的血毒素作用)和治療哮喘的藥物。本發(fā)明的化合物尤其可用于治療對抑制PDGF受體激酶有響應(yīng)的疾病。
本發(fā)明的化合物在治療移植引起的紊亂中表現(xiàn)出有用效用，例如在同種異體移植、尤其是組織排斥中，例如尤其是閉塞性細支氣管炎(OB)，即同種異體肺移植的慢性排斥。與未患OB的人相比，OB患者的支氣管肺泡灌洗液中的PDGF濃度較高。
本發(fā)明的化合物還對與血管平滑肌細胞遷移和增殖相關(guān)的疾病(其中PDGF和PDGF-R通常也起作用)有效，例如再狹窄和動脈粥樣硬化。這類對血管平滑肌細胞增殖和遷移的體外和體內(nèi)作用及其結(jié)果可以通過本發(fā)明化合物的施用得到證明，還可通過觀察其對于體內(nèi)血管內(nèi)膜在機械損傷后的增厚的作用而得到證明。
本發(fā)明的化合物還抑制涉及干細胞因子(SCF，還已知是c-kit配體或青灰因子)的細胞過程，例如抑制SCR受體(kit)自磷酸化和SCF刺激的MAPK激酶(促分裂原活化蛋白激酶)的活化。MO7e細胞是人前巨核細胞白血病細胞系，其依賴SCF來增殖。本發(fā)明的化合物能抑制SCF受體的自磷酸化。
Ras-Raf-MEK-ERK信號通路介導(dǎo)了對于生長信號的細胞應(yīng)答。在約15％的人類癌癥中，Ras突變?yōu)橹掳┬问健af家族屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它包括三個成員，A-Raf、B-Raf、C-Raf(或Raf-1)。Raf作為藥物靶點的焦點集中于Raf作為Ras的下游效應(yīng)子的關(guān)系上。但是，近來的數(shù)據(jù)顯示，B-Raf可能在特定腫瘤的形成中具有重要地位，而不需要活化的Ras等位基因(Nature 417，949-954(2002年7月1日))。特別是已經(jīng)在很大比例的惡性黑素瘤中檢測出B-Raf突變體。
對黑素瘤的現(xiàn)有醫(yī)學治療效力有限，尤其是對于晚期黑素瘤而言。本發(fā)明的化合物還抑制涉及b-Raf激酶的細胞過程，提供了治療人類癌癥、尤其是黑素瘤的新的治療機會。
本發(fā)明的化合物還抑制涉及c-Raf激酶的細胞過程。c-Raf由ras癌基因活化，其在大量的人類癌癥中發(fā)生突變。因此，抑制c-Raf激酶活性能提供一條途徑來防止ras介導(dǎo)的腫瘤生長[Campbell，S.L，Oncogene，17，1395(1998)]。
本發(fā)明的化合物還抑制涉及KDR、Flt-1和Flt-4的細胞過程。大量與血管生成失控有關(guān)的疾病是已知的，例如由眼新生血管形成引起的疾病，尤其是視網(wǎng)膜病(糖尿病視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)性黃斑變性)；牛皮癬；成血管細胞瘤(haemangioblastomas)，例如“草莓斑”(＝血管瘤)；各種炎性疾病，例如關(guān)節(jié)炎、尤其是類風濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化和移植后發(fā)生的動脈粥樣硬化、子宮內(nèi)膜異位或慢性哮喘；以及尤其是腫瘤疾病(實體腫瘤，但還可以是白血病和其它液體腫瘤，因為許多原始血細胞和白血病細胞表達c-kit、KDR、Flt-1和Flt-4)。Flt-4在發(fā)育的淋巴管中表達。成人組織中僅有淋巴內(nèi)皮和一些高內(nèi)皮小靜脈表達Flt-4 mRNA，在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的淋巴竇中和淋巴管瘤中表達增強。通過抑制KDR的催化活性來抑制KDR介導(dǎo)的功能效應(yīng)被認為是治療包括癌癥在內(nèi)的血管生成性疾病的重要治療策略。
p38 MAPK的多種形式(α、β、γ、δ，每一種由單獨基因編碼)形成了細胞對多種刺激的應(yīng)答中涉及的激酶級聯(lián)的一部分，所述的刺激包括滲透性應(yīng)激、紫外線和細胞因子介導(dǎo)的事件。這四種p38同工型被認為調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號發(fā)生的不同方面。其活化是信號發(fā)生級聯(lián)事件的一部分，可引起合成和生成促炎細胞因子如TNFα。p38通過磷酸化包括其它激酶和轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的下游底物來發(fā)揮功能。抑制p38激酶的試劑已經(jīng)顯示其能阻斷細胞因子的產(chǎn)生，包括但不限于TNFα、IL-6、IL-8和IL-1β。外周血單核細胞(PBMCs)已經(jīng)顯示出當體外受到脂多糖(LPS)刺激時表達和分泌促炎細胞因子。在用LPS刺激之前對PBMCs用p38抑制劑進行預(yù)處理，該抑制劑可有效阻斷這種效應(yīng)。p38抑制劑在炎性疾病動物模型上是有效的。許多疾病狀態(tài)的破壞性作用是由促炎細胞因子的超量產(chǎn)生所引起的。p38抑制劑調(diào)節(jié)這種超量產(chǎn)生的能力使它們可用作疾病修飾藥物。
能阻斷p38功能的分子已經(jīng)被證明對抑制骨吸收、炎癥以及其它基于免疫和炎癥的病理狀態(tài)有效。因此，安全有效的p38抑制劑可以提供一條途徑來治療可通過調(diào)節(jié)p38發(fā)信號(例如RA)而得到調(diào)節(jié)的衰弱性疾病。因此，能抑制p38活性的本發(fā)明的化合物可用于治療炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、自身免疫疾病以及其它細胞因子介導(dǎo)的疾病。
轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)指包括例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的蛋白超家族，它們是細胞生長和分化、胚胎和骨骼發(fā)育、細胞外基質(zhì)構(gòu)建、造血作用、免疫和炎性應(yīng)答的多向性調(diào)節(jié)因子。TGFβ家族的成員啟動胞內(nèi)信號通路，最終引起調(diào)節(jié)細胞周期、控制增殖應(yīng)答或涉及胞外基質(zhì)蛋白的基因的表達，其中胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)外-內(nèi)細胞信號傳遞、細胞粘附、遷移和細胞通訊。因此，作為TGFβ胞內(nèi)信號通路抑制劑的本發(fā)明化合物可用于治療纖維增生性疾病，包括與TGFβ活性未受調(diào)節(jié)相關(guān)的腎臟紊亂和包括腎小球腎炎(GN)在內(nèi)的過度纖維化，例如腎小球系膜增生性GN、免疫性GN和新月體性GN。其它腎臟病癥包括糖尿病腎病、腎間質(zhì)纖維變性、接受環(huán)孢素治療的移植患者的腎纖維化，以及HIV相關(guān)性腎病。膠原血管紊亂包括進行性全身性硬化癥、多肌炎、硬皮病、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎、硬斑病，或隨雷諾氏綜合癥而發(fā)生的疾病。由TGFβ活性過度引起的肺纖維化包括成人呼吸窘迫綜合征、COPD、特發(fā)性肺纖維化以及通常伴有自身免疫疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和硬皮病、化學接觸或過敏)的間質(zhì)性肺纖維化。其它伴有纖維增生特點的自身免疫紊亂是類風濕性關(guān)節(jié)炎。纖維增生病癥可能與眼外科手術(shù)操作有關(guān)。這類操作包括伴以增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜再附著手術(shù)、內(nèi)障摘出聯(lián)合人工晶狀體植入和后青光眼引流手術(shù)(post glaucoma drainage surgery)。
根據(jù)前述，本發(fā)明還提供了在需要這類治療的受治療者中預(yù)防或治療上面所述的任何疾病或紊亂的方法，該方法包含對所述受治療者給予治療有效量的式I化合物或其可藥用鹽(見“給藥和藥物組合物”)。對于任何一種上述用途，所需劑量根據(jù)給藥方式、所治療的具體病癥和預(yù)期效果而變化。
給藥和藥物組合物一般而言，可以采用任何本領(lǐng)域眾所周知的常用和可接受的給藥方式(單獨或與一種或多種治療藥組合)來施用治療有效量的本發(fā)明化合物。治療有效量可根據(jù)疾病的嚴重性、受治療者的年齡和相關(guān)健康狀況、所用化合物的效力和其它因素而有較大改變。一般而言，以約0.03至2.5mg/kg體重的日劑量全身施用可獲得滿意的結(jié)果。大型哺乳動物(例如人類)的指示日劑量范圍為約0.5mg至約100mg，方便地以例如一天至多四次的分開劑量或以緩釋的形式施用。適于口服給藥的單位劑量形式包含約1mg至50mg活性成分。
本發(fā)明的化合物可以作為藥物組合物通過任何常規(guī)的途徑來給藥，具體而言，經(jīng)腸內(nèi)給藥，例如口服(如以片劑或膠囊形式)；或胃腸道外給藥，例如以注射用溶液或混懸液的形式；局部給藥，例如以洗液、凝膠、軟膏或乳膏劑的形式，或以經(jīng)鼻施用或栓劑的形式。包含游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物與至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可用常規(guī)的方式通過混合、制?；虬碌姆椒ㄟM行制備。例如，口服組合物可以是片劑或明膠膠囊，包含活性成分與a)稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘氨酸；b)潤滑劑，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣和/或聚乙二醇；對于片劑還包含c)粘合劑，例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果期望的話，還包含d)崩解劑，例如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽或泡騰合劑；和/或e)吸收劑、著色劑、矯味劑和甜味劑。注射用組合物可以是水性等張溶液或混懸液，栓劑可以由含脂肪的乳劑或混懸劑來制備。該組合物可以是無菌的和/或含有佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。此外，它們還可含有其它有治療價值的物質(zhì)。適于透皮應(yīng)用的制劑包含有效量的本發(fā)明化合物和載體。載體包含可吸收的藥理學可接受的溶劑以幫助穿過宿主皮膚。例如，透皮裝置是包含背襯膜、儲庫和確保裝置在皮膚上的手段的繃帶劑形式，其中儲庫含有化合物，任選含有載體，任選有控速屏障以在延長時間內(nèi)向宿主皮膚以控制可預(yù)定的速率傳送化合物。還可以使用基質(zhì)透皮制劑。適于局部應(yīng)用、例如用于皮膚和眼的制劑優(yōu)選是本領(lǐng)域眾所周知的水性溶液、軟膏、乳膏劑或凝膠。這些制劑可含有助溶劑、穩(wěn)定劑、張力增強劑、緩沖劑和防腐劑。
本發(fā)明的化合物可以以治療有效量與一種或多種治療劑組合(藥物組合物)施用。例如，與其它免疫調(diào)節(jié)或抗炎物質(zhì)組合可產(chǎn)生協(xié)同作用，例如當與以下藥物組合時環(huán)孢霉素、雷帕霉素或子囊霉素，或其免疫抑制類似物，例如環(huán)孢素A(CsA)、環(huán)孢素G、FK-506、雷帕霉素或相當?shù)幕衔?、皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、咪唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、來氟米特、咪唑立賓、麥考酚酸、麥考酚酸嗎乙酯、15-脫氧精胍菌素，免疫抑制抗體、尤其是白細胞受體的單克隆抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或它們的配體，或其它免疫調(diào)節(jié)化合物，例如CTLA41g。當本發(fā)明的化合物與其它療法組合施用時，共同給藥的化合物的劑量自然要取決于所共用藥物的類型、所用具體藥物以及所治療病癥等而變化。
本發(fā)明還提供了藥物組合，例如藥盒，包含a)第一種藥物，它是如本文所公開的游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物，和b)至少一種共用藥物。該藥盒可以包含其施用說明。
如本文所用的術(shù)語“共同施用”或“組合施用”等意欲囊括對單獨患者施用所選擇的治療藥物，并且意欲包括其中藥物不一定以同一施用途徑或在同一時間施用的治療方案。
如本文所用的術(shù)語“藥物組合”指將多于一種活性成分混合或合并所得的產(chǎn)品，包括活性成分的固定和非固定組合。術(shù)語“固定組合”指活性成分，例如式I化合物和共用藥物，以單一實體或劑量同時施用于患者。術(shù)語“非固定組合”指活性成分，例如式I化合物和共用藥物，以單獨的實體同時、共同或無特定時間限制地依次施用于患者，其中這種施用為患者體內(nèi)提供了兩種化合物的治療有效水平。后者還用于雞尾酒療法，例如給予3種或3種以上的活性成分。
制備本發(fā)明化合物的方法本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的制備方法。在所述反應(yīng)中，有必要保護在終產(chǎn)物中期望存在的官能團，例如羥基、氨基、亞氨基、硫代或羧基，從而避免它們不被期望地參與反應(yīng)。常規(guī)的保護基團可以按照標準慣例來使用，例如參見T.W.Greene和P.G.M.Wuts的“有機化學中的保護基團”(Protective Groups in Organic Chemistry，John Wiley and Sons，1991)。
式I化合物可以通過如下反應(yīng)流程圖I來制備反應(yīng)流程圖I 其中，A、B、R1和R2如發(fā)明概述中式I所定義。
本發(fā)明的化合物(式I)可以通過使式2化合物與式3化合物在適宜反應(yīng)物(如乙酸銨等)和適宜溶劑(如乙酸等)的存在下反應(yīng)來制備。該反應(yīng)在100℃至140℃下進行，反應(yīng)至多24小時以完成反應(yīng)。下文實施例中給出了式I化合物合成的詳細描述。
制造本發(fā)明化合物的其它方法本發(fā)明化合物的可藥用酸加成鹽可以通過使化合物的游離堿形式與可藥用的無機或有機酸反應(yīng)來制備?；蛘?，本發(fā)明化合物的可藥用堿加成鹽可以通過使化合物的游離酸形式與可藥用的無機或有機堿反應(yīng)來制備?；蛘撸景l(fā)明化合物的鹽形式可以使用起始原料或中間體的鹽來制備。
本發(fā)明化合物的游離酸或游離堿形式可以分別由相應(yīng)的堿加成鹽或酸加成鹽來制備。例如酸加成鹽形式的本發(fā)明化合物可以通過用適宜的堿(如氫氧化銨溶液、氫氧化鈉等等)處理轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的游離堿。堿加成鹽形式的本發(fā)明化合物可以通過用適宜的酸(如鹽酸等)處理轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的游離酸。
未氧化形式的本發(fā)明化合物可以由本發(fā)明化合物的N-氧化物在0℃至80℃下在適宜惰性有機溶劑(如乙腈、乙醇、二烷水溶液等)中通過用還原劑(如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氫化鋰、硼氫化鈉、三氯化磷、三溴化磷等等)處理來制備。
本發(fā)明化合物的前藥衍生物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來制備(如，進一步的細節(jié)參見Saulnier等人，(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，第4卷，第1985頁)。例如，適當?shù)那八幙梢酝ㄟ^使非衍生化的本發(fā)明化合物與適宜的氨甲?；瘎?如1，1-酰氧基烷基carbanochloridate、對硝基苯基碳酸酯等)反應(yīng)來制備。
本發(fā)明化合物的受保護衍生物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來制備?？捎糜诮⒈Ｗo基團以及除去它們的技術(shù)的詳細描述可參見T.W.Greene的“Protecting Groups in Organic Chemistry”(第三版，JohnWiley and Sons，Inc.，1999)。
在本發(fā)明的方法中可以方便地制備或形成本發(fā)明化合物的溶劑化物(如水合物)。本發(fā)明化合物的水合物可通過采用有機溶劑如二氧芑、四氫呋喃和甲醇在水/有機溶劑混合物中重結(jié)晶來方便地制備。
還可如下制備本發(fā)明化合物的單一立體異構(gòu)體使化合物的外消旋混合物與旋光活性的拆分試劑反應(yīng)，形成一對非對映異構(gòu)化合物，拆分該非對映異構(gòu)體并回收旋光純的對映體。當對映體的拆分采用本發(fā)明化合物的共價非對映異構(gòu)衍生物進行時，優(yōu)選可解離的復(fù)合物(如非對映異構(gòu)的鹽結(jié)晶)。非對映異構(gòu)體具有不同的物理性質(zhì)(如熔點、沸點、溶解性、反應(yīng)活性等)，可以利用這些不同點來容易地加以分離。非對映異構(gòu)體可以通過色譜法來分離，或優(yōu)選通過基于溶解性不同的分離/拆分技術(shù)來分離。然后通過任何不會導(dǎo)致外消旋化的實用方法，回收旋光純的對映體和拆分試劑?？捎糜趶幕衔锏耐庀旌衔镏胁鸱制淞Ⅲw異構(gòu)體的技術(shù)在JeanJacques、Andre Collet和Samuel H.Wilen的“Enantiomers，Racemates andResolutions”(John Wiley and Sons，Inc.，1981)中有更詳細的描述。
總的來說，式I化合物可以通過包括以下步驟的方法來制備(a)反應(yīng)流程圖I的步驟；及
(b)任選將本發(fā)明的化合物轉(zhuǎn)化為可藥用鹽；(c)任選將本發(fā)明化合物的鹽形式轉(zhuǎn)化為非鹽形式；(d)任選將本發(fā)明化合物的非氧化形式轉(zhuǎn)化為可藥用的N-氧化物；(e)任選將本發(fā)明化合物的N-氧化物形式轉(zhuǎn)化為其非氧化形式。
(f)任選從異構(gòu)體混合物中拆分出本發(fā)明化合物的單一異構(gòu)體；(g)任選將非衍生化的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為可藥用的前藥衍生物；和(h)任選將本發(fā)明化合物的前藥衍生物轉(zhuǎn)化為其非衍生化形式。
關(guān)于起始原料的生產(chǎn)沒有具體描述，這些化合物是已知的，或者可類似于本領(lǐng)域公知的方法或在下文實施例中公開的方法來制備。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解上述轉(zhuǎn)化僅僅是本發(fā)明化合物的制備方法的代表性方法，也可類似地使用其它熟知的方法。
實施例本發(fā)明還通過下列闡述本發(fā)明的式I化合物的制備的實施例進一步被例證，但不局限于此。
實施例I苯基-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-3H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯 將8-氨基-2-萘酚(14.63g，91.9mmol)和二碳酸二叔丁基酯(21.0g，96.2mmol)在二氯甲烷(200mL)和四氫呋喃(200mL)中的混合物于回流狀態(tài)攪拌24小時。然后將該混合物冷卻至環(huán)境溫度，過濾，濾液濃縮至干。進行硅膠色譜法(CH2Cl2/EtOEt＝5/95至10/90)，得到(7-羥基-萘-1-基)-氨基甲酸叔丁酯(21.50g，產(chǎn)率90％)；MS m/z(M+Na+)282.05。
向(7-羥基-萘-1-基)-氨基甲酸叔丁酯(5.11g，19.7mmol)和碳酸鉀(3.26g，23.6mmol)在N，N-二甲基甲酰胺中的混合物中緩慢加入芐基溴(3mL，4.31g，25.2mmol)。然后將該混合物在室溫下攪拌過夜，傾入冰水(150mL)中。所得混合物用乙酸乙酯(4×100mL)萃取，合并有機部分，用水和鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，濃縮，經(jīng)硅膠色譜法(己烷/乙酸乙酯＝15/1)純化，得到(7-芐氧基-萘-1-基)-氨基甲酸叔丁酯(5.93g，86.3％)；1H NMR 400Hz(CDCl3)δ1.60(s，9H)，5.22(s，2H)，6.63(br，1H)，7.27(m，2H)，7.38(m，2H)，7.45(m，2H)，7.44(d，J＝7.44Hz，2H)，7.61(d，J＝8.11Hz，1H)，7.80(m，2H)；MS m/z(M+Na+)372.10。
向(7-芐氧基-萘-1-基)-氨基甲酸叔丁酯(9.89g，28.3mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液中加入三氟乙酸(50mL，73g，649mmol)，混合物在室溫下攪拌30分鐘。減壓蒸發(fā)溶劑和過量的三氟乙酸，粗產(chǎn)物在高真空下干燥過夜，所得7-芐氧基-萘-1-基胺(6.98g，99％)未經(jīng)進一步純化用于下一步驟。
將7-芐氧基-萘-1-基胺(6.98g，28.02mmol)在濃鹽酸(30mL)、水(30mL)和四氫呋喃(30mL)中的溶液用冰-鹽(氯化鈉)浴冷卻。然后歷經(jīng)15分鐘滴加亞硝酸鈉(2.32g，33.6mmol)的水(20mL)溶液，反應(yīng)物溫度保持在5℃以下。將混合物另外攪拌30分鐘，然后加入碘化鉀(9.3g，56.04mmol)的水(30mL)溶液。將所得混合物于室溫攪拌3小時，然后用乙酸乙酯萃取，用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，經(jīng)硅膠色譜法(己烷/CH2Cl2＝25/1-20/1)純化，得到7-芐氧基-1-碘萘(6.26g，61％)；MS m/z(M+Na+)361.00。
在氮氣氛和-78℃，向7-芐氧基-1-碘萘(4.60g，12.77mmol)的乙醚(120mL)溶液中加入1.7M叔丁基鋰的戊烷溶液(8.26mL，14.0mmol)，并將所得混合物攪拌1小時，同時溫熱至5℃。將混合物再次冷卻至-78℃，然后加入四甲基乙二胺(1.93mL，1.49g，12.79mmol)。將混合物攪拌10分鐘，加入N，N-二甲基甲酰胺(0.99mL，0.93g，12.78mmol)。將混合物逐漸溫熱至室溫并攪拌過夜。向反應(yīng)混合物中加入乙酸乙酯，用飽和氯化銨溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜法(己烷/EtOAc＝20/1)純化，得到7-芐氧基-萘-1-甲醛(1.95g，產(chǎn)率58.3％)；1H NMR 400Hz(CDCl3)δ5.27(s，2H)，7.33(m，2H)，7.42(m，2H)，7.52(m，3H)，7.83(d，J＝8.98Hz，1H)，7.95(d，J＝7.11Hz，1H)，8.03(d，J＝8.10Hz，1H)，10.32(s，1H)；MS m/z(M+H+)263.05。
在氮氣氛和-50℃，歷經(jīng)5分鐘向4-(叔丁基-二甲基-甲硅烷氧基甲基)-吡啶(1.59g，7.09mmol)的四氫呋喃(40mL)溶液中加入2M二異丙基氨基化鋰的己烷溶液(3.55mL，7.11mmol)。將混合物于-40℃攪拌1小時，然后歷經(jīng)10分鐘加入7-芐氧基-萘-1-甲醛(1.69g，6.45mmol)的四氫呋喃(20mL)溶液。將反應(yīng)物逐漸溫熱至室溫并在該溫度下攪拌過夜，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)物，用乙酸乙酯萃取。合并有機層，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。進行硅膠色譜法(己烷/EtOAc＝2/1-1/1)，得到1-(7-芐氧基-萘-1-基)-2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-吡啶-4-基-乙醇(3.85g，產(chǎn)率89％)；MS m/z(M+H+)486.20。
向1-(7-芐氧基-萘-1-基)-2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-吡啶-4-基-乙醇(3.75g，7.72mmol)的四氫呋喃(60mL)溶液中加入1.0M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(10Ml，10mmol)，將該混合物于室溫攪拌1小時。濃縮混合物，向殘余物中加入乙酸乙酯。溶液用水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并高真空干燥。所得二醇未經(jīng)進一步純化用于下面的氧化反應(yīng)。
將二甲基亞砜(1.64mL，1.81g，23.1mmol)和無水二氯甲烷(100mL)的混合物冷卻至-70℃，逐滴加入草酰氯(2.0mL，2.94g，23.1mmol)。將混合物在此溫度攪拌15分鐘，逐滴加入上述二醇在二氯甲烷(40mL)和二甲基亞砜(10mL)中的溶液。將混合物于-60℃攪拌2小時，然后加入三乙胺(6.45mL，4.68g，46.3mmol)。將反應(yīng)混合物逐漸溫熱至室溫并攪拌過夜。然后向該混合物中加入水，分離有機層，用水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜法(己烷/EtOAc＝3/1-2/1)純化，得到1-(7-芐氧基-萘-1-基)-2-吡啶-4-基-乙烷-1，2-二酮(2.26g，產(chǎn)率79.7％)；1HNMR 400Hz(CDCl3)δ5.31(s，2H)，7.40(m，5H)，7.55(d，J＝7.30Hz，2H)，7.81(dd，J＝1.66，4.42Hz，2H)，7.87(m，2H)，8.10(d，J＝8.08Hz，1H)，8.89(dd，J＝1.55，4.48Hz，2H)，8.93(d，J＝2.48Hz，1H)；MS m/z(M+H+)368.20。
將1-(7-芐氧基-萘-1-基)-2-吡啶-4-基-乙烷-1，2-二酮(576mg，1.57mmol)、苯甲醛(0.2mL，0.21g，1.98mmol)和醋酸銨(1.21g，15.7mmol)在乙酸(15mL)中的混合物于120℃攪拌過夜。然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，傾入冰冷的氫氧化銨溶液中，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。合并有機萃取液，用硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。粗產(chǎn)物進行硅膠色譜法(CH2Cl2/EtOAc＝2/1)，得到4-[5-(7-芐氧基-萘-1-基)-2-苯基-1H-咪唑-4-基]-吡啶(700mg，產(chǎn)率98％)；1H NMR 400Hz(DMSO)δ3.30(s，2H)，6.99(s，1H)，7.21(m，5H)，7.24(m，3H)，7.43(t，J＝7.31Hz，1H)，7.52(t，J＝7.37Hz，3H)，7.66(m，1H)，8.00(m，2H)，8.13(d，J＝7.30Hz，2H)，8.32(d，J＝4.43Hz，2H)；MS m/z(M+H+)454.20。
向4-[5-(7-芐氧基-萘-1-基)-2-苯基-1H-咪唑-4-基]-吡啶(810mg，1.79mmol)在甲醇(50mL)和四氫呋喃(10mL)中的溶液中加入10％Pd/C(100mg)，將混合物在氫氣氛(1atm)中攪拌3小時。濾去催化劑并用乙酸乙酯洗滌。濃縮濾液，進行硅膠色譜法(CH2Cl2/EtOAc＝1/1)，得到糖漿狀的8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-3H-咪唑-4-基)-萘-2-酚(520mg，產(chǎn)率80％)；1H NMR 400Hz(CD3OD)δ6.89(d，J＝2.32Hz，1H)，7.17(dd，J＝2.38，8.89Hz，1H)，7.48(dd，J＝7.15，8.21Hz，1H)，7.55(m，3H)，7.66(dd，J＝1.09，7.04Hz，1H)，7.91(d，J＝8.93Hz，1H)，7.95(d，J＝7.03HZ，3H)，8.04(d，J＝8.24Hz，1H)，8.10(m，2H)，8.47(d，J＝7.02Hz，2H)；MSm/z(M+H+)364.20。
將8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-3H-咪唑-4-基)-萘-2-酚(31mg，0.085mmol)、異氰酸苯酯(11mg，0.094mmol)和三乙胺(17.8μl，12.9mg，0.128mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中的混合物于室溫攪拌2小時。進行制備型LCMS，得到苯基-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-3H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯(17mg，產(chǎn)率41％)；1H NMR 400Hz(CD3OD)δ7.01(m，2H)，7.25(m，4H)，7.39(m，5H)，7.45(dd，J＝2.28，8.86Hz，1H)，7.53(m，3H)，7.72(dd，J＝7.14，8.23Hz，1H)，7.83(d，J＝6.02Hz，1H)，7.90(d，J＝6.99Hz，2H)，8.10(m，3H)，8.19(d，J＝8.29Hz，1H)，8.43(d，J＝7.00Hz，2H)；MS m/z(M+H+)483.20。
重復(fù)以上實施例中所描述的操作，使用合適的起始原料，獲得如表1中所確定的下列式I化合物。
表1





分析對本發(fā)明的化合物進行分析，以測定它們與親本32D細胞相比選擇性抑制表達BCR-Abl的32D細胞(32D-p210)增殖的能力。測試選擇性抑制這些BCR-Abl轉(zhuǎn)化細胞增殖的化合物對表達野生型或突變形式的BCR-Abl的Ba/F3細胞的抗增殖能力。此外，對化合物進行分析以測定其抑制b-Raf的能力。
BCR-Abl依賴性細胞增殖的抑制(高流通量法)
所用鼠細胞系是用BCR-Abl cDNA轉(zhuǎn)化的32D造血祖細胞系(32D-p210)。這些細胞維持在補充有50μg/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和200mM L-谷氨酰胺的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。未經(jīng)轉(zhuǎn)化的32D細胞添加15％WEHI條件培養(yǎng)基作為IL-3來源而類似地維持。
將50μl 32D或32D-p210細胞懸浮液鋪在Greiner 384孔微板中，密度為5000個細胞/孔。每孔(包括作為陽性對照的STI571)加入50μl測試化合物(1mM，DMSO儲備液)。細胞在37℃、5％二氧化碳條件下孵育72小時。每孔加入10μl 60％Alamar Blue溶液(Tek diagnostics)，細胞另外孵育24小時。使用AcquestTM系統(tǒng)(Molecular Devices)對熒光強度(激發(fā)波長530nm，發(fā)射波長580nm)進行定量。
BCR-Abl依賴性細胞增殖的抑制將32D-p210細胞鋪在96孔TC板中，密度為15000個細胞/每孔。每孔(包括作為陽性對照的STI571)加入50μl測試化合物的二倍連續(xù)稀釋液(Cmax為40μM)。細胞在37℃、5％二氧化碳條件下孵育48小時后，每孔加入15μl MTT(Promega)，細胞另外孵育5小時。采用分光光度法對570nm處的光密度進行定量，IC50值，即50％抑制所需的化合物濃度，由劑量-反應(yīng)曲線確定。
對細胞周期分布的作用將32D或32D-p210細胞鋪在6孔TC板中，每孔5ml培養(yǎng)基、2.5×106個細胞，加入1或10μM測試化合物(包括作為對照的STI571)。繼而將細胞在37℃、5％二氧化碳條件下孵育24或48小時。取2ml細胞混懸液用PBS洗滌，在70％乙醇中固定1小時，并用PBS/EDTA/RNase A處理30分鐘。加入碘化丙啶(Cf＝10μg/ml)，使用FACScaliburTM系統(tǒng)(BDBiosciences)以流式細胞法對熒光強度進行定量。本發(fā)明的測試化合物證明對32D-p210細胞有凋亡作用，但不誘導(dǎo)32D親本細胞凋亡。
對細胞BCR-Abl自磷酸化的作用BCR-Abl自磷酸化使用c-abl特異性捕獲抗體和抗磷酸酪氨酸抗體通過捕獲ELISA進行定量。將32D-p210細胞鋪在96孔TC板中，每孔2×105個細胞、50μl培養(yǎng)基。每孔(包括作為陽性對照的STI571)加入50μl測試化合物的兩倍連續(xù)稀釋液(Cmax為10μM)。細胞在37℃、5％二氧化碳條件下孵育90分鐘。繼而將細胞用150μl含有蛋白水解酶和磷酸酶抑制劑的溶解緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，1mMEGTA和1％NP-40)在冰上處理1小時。將50μl細胞溶解物加入預(yù)先涂有抗abl特異性抗體并封閉的96孔optiplate中。將板在4℃孵育4小時。用TBS-吐溫20緩沖液洗滌后，加入50μl堿性磷酸酶結(jié)合的抗磷酸酪氨酸抗體，將板進一步在4℃孵育過夜。用TBS-吐溫20緩沖液洗滌后，加入90μl發(fā)光底物，采用AcquestTM系統(tǒng)(Molecular Devices)對發(fā)光強度進行定量。本發(fā)明的抑制表達BCR-Abl的細胞增殖的測試化合物以劑量依賴的方式抑制細胞BCR-Abl自磷酸化。
對表達BCR-Abl突變形式的細胞的增殖的作用測試本發(fā)明化合物對表達野生型或突變形式的BCR-Abl(G250E、E225V、T315I、F317L、M351T)(使得對STI571耐藥或敏感性較低)的Ba/F3細胞的抗增殖作用。如上所述(在不含IL3的培養(yǎng)基中)，在10、3.3、1.1和0.37μM濃度測試這些化合物對表達BCR-Abl突變體的細胞和對未轉(zhuǎn)化細胞的抗增殖作用。從如上所述獲得的劑量-反應(yīng)曲線，確定了無毒性化合物對未轉(zhuǎn)化細胞的IC50值。
b-Raf測試本發(fā)明的化合物抑制b-Raf活性的能力。該試驗在黑壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中進行。底物IκBα以DPBS稀釋(1∶750)，每孔加入15μl稀釋液。將板于4℃孵育過夜，采用EMBLA板洗滌器以TBST(25mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl和0.05％Tween-20)洗滌3次。將板用Superblock(15μl/孔)于室溫封閉3小時，以TBST洗滌3次并拍干。每孔加入含有20μM ATP的分析緩沖液(10μl)，然后加入100μl或500μl的化合物。將B-Raf用分析緩沖液稀釋(1μl加入25μl)，每孔加入10μl稀釋的b-Raf(0.4μg/孔)。將板于室溫孵育2.5小時。用TBST洗滌板6次，終止激酶反應(yīng)。將磷酸化IκBα(Ser32/36)抗體用Superblock稀釋(1∶10000)，每孔加入15μl。將板于4℃孵育過夜，用TBST洗滌6次。將AP-結(jié)合的山羊抗鼠IgG用Superblock稀釋(1∶1500)，每孔加入15μl。將板于室溫孵育1小時。用TBST洗滌6次。每孔加入15μl Attophos AP底物，并將板于室溫孵育15分鐘。在Acquest或Analyst GT上使用熒光強度NanxinBBT陰離子(505分色鏡)讀板。
Upstate KinaseProfilerTM-放射酶濾膜結(jié)合分析評價本發(fā)明的化合物抑制一組激酶(該激酶的非限定性部分名單包括Abl、BCR-Abl、EGF-R、c-erbB2激酶(HER-2)、PDGF-R、lck、SAPK2a、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4)中單個成員的能力。按這類方案以終濃度為10μM對化合物進行測試，一式兩份。注意，激酶緩沖組合物和底物對于“Upstate KinaseProfilerTM”名單中所包括的不同激酶是不同的。在冰上，將激酶緩沖液(2.5μl，10×，需要時含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01單位；2.5μL)、在激酶緩沖液中的特異性或聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.1mg/ml)以及激酶緩沖液(50μM；5μl)在eppendorf管中混合。加入Mg/ATP混合液(10μL；67.5(或33.75)mMMgCl2，450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol))，反應(yīng)物在30℃孵育約10分鐘。將反應(yīng)混合物在2cm×2cm P81(磷酸纖維素，用于帶正電荷的肽底物)或Whatman 1號(用于聚(Glu4-Tyr)肽底物)的正方形紙上點樣。用于分析的正方形紙用0.75％磷酸洗滌4次，每次5分鐘，并用丙酮沖洗一次(5分鐘)。將正方形紙移入閃爍小瓶中，加入5ml閃爍合劑，摻入肽底物的32P(cpm)用Beckman閃爍計數(shù)器進行定量。計算每個反應(yīng)的抑制百分率。
游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物顯示出有價值的藥理性質(zhì)，例如在本申請中所描述的體外試驗所顯示的那樣。例如，對于野生型BCR-Abl和b-Raf，優(yōu)選式I化合物的IC50為1×10-10M至1×10-5M，優(yōu)選低于500nM。例如，6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-酚(化合物11)和(4-二甲基氨基-苯基)-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯(化合物15)對抗b-Raf的IC50分別為300nM和879nM。
式I化合物以10μM濃度對抗Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和/或FLT4激酶時，優(yōu)選抑制百分率高于50％，優(yōu)選高于70％。例如6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-酚(化合物11)以10μM濃度抑制下列激酶時的百分率為(百分率在括號中表示，例如100％指完全抑制，0％指無抑制)Abl(98％)；c-RAF(98％)；Lck(61％)和SAPK2α(74％)。
應(yīng)當理解，本文所述的實施例和實施方案僅僅用于解釋說明的目的，它們的各種變通或變化方法將提示給本領(lǐng)域技術(shù)人員，并且被包括在本申請的宗旨和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請引入本文作為所有目的的參考。
權(quán)利要求
1.式I化合物及其可藥用的鹽、水合物、溶劑化物及其異構(gòu)體， 其中R1和R2獨立地選自氫、-XR3、-XC(O)R3、-XSR3、-XS(O)R3、-XS(O)2R3、-XOR4、-XNC(O)NHR3R4和-XOC(O)NR3R4；其中X是鍵或C1-4亞烷基；R4選自氫和C1-6烷基；R3選自C6-10芳基、C5-10雜芳基、C3-12環(huán)烷基和C3-8雜環(huán)烷基；其中R3的任意芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基任選被1至3個選自羥基、鹵素、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基、鹵素取代的C1-6烷氧基、-XC(O)OR4和-NR4R5的基團取代；其中X是鍵或C1-4亞烷基且R4和R5獨立地選自氫和C1-6烷基；其中吡啶環(huán)A可以有至多3個-C＝基團替換為-N＝基團；其中萘環(huán)B可以有至多4個-C＝基團替換為-N＝基團。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R2獨立地選自氫、-XR3和-XOC(O)NR3R4；其中X是鍵或C1-4亞烷基；R4選自氫和C1-6烷基；R3選自C6-10芳基、C5-10雜芳基和C3-8雜環(huán)烷基；其中R3的任意芳基、雜芳基或雜環(huán)烷基任選被1至3個選自鹵素、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基、-XC(O)OR4和-NR4R5的基團取代；其中X是鍵或C1-4亞烷基且R4和R5獨立地選自氫和C1-6烷基。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R1選自氫和苯基；其中所述的苯基任選被1至3個選自三氟甲基、二甲基氨基、甲氧基、鹵素、乙氧基和硝基的基團取代。
4.權(quán)利要求2的化合物，其中R2選自氫、-OH和-OC(O)NHR4；其中R4選自苯基和苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基；其中所述R4的苯基任選被1至3個選自-C(O)OCH3和二甲基氨基的基團取代。
5.權(quán)利要求1的化合物，選自苯基-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-3H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；4-(5-萘-1-基-2-苯基-3H-咪唑-4-基)-吡啶；4-[2-(3，5-雙三氟甲基苯基)-5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基]-吡啶；二甲基-[4-(4-萘-1-基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-苯基]-胺；4-[5-萘-1-基-2-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-[2-(2-氟苯基)-5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-[2-(2-乙氧基苯基)-5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-[5-萘-1-基-2-(3-硝基苯基)-3H-咪唑-4-基]-吡啶；4-(5-萘-1-基-3H-咪唑-4-基)-吡啶；苯基-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-酚；4-[6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基氧羰基氨基]-苯甲酸甲基酯；苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；5-[6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基氧羰基氨基]-間苯二酸二甲基酯；(4-二甲基氨基苯基)-氨基甲酸6-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯；5-[8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基氧羰基氨基]-間苯二酸二甲基酯；及(4-二甲基氨基苯基)-氨基甲酸8-(2-苯基-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基)-萘-2-基酯。
6.藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1的化合物和可藥用的賦形劑。
7.治療動物的其中抑制激酶活性可預(yù)防、抑制或改善該疾病的病理學和/或癥候?qū)W的疾病的方法，該方法包括給予所述動物治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的激酶選自Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4。
9.權(quán)利要求1的化合物在制備藥物中的用途，所述的藥物用于在動物中治療其中激酶Abl、BCR-Abl、PDGF-R、lck、SAPK2α、p38、TGFβ、KDR、c-Kit、b-RAF、c-RAF、FLT1和FLT4的活性促成該疾病的病理學和/或癥候?qū)W的疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的化合物、包含這類化合物的藥物組合物和使用這類化合物來治療或預(yù)防與激酶活性異常或失控有關(guān)的疾病或紊亂、特別是涉及Abl、BCR－Abl、lck、SAPK2α、PDGF－R、p38、TGFβ、KDR、c－Kit、b－RAF、c－RAF、FLT1和FLT4激酶異常激活的疾病或紊亂的方法。
文檔編號C07D405/14GK1860111SQ200480028510
公開日2006年11月8日 申請日期2004年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者N·S·格雷, 江吉慶, 劉異, R·斯廷斯瑪 申請人:Irm責任有限公司