專利名稱：含有新的美登素類的改進的細胞毒劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備含有美登素類(maytansinoids)和細胞結(jié)合劑(cell-binding agents)的改良的細胞毒性偶聯(lián)物(conjugates)的方法。這些偶聯(lián)物在以靶向方式被傳送至特定的細胞群時，具有治療作用。本發(fā)明也涉及制備具有硫醇部分(thiol moiety)的美登素類的方法，其可以被用于制備細胞毒性偶聯(lián)物。本發(fā)明進一步涉及新的美登素類，以及新的美登素類的合成中的新的中間產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
有許多報道試圖于用單克隆抗體-藥物偶聯(lián)物特異性地靶向于腫瘤細胞(Sela et al.，Immunoconjugates 189-216(C.Vogel，ed.1987)；Ghose et al，Targeted Drugs 1-22(E.Goldberg，ed.1983)；Diener et al，Antibody Mediated Delivery Systems 1-23(J.Rodwell，ed.1988)；Pieterszet al，Antibody Mediated Delivery Systems 25-53(J.Rodwell，ed.1988)；Bumol et al，Antibody Mediated Delivery Systems 55-79(J.Rodwell，ed.1988)。細胞毒性藥物諸如甲氨蝶呤、柔紅霉素、阿霉素、長春新堿、長春花堿、美法侖、絲裂霉素C和苯丁酸氮芥已被連接于各種鼠科單克隆抗體。在一些情形下，藥物分子通過中間載體分子被連接于抗體分子，所述的中間載體分子如血清白蛋白(Garnett et al.Cancer Res.462407-2412(1986)；Ohkawa et al.Cancer Immunol.Immunother.2381-86(1986)；Endo et al.Cancer Res.471076-1080(1980))、右旋糖苷(Hurwitz et al.Appl.Biochem.225-35(1980)；Manabi et al.Biochem.Pharmacol.34289-291(1985)；Dillman et al.Cancer Res.464886-4891(1986)；Shoval et al.Proc.Natl.Acad.Sci.858276-8280(1988))，或聚谷氨酸(Tsukada et al.J Natl.Canc.Inst.73721-729(1984)；Kato et al.J.Med.Chem.271602-1607(1984)；Tsukada et al.Br.J.Cancer 52111-116(1985))。
各種接頭(linker)技術(shù)已被用于制備這樣的免疫偶聯(lián)物，并研究了可切割的接頭和不可切割的接頭。然而，在大多數(shù)情況下，僅在藥物分子可以在靶位點以未被修飾的方式從偶聯(lián)物上被釋放時，才觀察到藥物的完整的細胞毒性潛能。
已被用于制備抗體-藥物偶聯(lián)物的可切割接頭中的一種是，基于順烏頭酸的酸不穩(wěn)定性接頭，其利用了不同的細胞內(nèi)區(qū)室的酸性環(huán)境，例如在受體介導(dǎo)的胞吞作用期間遇到的內(nèi)體和溶酶體。Shen和Ryser將此方法引入以制備柔紅霉素和大分子載體的偶聯(lián)物(Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048-1054(1981))。Yang和Reisfeld用同樣的技術(shù)將柔紅霉素連接于抗黑素瘤抗體(J.Natl.Canc.Inst.801154-1159(1988))。最近，Dillman等人也以相似的方式應(yīng)用酸不穩(wěn)定性接頭來制備柔紅霉素和抗T細胞抗體的偶聯(lián)物(Cancer Res.486097-6102(1988))。
由Trouet等人開發(fā)的一種替代方法，涉及通過肽間隔臂(peptidespacer arm)將柔紅霉素連接于抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.79626-629(1982))。這是在游離藥物可以經(jīng)溶酶體肽酶的作用從這樣的偶聯(lián)物上被釋放出來的前提下進行的。
然而，體外細胞毒性實驗揭示了，抗體-藥物偶聯(lián)物極少達到與游離的非連接藥物相同的細胞毒性能力。這提示了，藥物分子從抗體被釋放的機制是非常低效率的。在免疫毒劑的領(lǐng)域中，已顯示，通過單克隆抗體和有催化活性的蛋白毒素之間的二硫鍵形成的偶聯(lián)物，比含其它接頭的偶聯(lián)物更具細胞毒性。參見，Lambert et al.J.Biol.Chem.26012035-12041(1985)；Lambert et al.Immunotoxins 175-209(A.Frankel，ed.1988)；Ghetie et al.Cancer Res.482610-2617(1988)。這被歸因于細胞內(nèi)的高谷胱甘肽濃度，其可以有效切割抗體分子和毒素之間的二硫鍵。盡管如此，僅有少數(shù)的被報道的例子，是有關(guān)于將二硫鍵橋應(yīng)用于制備藥物和大分子之間的偶聯(lián)物。Shen等人描述了通過二硫鍵與聚-D-賴氨酸連接之后，甲氨蝶呤轉(zhuǎn)化為巰基乙酰胺衍生物(J.Biol.Chem.26010905-10908(1985))。此外，一些報道描述了制備含三硫的毒性藥物加里剎霉素(calicheamicin)與抗體的偶聯(lián)物(Hinman et al，53 Cancer Res.3336-3342(1993)，Hamann et al.，Bioconjugate Chem.，13，40-46(2002)，Hamann et al.，Bioconjugate Chem.，13，47-58(2002))。
造成二硫鍵連接的抗體-藥物偶聯(lián)物的缺乏的一個原因是，具有含硫原子的部分的細胞毒性藥物并不總是可以獲得的，而所述含硫原子部分是被需要以用來方便地將該藥物經(jīng)二硫鍵連接于抗體的。而且，對現(xiàn)存藥物進行化學(xué)修飾而不減少它們的細胞毒性潛能，是困難的。
美登素類是高度細胞毒性的藥物。美登素(maytansine)首先由Kupchan等人從東非灌木Maytenus serrata中分離出來，它比傳統(tǒng)的癌癥化療劑如甲氨碟呤、柔紅霉素和長春新堿的細胞毒性強100至1000倍(美國專利3,896,111號)。隨后，發(fā)現(xiàn)一些微生物也產(chǎn)生美登素類，如美登醇(maytansinol)和美登醇的C-3酯(美國專利4,151,042號)。也報道了合成的美登醇C-3酯及美登醇的類似物(Kupchan et al.J.Med.Chem.2131-37(1978)；Higashide et al.Nature 270721-722(1977)；Kawai et al.Chem.Pharm.Bull.323441-3451(1984))。C-3酯由美登醇制備得來，這樣的美登醇類似物的例子包括，在芳環(huán)上有修飾的美登醇(例如，脫氯)或在C-9、C-14有修飾的美登醇(例如，羥化的甲基)、在C-15、C-18、C-20和C-4，5處帶有修飾的美登醇。
天然發(fā)生的美登醇C-3酯和合成的美登醇C-3酯可以被分為兩組(a)帶有簡單羧酸的C-3酯(美國專利4,248,870；4,265,814；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,317,821；4,322,348和4,331,598號)和(b)帶有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯(美國專利4,137,230；4,260,608；5,208,020號和Chem.Pharm.Bull.123441(1984))。
發(fā)現(xiàn)組(b)的酯比組(a)的酯更有細胞毒性。
美登素是有絲分裂抑制劑。已報道，用美登素在體處理L1210細胞，導(dǎo)致細胞的67％積累在有絲分裂期。據(jù)報道，未被處理的對照細胞顯示了范圍在3.2％至5.8％之間的有絲分裂指數(shù)(Sieber et al.43Comparative Leukemia Research 1975，Bibl.Haemat.495-500(1976))。用海膽卵和蛤卵進行的實驗提示，美登素通過抑制微管蛋白質(zhì)(microtubule)——微管蛋白(tubulin)的多聚化而干擾微管的形成，從而抑制有絲分裂(Remillard et al.Science 1891002-1005(1975))。
在體外，已發(fā)現(xiàn)P388、L1210和LY5178鼠白血病細胞懸液被美登素抑制，美登素的劑量是10-3至10-1μg/μl，其中P388細胞系最為敏感。也已顯示，美登素是人鼻咽癌細胞的體外生長的活性抑制劑，并且據(jù)報道，人急性成淋巴細胞性白血病系CEM被低至10-7mg/ml的濃度所抑制(Wolpert-DeFillippes et al.Biochem.Pharmacol.241735-1738(1975))。
在體內(nèi)，也已顯示，美登素是活性的。在50倍至100倍的劑量范圍內(nèi)，P388淋巴細胞白血病系統(tǒng)中的腫瘤生長被抑制，這表明了高的治療指數(shù)；對于L1210鼠白血病系統(tǒng)、人Lewis肺癌系統(tǒng)和人B-16黑素癌系統(tǒng)，也可以顯示出顯著的抑制活性(Kupchan，Ped.Proc.332288-2295(1974))。在美國專利5,208,020和5,416,064以及Chari et al.，Cancer Res.，52127-131(1992)和Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，938618-8623(1996)中描述了，用來與細胞結(jié)合劑進行結(jié)合的美登素類。在這些偶聯(lián)物中，細胞結(jié)合劑是通過二硫鍵被連接于美登素類DM1[N2’-脫乙酰-N-2’(3-巰基-1-氧丙基)-美登素，1，CAS號139504-50-0，

圖1]。
在上述的專利中，具有?；腘-甲基-L-丙氨酸側(cè)鏈的美登素類藥物具有式2a，b 在式2a中，l代表從1至10的整數(shù)。因此，式2a的美登素類具有連接于未取代的亞甲基的硫原子(-CH2-S-)。據(jù)稱，這種美登素類化合物中的巰基或者帶有這樣的美登素類的通過二硫鍵連接的細胞結(jié)合劑-美登素類偶聯(lián)物中的二硫基團，是“非位阻的(non-hindered)”，原因是，在相鄰于巰基或二硫基團的α-碳上沒有引起位阻現(xiàn)象的大體積的取代基。在式2b中，m代表0、1、2或3。因此，式2b的美登素類也有連接于未取代的亞甲基基團的硫原子，m＝0并且R2＝CH3或CH2CH3的情況除外。如果m＝0，那么美登素類在通過二硫鍵與細胞結(jié)合劑連接后，在帶有硫醇功能基(thiol functionality)或二硫功能基(disulfidefunctionality)的碳上具有一個取代基。然而，由于在此情形下，硫原子相對于羰基是處于β位，發(fā)現(xiàn)這些美登素類以及這些美登素類與細胞結(jié)合劑經(jīng)二硫鍵形成的偶聯(lián)物是不穩(wěn)定的，這歸因于它們有遭受β-消除的傾向。
發(fā)明概述[15]本發(fā)明是基于下面的出乎意料的發(fā)現(xiàn)帶有空間上有位阻的硫醇基團的美登素類(在帶有硫醇功能基的α-碳上具有一個或兩個取代基)與細胞結(jié)合劑的連接，獲得了具有大大改進的體內(nèi)抗腫瘤活性的偶聯(lián)物，這是與用以前描述的美登素類制備的偶聯(lián)物相比而言的，以前描述的美登素類在帶有二硫鍵的α-碳原子上不具有取代基。另一個出乎意料的發(fā)現(xiàn)是，要得到改善的生物學(xué)活性，空間位阻最佳地是發(fā)生在偶聯(lián)物中的二硫鍵的美登素類一側(cè)上。此外，帶有巰基的美登素類的?；陌被醾?cè)鏈中的酰基，在酰胺的羰基和硫原子之間，必須具有至少3個碳原子的線性鏈長度。
這些發(fā)現(xiàn)表明，可以構(gòu)建二硫化物連接的(disulfide-linked)細胞結(jié)合劑-美登素類偶聯(lián)物，這樣，帶有二硫鍵的兩個α-碳原子上的取代可以導(dǎo)致二硫鍵任一側(cè)上的不同程度的空間位阻。
因此，本發(fā)明描述了合成新的含空間位阻的硫醇和二硫化物的美登素類，其在帶有硫原子的α-碳上具有一個或兩個烷基取代基。此外，?；陌被醾?cè)鏈的?；邗０返聂驶土蛟又g，具有至少3個碳原子的線性鏈長度。
也描述了這些新的美登素類的細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的制備和生物學(xué)評價。
在本發(fā)明的一種實施方案中，描述了新的含硫醇和二硫化物的美登素類，其在帶有硫原子的碳原子上具有單烷基取代或雙烷基取代。
在第二種實施方案中，本發(fā)明公開了用于合成這些新的美登素類的方法。
在第三種實施方案中，描述了用于將這些新的美登素類與細胞結(jié)合劑相連接的方法。這些偶聯(lián)物作為治療劑是有用的，其被特異性地傳送至靶細胞，并且是細胞毒性的。與以前描述的制劑相比，這些偶聯(lián)物在動物腫瘤模型中顯示出大大改進的治療效應(yīng)。
更具體地，本發(fā)明提供了[23]美登素類，其在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基(desmethyl)處，具有?；陌被醾?cè)鏈，該側(cè)鏈帶有酰基，該?；哂形蛔璧膸€基，其中帶有硫醇功能的?；荚泳哂幸粋€或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性或分支的烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、苯基、取代的苯基、或者雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，此外，取代基之一可以是H，并且其中?；隰驶δ芑?carbonyl functionality)和硫原子之間，具有至少3個碳原子的線性鏈長度；[24]表示為式4’的化合物 其中Y’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ,
其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，此外，R2可以是H；A、B、D是具有3-10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基，單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0。
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團。
表示為式4’的化合物，其中R1是H，R2是甲基和Z是H。
表示為式4’的化合物，其中R1和R2是甲基和Z是H。
表示為式4’的化合物，其中R1是H，R2是甲基，Z是-SCH3。
表示為式4’的化合物，其中R1和R2是甲基，Z是-SCH3。
表示為式(I-L)、(I-D)或(I-D，L)的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，并且此外n可以是0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性或分支的烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；和May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處帶有側(cè)鏈的美登素類；[30]上述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是H；[31]上述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是H；[32]上述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是-SCH3；[33]上述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3；[34]表示為式4的化合物
其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，并且此外n可以是0；和Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；[35]式4的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m的每一個是1；n是0；Z是H；[36]式4的化合物，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7、R8的每一個是H；l和m是1；n是0；Z是H；[37]式4的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是-SCH3； 式4的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3；[39]美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，包括至少一種連接于細胞結(jié)合劑的美登素類，其中所述美登素類是上述化合物中的任意一種；[40]上述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物中的任意一種，其中所述的細胞結(jié)合劑包含至少一個抗體結(jié)合位點，其優(yōu)選地是人源化的(humanized)MY9或表面重構(gòu)的(resurfaced)MY9、人源化的抗-B4或表面重構(gòu)的抗-B4，或人源化的C242或表面重構(gòu)的C242；[41]藥物組合物，包含有效量的任何上述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物(solvate)，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；[42]在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處酯化美登素類的方法，得到的美登素類帶有?；陌被醾?cè)鏈，在該處的?；哂斜槐Ｗo的巰基功能基，其中帶有被保護的硫醇功能基的?；荚佑幸粋€或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，并且此外所述的取代基之一可以是H，并且其中該酰基在羰基功能基和硫原子之間有至少3個碳原子的線性鏈長度，所述方法包括使美登素類在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處與?；陌被岚l(fā)生反應(yīng)，所述?；陌被嶂械孽；鶐в斜槐Ｗo的巰基；[43]酯化美登素類以生成美登素類酯(maytansinoid ester)的方法，所述美登素類酯可以表示為式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性環(huán)狀烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，并且此外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；和May是美登素類；所述方法包括使所述May在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處，與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng)； 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團，并且此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性或分支的烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；l、m和n的每一個獨立地是1至5的整數(shù)，此外n可以是0；和
Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳香基團或雜環(huán)烷基基團；[44]上述方法，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m的每一個是1；n是0；[45]上述方法，其中式(III)化合物是如(III-L)所表示；[46]上述方法，其中式(III-L)化合物是化合物15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[47]上述方法，其中式(III-D)化合物是化合物15(R，S)、15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物；[48]上述方法，其中式(III-D，L)化合物是用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物；[49]上述的方法，其中15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是經(jīng)下列過程制成的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[50]上述的方法，其中化合物15a(S，S)是由下列方法制成的，包括(1)轉(zhuǎn)變(R)-1，3-丁二醇為(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)轉(zhuǎn)變化合物19為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)。
上述的方法，其中化合物15b(S，R)是由下列方法制成的，包括(1)轉(zhuǎn)變(S)-1，3-丁二醇為(R)-4-(甲基二硫代)戊酸；(2)轉(zhuǎn)變化合物24為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(3)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15b(S，R)。
上述的方法，其中15(R，S)和15(R，R)的混合物是經(jīng)下列過程制成的，包括
(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
上述的方法，其中用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；庀腘-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物，其是經(jīng)下列過程制成的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到用具有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀腘-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
上述方法，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m的每一個是1；n是0；[55]上述方法，其中式(III-L)化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10(S)；[56]上述方法，其中式(III-D)化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10(R)；[57]上述方法，其中式(III-D，L)化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10(S，R)；[58]上述方法，其中含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是經(jīng)下列過程制造的，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，轉(zhuǎn)變化合物7為二硫化物8；(4)轉(zhuǎn)變化合物8為其N-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10； 通過上述任一方法來制造美登素類的方法，如果存在非對映異構(gòu)體的話，還可包括分離非對映異構(gòu)體，以及通過在氰鍵合的二氧化硅上的HPLC來進行純化；[60]制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過上述的任意方法來制造純化的美登素類，以及使純化的美登素類與含有活性二硫基或巰基的細胞結(jié)合劑反應(yīng)；[61]上述的制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，其中所述的活性二硫基是二硫代吡啶基團或取代的二硫代吡啶基團；[62]制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過上述的任意方法制造純化的美登素類，以及使純化的美登素類與含有馬來酰亞胺基團(maleimido group)或鹵代乙?；鶊F(haloacetyl group)的細胞結(jié)合劑反應(yīng)；[63]酯化美登醇以得到式42’的美登素類的方法 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；
A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的芳基或取代的芳基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基基團；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，所述方法包括使結(jié)構(gòu)11的美登醇在C-3 與式(III’-L)、(III’-D)、或(III’-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中
R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的芳基或取代的芳基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
酯化美登醇以得到式42’的美登素類的方法，其中式(I)的化合物表示為式(I-L)。
酯化美登醇以得到式42’的美登素類的方法，其中R1是H，R2是甲基。
酯化美登醇以得到式42的美登素類的方法 其中
Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，其中所述方法包括使式11的美登醇 在C-3位置上與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；[67]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中式(III)的化合物表示為式(III-L)；[68]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中所述式(III-L)化合物是15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[69]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中所述式(III-D)化合物是15(R，S)，15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物；[70]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中所述式(III-D，L)化合物是用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物；[71]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是經(jīng)下列過程被產(chǎn)生的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[72]上述酯化美登醇的方法，其中所述化合物15a(S，S)是由下列方法產(chǎn)生的，包括(1)轉(zhuǎn)變(R)-1，3-丁二醇為(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)轉(zhuǎn)變化合物19為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和
(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到化合物15a(S，S)。
上述酯化美登醇的方法，其中所述化合物15b(S，R)是由下列方法產(chǎn)生的，包括(1)轉(zhuǎn)變(S)-1，3-丁二醇為(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(4)轉(zhuǎn)變化合物24為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(5)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15b(S，R)；[74]上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物是經(jīng)下列過程被產(chǎn)生的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
上述酯化美登醇以得到式4a的美登素類的方法，其中用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化外消旋的N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物，其是經(jīng)下列過程產(chǎn)生的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到用具有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀齆-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
上述酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7、R8的每一個是H；l和m是1；和n是0；[77]上述酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，其中所述式(III-L)化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10；[78]上述酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，其中所述式(III-D)化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10；[79]上述酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，其中所述式(III-D，L)化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10； 上述酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，其中含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通過下列過程產(chǎn)生的，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，轉(zhuǎn)變化合物7為二硫化物8；(4)轉(zhuǎn)變化合物8為其N-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10；[81]上述用10酯化美登醇——如果存在非對映異構(gòu)體，則隨后分離非對映異構(gòu)體，并經(jīng)在氰鍵合的二氧化硅上的HPLC純化美登素類——的方法，進一步包括還原二硫鍵，以得到式4b的美登素類；[82]制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過上述任意的酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，來制造純化的美登素類，并使該美登素類與含有巰基或活性二硫基團——優(yōu)選地是二硫代吡啶基或取代的二硫代吡啶基——的細胞結(jié)合劑反應(yīng)；[83]制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過上述任意的酯化美登醇以得到式4b的美登素類的方法，來制造純化的美登素類，并使該美登素類與含有馬來酰亞胺基或鹵代乙?；募毎Y(jié)合劑反應(yīng)。
應(yīng)用上述偶聯(lián)物的治療方法。
式(III)的化合物 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中
R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的芳基或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
化合物10(S)、10(R)或外消旋的10；[87]制造含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10的方法，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈的陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，轉(zhuǎn)變化合物7為二硫化物8；(4)轉(zhuǎn)變化合物8為其N-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[89]制造化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；和(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；[90]化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
制造化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；
(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物；[92]用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
制造用具有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀腘-甲基丙氨酸的方法，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物，該方法包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到用具有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀腘-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
化合物15a(S，S)；[95]化合物15b(S，R)；[96]制造化合物15a(S，S)的方法，包括(1)轉(zhuǎn)變(R)-1，3-丁二醇為(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)轉(zhuǎn)變化合物19為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述化合物15a(S，S)；[97]制造化合物15b(S，R)的方法，包括(1)轉(zhuǎn)變(S)-1，3-丁二醇為(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)轉(zhuǎn)變化合物24為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(3)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述化合物15b(S，R)。
藥物組合物，包含有效量的上述任意的美登素類化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；[99]上述的包含美登素類化合物的藥物組合物，進一步包含抗體。
在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的上述任意的美登素類-細胞結(jié)合劑、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含靶細胞的組織。
附圖簡述[101]圖1顯示了以前描述的美登素類的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了本發(fā)明的一些美登素類的結(jié)構(gòu)。
圖3a-3d顯示了合成本發(fā)明的代表性的美登素類的流程。
圖4a、4b是顯示本發(fā)明的新的美登素類的體外效力(potency)的曲線圖。
圖4c、4d是比較本發(fā)明的新的美登素類和那些以前描述的美登素類的體外效力的繪圖。
圖5a-5d顯示了制備細胞結(jié)合劑和本發(fā)明美登素類的偶聯(lián)物的流程。
圖6是顯示本發(fā)明的細胞結(jié)合劑-美登素類偶聯(lián)物的體外效應(yīng)的繪圖。
圖7是比較本發(fā)明的huC242-美登素類與以前描述的美登素類的huC242偶聯(lián)物的對抗HT-29人結(jié)腸腫瘤異種移植物的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的繪圖。
圖8是比較本發(fā)明的huC242-美登素類與以前描述的美登素類的huC242偶聯(lián)物的對抗COLO 205人結(jié)腸腫瘤異種移植物的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的繪圖。
圖9是比較本發(fā)明的MY9-6-美登素類與以前被描述的美登素類的MY9-6偶聯(lián)物的對抗HL60前髓細胞性髓樣白血病異種移植物的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的繪圖。
圖10顯示了偶聯(lián)物huMy9-6-DM4對靶細胞HL-60和非靶細胞Namalwa細胞的體外細胞毒性的評價結(jié)果。
圖11顯示了在SCID鼠中，偶聯(lián)物huMy9-6-DM4抵抗人HL-60異種移植腫瘤的體內(nèi)效應(yīng)評價，并將其與以前描述的美登素類的huMy9-6偶聯(lián)物(huMy9-6-DM1)的效應(yīng)相比較。
圖12顯示了偶聯(lián)物huB4-DM4對Ramos靶細胞和Colo 205非靶細胞的體外細胞毒性評價的結(jié)果。
圖13a顯示了在SCID鼠中，偶聯(lián)物huB4-DM4對抗人Ramos異種移植腫瘤的體內(nèi)效應(yīng)評價，圖13b顯示了該實驗期間，動物體重的變化。
發(fā)明詳述[115]本發(fā)明公開了新的、含有受空間位阻的硫醇(thiol)和二硫化物(disulfide)的美登素類，其中帶有硫原子的α-碳帶有一個或兩個烷基取代基。本發(fā)明也公開了用于合成這些新的美登素類的方法。進一步公開了在這些新的美登素類的合成中作為中間產(chǎn)物的有用的新的化合物。此外，本發(fā)明公開了制備這些新的美登素類和細胞結(jié)合劑的偶聯(lián)物(conjugates)。
本領(lǐng)域揭示了，修飾現(xiàn)有藥物而不減少它們的細胞毒性潛能，是極其困難的。本公開的發(fā)明通過教導(dǎo)用于合成新的美登素類分子的方法，克服了此難題，所述分子含有具空間位阻的硫醇或二硫化物部分(moiety)。本公開的發(fā)明保留了——在一些情況下甚至增強了——以前描述的美登素類的細胞毒性潛力。
美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物允許欲以靶向方式應(yīng)用的美登素類僅對不需要的細胞發(fā)揮充分的細胞毒作用，因此，避免了由于損害非靶向的健康細胞所帶來的副作用。因此，本發(fā)明提供了有用的藥劑，和用于制備這些藥劑的新方法，以用于消除欲被殺死或裂解的疾病細胞或異常細胞，而顯示最小的副作用，這些細胞例如腫瘤細胞(特別是實體瘤細胞)、病毒感染細胞、微生物感染細胞、寄生蟲感染細胞、自身免疫細胞(產(chǎn)生自身抗體的細胞)、活化的細胞(參與移植排斥或移植物抗宿主病的那些細胞)、或任意其它類型的疾病細胞或異常細胞。
因此，本發(fā)明教導(dǎo)了用于產(chǎn)生改良的細胞毒性偶聯(lián)物的方法，所述偶聯(lián)物包括新的美登素類和細胞結(jié)合劑，這與以前描述的美登素類和細胞結(jié)合劑相比，生物學(xué)活性大大改善。本發(fā)明進一步教導(dǎo)了用于合成美登素類衍生物的方法，所述衍生物具有受空間位阻的硫醇或二硫化物部分，該部分允許和細胞結(jié)合劑進行化學(xué)連接，所述衍生物在結(jié)合形式或在釋放形式或在兩種狀態(tài)下，顯示出高的細胞毒性。本發(fā)明的細胞毒性偶聯(lián)物包含一個或多個連接于細胞結(jié)合劑的美登素類。為了將美登素類連接于細胞結(jié)合劑，美登素類必須先被修飾。
可以被用于本發(fā)明以產(chǎn)生能夠被連接于細胞結(jié)合劑的美登素類的美登素類，是本領(lǐng)域中已知的，并且可以根據(jù)已知方法從天然來源分離出來或根據(jù)已知方法合成制備出來。
合適的美登素類的例子包括美登醇和美登醇類似物(analogues)。合適的美登醇類似物的例子包括那些具有修飾的芳環(huán)和那些在其它位置帶有修飾的化合物。
具有修飾的芳環(huán)的合適的美登素類類似物的具體例子包括(1)C-19-脫氯(美國專利4,256,746號)(經(jīng)安絲菌素P2的LAH還原而制備)；(2)C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脫氯(美國專利4,361,650和4,307,016號)(用鏈霉菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)經(jīng)去甲基化，或用LAH經(jīng)脫氯化而制備)；和(3)C-20-脫甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脫氯(美國專利4,294,757號)(用?；冉?jīng)?；饔枚苽?。
在其它位置有修飾的合適的美登醇類似物的具體例子包括(1)C-9-SH(美國專利4,424,219號)(通過美登醇與H2S或P2S5反應(yīng)而制備)；(2)C-14-烷氧甲基(去甲氧/CH2OR)(美國專利4,331,598號)；(3)C-14-羥甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利4,450,254號)(從諾卡氏菌屬(Nocardia)制備)；(4)C-15-羥基/酰氧基(美國專利4,364,866號)(由鏈霉菌經(jīng)美登醇的轉(zhuǎn)化而制備)；(5)C-15-甲氧基(美國專利4,313,946和4,315,929號)(從Trewianudiflora分離)；(6)C-18-N-去甲基(美國專利4,362,663和4,322,348號)(由鏈霉菌進行美登醇去甲基化而制備)；和(7)4，5-脫氧(美國專利4,371,533號)(經(jīng)美登醇的三氯化肽/LAH還原而制備)。
為了將美登素類連接于細胞結(jié)合劑，美登素類包含連接部分(linking moiety)。連接部分含有化學(xué)鍵，其允許完整活性的美登素類在特定位點被釋放出來。合適的化學(xué)鍵在本領(lǐng)域中是已知的，包括二硫鍵、酸不穩(wěn)定鍵、光不穩(wěn)定鍵、肽酶不穩(wěn)定鍵和酯酶不穩(wěn)定鍵。優(yōu)選的是二硫鍵。
美國專利5,208,020的公開內(nèi)容教導(dǎo)了產(chǎn)生帶有這些鍵的美登素類，其在此并入，作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，連接部分包括具空間位阻的硫醇或二硫化物部分。
特別優(yōu)選的包含含活性化學(xué)基團的連接部分的美登素類，是美登醇的C-3酯及其類似物，其中所述連接部分包含具空間位阻的硫醇或二硫鍵。
美登素類上的許多位置可以用作化學(xué)地連接所述連接部分的位置。例如，具有羥基的C-3位、用羥甲基修飾的C-14位、用羥基修飾的C-15位和具有羥基的C-20位，都被預(yù)期是有用的。然而，C-3位是優(yōu)選的，并且美登醇的C-3位是特別優(yōu)選的。
進一步地，盡管在下面是基于在C-3位的含二硫鍵的連接部分，描述了具有連接部分的美登醇的酯的合成，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，帶有其它化學(xué)鍵的連接部分，如上面所描述的，也可以被用于本發(fā)明，同樣地，其它美登素類和其它連接位置，如上面所描述的，也可以被用于本發(fā)明。
圖2顯示了本發(fā)明的各種美登素類的結(jié)構(gòu)。具有空間位阻的硫醇或二硫化物部分的美登素類的合成，參考圖3的描述。下列代表性方法中的許多是應(yīng)用了含硫醇的美登素類N2’-脫乙酰-N2’-(4-巰基-1-氧戊基)-美登素(被稱為DM3)和N2’-脫乙酰-N2’-(4-甲基-4-巰基-1-氧戊基)-美登素(被稱為DM4)。DM3(4a)和DM4(4b)被表示為下列結(jié)構(gòu)式 [130]本發(fā)明的含空間位阻的硫醇和二硫化物的新的美登素類的體外細胞毒性，可以用它們在體外抑制各種不需要的細胞系的增殖的能力來評價(圖4)。例如，可以用細胞系如人乳腺癌細胞系SK-Br-3，或人表皮樣癌細胞系KB，來評價這些新的美登素類的細胞毒性?？梢詫⒂辉u價的細胞暴露于化合物72小時，并用已知方法用直接測定法來測定細胞的存活部分。然后，從分析結(jié)果可以計算出IC50值。
具有受空間位阻的硫醇或二硫化物部分的美登素類的生成[131]本發(fā)明的新的美登素類是那些在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處具有酰化的氨基酸側(cè)鏈的物質(zhì)，所述側(cè)鏈帶有?；擋；哂形蛔璧膸€基，其中具有硫醇功能基的酰基碳原子具有一個或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，取代基之一可以是H，并且其中該?；隰驶δ芑土蛟又g具有至少三個碳原子的線性鏈長度。
優(yōu)選地，美登素類化合物被表示為式4’ 其中Y’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B、D是具有3-10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
在表示為4’的化合物的優(yōu)選實施方案中，R1是H，R2是甲基和Z是H；R1和R2是甲基和Z是H；R1是H，R2是甲基和Z是-SCH3；或R1和R2是甲基和Z是-SCH3。
更優(yōu)選地，美登素類是表示為式(I-L)、(I-D)或(I-D，L)的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有從3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，此外，n可以是0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；和May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處有側(cè)鏈的美登素類。
更優(yōu)選的是C-3酯，它是被表示為式4的化合物 其中的取代基如上面所定義。
特別優(yōu)選的是任意的上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，和Z是H；上述那些化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m是1，n是0，和Z是H；那些化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，和Z是-SCH3；那些化合物，R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，和Z是-SCH3。進一步地，L-丙氨酰立體異構(gòu)體是優(yōu)選的，原因是，對本發(fā)明的偶聯(lián)物來說，它是最有用的。
式4的優(yōu)選實施方案包括DM3和DM4，即，式4的美登素類，其中Z是H，R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m是1，和n是0(DM3，化合物4a)；式4的美登素類，其中Z是H，R1和R2都是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m是1，和n是0(DM4，化合物4b)；式4的美登素類，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，和Z是-SCH3；和式4的美登素類，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，和Z是-SCH3。
具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基的例子包括但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丙烯基、丁烯基和己烯基。
具有3至10個碳原子的分支烷基或烯基的例子包括但不限于，異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、1-乙基丙基、異丁烯基和異戊烯基。
具有3至10個碳原子的環(huán)狀烷基或烯基的例子包括但不限于，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基和環(huán)己烯基。
單純的芳基包括具有6至10個碳原子的芳基，取代的芳基包括具有6至10個碳原子的芳基，其帶有至少一個含1至4個碳原子的烷基取代基，或烷氧基取代基如甲氧基、乙氧基，或鹵素取代基或硝基取代基。
含有6至10個碳原子的單純的芳基的例子包括苯基和萘基。
取代的芳基的例子包括硝基苯基、二硝基苯基。
雜環(huán)芳基包括具有3至10元環(huán)的基團，其含有一個或兩個選自N、O或S的雜原子。
雜環(huán)烷基包括環(huán)狀化合物，其包括3至10元環(huán)體系，其中包含一個或兩個選自N、O或S的雜原子。
雜環(huán)芳基的例子包括吡啶基、硝基吡啶基、pyrollyl、唑基、噻吩基、噻唑基和呋喃基。
雜環(huán)烷基的例子包括二氫呋喃、四氫呋喃、tetrahydropyrollyl、哌啶基、哌嗪基和嗎啉基(morpholino)。
具有受空間位阻的硫醇或二硫化物部分的新的美登素類，可以通過下列新公開的方法來制備美登素類的合成[148]圖3a顯示了合成美登素類DM4(4b)中的步驟。將異丁烯基硫醚(5)與乙腈的陰離子反應(yīng)，得到巰基化合物6。用堿水解6得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)。通過與甲基甲硫醇磺酸酯(MeSSO2Me)反應(yīng)，完成7向二硫化物8的轉(zhuǎn)變。8轉(zhuǎn)變?yōu)镹-羥基琥珀酰亞胺酯9，隨后與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到羧酸10，其通過硅膠柱層析被純化。在N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和氯化鋅存在的條件下，10和美登醇(11)反應(yīng)，得到N-酰基-N-甲基-L-丙氨酰美登素類L-DM4Sme，(4e)和N-酰基-N-甲基-D-丙氨酰美登素類D-DM4Sme(4f)的混合物。用氰鍵合的柱，通過HPLC分離非對映異構(gòu)體的混合物。收集所需的含L-氨基酸的異構(gòu)體4e并用二硫蘇糖醇還原，得到含硫醇的L-氨?；赖撬仡怐M4(4b)，再次用氰鍵合的柱，通過HPLC純化它。
圖3b顯示了合成美登素類DM3(4a)中的步驟。
通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，4-巰基戊酸(12)轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆蚧?，得?3。化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)镹-羥基琥珀酰亞胺酯14，隨后與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到羧酸15，其通過硅膠柱層析被純化。在N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和氯化鋅存在的條件下，15和美登醇(11)反應(yīng)，得到N-?；?N-甲基-L-丙氨酰美登素類L-DM3SSMe，(4c)和N-?；?N-甲基-D-丙氨酰美登素類D-DM3SSMe(4d)的混合物。用氰鍵合的柱，通過HPLC分離非對映異構(gòu)體的混合物。收集所需的含L-氨基酸的異構(gòu)體并用二硫蘇糖醇還原，得到含巰基-L-氨基酸的美登素類DM3(4a)，再次用氰鍵合的柱，通過HPLC純化它。
圖3c和3d顯示了具有或者(S)-4-甲基二硫代-1-氧代戊基部分或者(R)-4-甲基二硫代-1-氧代戊基部分的DM3的合成。轉(zhuǎn)變(R)-1，3-丁二醇(16)為其二甲苯磺酸酯(ditosylate)17，隨后與氰化鈉和黃原酸乙酯鉀(potassium ethyl xanthate)連續(xù)反應(yīng)，得到腈18(圖3c)。堿水解，隨后經(jīng)二硫化物交換，得到(S)-4-甲基二硫代-戊酸19。19轉(zhuǎn)變?yōu)殓牾啺孵?0，隨后與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到N-甲基-N-[4-(S)-甲基二硫代-1-氧代-戊基]-S-丙氨酸(15a)。如上面對化合物15的描述，與美登醇反應(yīng)，得到L-DM3SMe的兩種非對映異構(gòu)體4g和4h。類似地，(S)-1，3-丁二醇(21)被轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-甲基二硫代-戊酸24，然后轉(zhuǎn)變?yōu)?5b。如上面所描述，與美登醇反應(yīng)，得到DM3SMe的兩種非對映異構(gòu)體，4k和4l。
因此，本發(fā)明提供了在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處用?；陌被醾?cè)鏈酯化美登素類的方法，其中的酰基基團具有被保護的巰基功能基，其中帶有被保護的硫醇功能基的?；荚泳哂幸粋€或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外取代基之一可以是H，其中?；鶊F在羰基功能基和硫原子之間有至少3個碳原子的線性鏈長度，所述方法包括使美登素類在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處與酰化的氨基酸反應(yīng)，所述酰化的氨基酸中的?；鶐в斜槐Ｗo的巰基。
在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了酯化美登醇以得到式42’的美登素類的方法 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的芳基或取代的芳基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，所述方法包括使結(jié)構(gòu)11的美登醇在C-3位 與式(III’-L)、(III’-D)或(III’-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的芳基或取代的芳基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
優(yōu)選地，式(I)的化合物被表示為式(I-L)，并且，還優(yōu)選地，R1是H和R2是甲基。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了酯化美登醇以得到式42的美登素類的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是1至5的整數(shù)，另外n可以是0；
Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，所述方法包括使式11的美登醇在C-3位 與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或線性烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
可以在氰鍵合的二氧化硅上，通過HPLC分離非對映異構(gòu)體。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了酯化美登素類以產(chǎn)生式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)所表示的美登素類酯的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；和May是美登素類，所述方法包括使所述may在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基，與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng) 其中
Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
在一種甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了酯化美登醇以得到式42的美登素類的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；
Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，所述方法包括使美登醇在C-3位上與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
優(yōu)選地，表示為式(I)的化合物是L立體異構(gòu)體。
對于上述的方法，優(yōu)選的是，R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，和n是0；或R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m是1，和n是0。
制備DM3時，式(III-L)的化合物是15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物；式(III-D)的化合物是被外消旋的?；鶊F或具有R或S手性的?；鶊F?；腘-甲基-D-丙氨酸，從而得到化合物15；式(III-D，L)的化合物是用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀腘-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
15a(S，S)和15b(S，R)的混合物可以通過下面的過程產(chǎn)生，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
相似地，15(R，S)和15(R，R)的混合物可以通過下列過程產(chǎn)生，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋的N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物，其可以經(jīng)下列過程產(chǎn)生，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀腘-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
化合物15a(S，S)可以經(jīng)下列方法制成，包括(1)轉(zhuǎn)變(R)-1，3-丁二醇為(S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)轉(zhuǎn)變化合物19為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述化合物15a(S，S)。
化合物15b(S，R)可以經(jīng)下列方法制成，包括(1)轉(zhuǎn)變(S)-1，3-丁二醇為(R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)轉(zhuǎn)變化合物24為其N-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(3)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15b(S，R)；[166]制造DM4時，式(III-L)的化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10；式(III-D)的化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10，式(III-D，L)的化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通過下列過程被制造的，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，轉(zhuǎn)變化合物7為二硫化物8；(4)轉(zhuǎn)變化合物8為其N-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
根據(jù)本發(fā)明，式III的化合物也是新的 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基、分支烷基或環(huán)烷基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
用類似于本文所公開的那些用于制造化合物10和15的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地制造出式III的化合物。
美登素類的體外細胞毒性[170]圖4顯示了本發(fā)明的美登素類的體外細胞毒性。具有受位阻的二硫鍵的新的美登素類(4c，4e)對被測試的細胞系是高度有效的。因此，4c殺死A-375細胞和SK-Br-3細胞，IC50值分別是1.5×10-11M和7.0×10-12M。相似地，美登素類4e也是高度有效的，它對A-375細胞和SK-Br-3細胞的IC50值分別是3.2×10-11M和9.0×10-12M。比較本發(fā)明的含位阻硫醇的美登素類4a和以前描述的美登素類1的體外效力(圖4c、d)，結(jié)果表明，新的美登素類比以前描述的美登素類的效力大20至50倍。
細胞結(jié)合劑的制備[171]本發(fā)明的化合物作為治療劑的有效性取決于對合適的細胞結(jié)合劑的仔細選擇。細胞結(jié)合劑可以是目前已知的，或是正在成為已知的的任意種類，包括肽和非肽物質(zhì)。通常地，它們可以是抗體(特別是單克隆抗體)、淋巴因子、激素、生長因子、維生素、營養(yǎng)輸送分子(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)、或任意其它的細胞結(jié)合分子或物質(zhì)。
可以被應(yīng)用的細胞結(jié)合劑的更具體的例子包括多克隆抗體；單克隆抗體；抗體片段如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv(Parham，J.Immunol.1312895-2902(1983)；Spring et al.J.Immunol.113470-478(1974)；Nisonoffet al.Arch.Biochem.Biophys.89230-244(1960))；干擾素(例如，α、β、γ)；淋巴因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；激素如胰島素、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)、MSH(黑素細胞刺激素)、類固醇激素如雄激素和雌激素；生長因子和集落刺激因子如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 5155-158(1984))；轉(zhuǎn)鐵蛋白(O′Keefe et al.J.Biol.Chem.260932-937(1985))；和維生素，如葉酸。
單克隆抗體技術(shù)允許極度特異的細胞結(jié)合劑以特異的單克隆抗體的形式產(chǎn)生。在本領(lǐng)域中，用于制備單克隆抗體的技術(shù)是公知的，所述抗體是通過用感興趣的抗原免疫小鼠、大鼠、倉鼠或任意其它的哺乳動物而產(chǎn)生的，所述抗原例如完整的靶細胞、從靶細胞分離的抗原、全病毒、減毒的全病毒和病毒蛋白如病毒衣殼蛋白。也可以應(yīng)用致敏的人細胞。制備單克隆抗體的另一種方法是應(yīng)用scFv(單鏈可變區(qū))噬菌體文庫，特別是人scFv噬菌體文庫(參見，Griffiths等，美國專利5,885,793和5,969,108號；McCafferty等，WO 92/01047；Liming等，WO 99/06587)。此外，也可以應(yīng)用美國專利5,639,641號中公開的表面重構(gòu)抗體，也可以應(yīng)用人源化的抗體。
對合適的細胞結(jié)合劑的選擇，取決于欲靶向的特定細胞群，但通常地，如果可以得到合適的人單克隆抗體，則優(yōu)選人單克隆抗體。
例如，單克隆抗體MY9是鼠IgG1抗體，其特異性結(jié)合于CD33抗原{J.D.Griffin et al 8 Leukemia Res.，521(1984)}，如果靶細胞表達CD33，例如在急性骨髓性白血病(AML)中，可以應(yīng)用該抗體。類似地，單克隆抗體抗B4是鼠IgG1，其結(jié)合于B細胞上的CD19抗原{Nadleret al，131 J.Immunol.244-250(1983)}，如果靶細胞是表達此抗原的B細胞或患病細胞，例如在非霍奇金淋巴瘤或慢性成淋巴細胞白血病中，可以應(yīng)用該抗體。類似地，單克隆抗體C242，結(jié)合于CanAg抗原(美國專利5,552,293號)，它可以被用于治療表達CanAg的腫瘤，如直腸癌、胰腺癌和胃癌。
另外，結(jié)合于骨髓細胞的GM-CSF，可以被用作細胞結(jié)合劑，針對來自急性骨髓性白血病的患病細胞。結(jié)合于活化的T細胞的IL-2，可以被用于預(yù)防移植排斥、用于治療和預(yù)防移植物抗宿主病，和用于治療急性T細胞白血病。結(jié)合于黑素細胞的MSH，可以被用于治療黑素瘤。葉酸可以被用于靶向表達在卵巢腫瘤和其它腫瘤的上葉酸受體。表皮生長因子可以被用于靶向鱗狀癌如肺部鱗狀癌和頭部鱗狀癌和頸部狀鱗癌。生長激素釋放抑制因子可以被用于靶向神經(jīng)母細胞瘤和其它腫瘤類型。
可以分別用雌激素(或雌激素類似物)或雄激素(或雄激素類似物)作為細胞結(jié)合劑，成功地靶向乳腺癌和睪丸癌。
細胞毒性偶聯(lián)物的生成[178]本發(fā)明也提供了美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其包括至少一種連接于細胞結(jié)合劑的美登素類，其中所述細胞結(jié)合劑是用硫醇或二硫功能基被連接于美登素類的，硫醇或二硫功能基存在于?；陌被醾?cè)鏈的酰基基團上，?；陌被醾?cè)鏈存在于美登素類的C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處，其中，?；陌被醾?cè)鏈的?；鶊F具有其硫醇或二硫功能基，它們位于帶有一個或兩個取代基的碳原子上，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，取代基之一可以是H，和其中酰基基團在羰基功能基和硫原子之間具有至少3個碳原子的線性鏈長度。
優(yōu)選的細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物包括至少一種連接于細胞結(jié)合劑的美登素類，其中美登素類由式41’表示 其中Y1’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，其中A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的芳基或取代的芳基、或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；和l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要1、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0。
優(yōu)選地，R1是H和R2是甲基，或R1和R2是甲基。
一種更優(yōu)選的細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物包括至少一種連接于細胞結(jié)合劑的美登素類，其中美登素類由式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)表示 其中Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，此外n可以是0；和May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處帶有側(cè)鏈的美登醇；[182]更優(yōu)選的是這樣的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中美登素類由式41表示
其中取代基如對上面的式(II)所定義。
特別優(yōu)選的是任意的上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，和n是0；和那些任意的上述化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m是1，和n是0。
進一步地，優(yōu)選L-氨基酰立體異構(gòu)體。
本發(fā)明的代表性的細胞毒性偶聯(lián)物是抗體/美登素類，抗體片段/美登素類，表皮生長因子(EGF)/美登素類，黑素細胞刺激素(MSH)/美登素類，促甲狀腺素(TSH)/美登素類，生長激素釋放抑制因子/美登素類，葉酸/美登素類，雌激素/美登素類，雌激素類似物/美登素類，雄激素/美登素類，和雄激素類似物/美登素類。
使含硫醇的美登素類與合適地被修飾的細胞結(jié)合劑反應(yīng)，產(chǎn)生細胞毒性偶聯(lián)物。通過凝膠過濾、離子交換層析或通過HPLC，可以純化這些偶聯(lián)物。
圖5中顯示了用于從含巰基的美登素類制備偶聯(lián)物的方案。更具體地(圖5a，b)，可以將抗體在含水緩沖液中的溶液與過量摩爾數(shù)的抗體修飾劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP，3a)溫育，以導(dǎo)入二硫吡啶基(圖5a)，或與N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-丁酸酯(SPDB，3b)溫育，以導(dǎo)入二硫吡啶基(圖5b)。然后，將修飾的抗體和含硫醇的美登素類(如4a或4b)反應(yīng)，生成二硫化物連接的抗體-美登素類偶聯(lián)物。然后，通過凝膠過濾，美登素類-抗體偶聯(lián)物可以被純化出來。
可選擇地，可以將抗體與過量摩爾數(shù)的抗體修飾劑例如2-iminothiolane溫育，以導(dǎo)入巰基。然后，將修飾的抗體與合適的含二硫化物的美登素類反應(yīng)，生成二硫化物連接的抗體-美登素類偶聯(lián)物。然后，通過凝膠過濾，美登素類-抗體偶聯(lián)物可以被純化出來。
通過分光光度法測定252nm和280nm處的吸光度的比值，可以確定每個抗體分子結(jié)合的美登素類分子的數(shù)目(在圖5a至5d中，用w表示)。通過本方法，可以連接平均1-10個美登素類分子/抗體分子。每個抗體連接的美登素類的優(yōu)選平均數(shù)是2-5，最優(yōu)選的是3-4.5。
可選擇地，可以將抗體在含水緩沖液中的溶液與過量摩爾數(shù)的抗體修飾劑如N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC，26)溫育，以導(dǎo)入馬來酰亞胺基(圖5c)，或與N-琥珀酰亞胺基-4-(碘乙?；?-氨基苯甲酸酯(SIAB，27)溫育，以導(dǎo)入碘乙酰基(圖5d)。然后，將修飾的抗體和含硫醇的美登素類(如4a或4b)反應(yīng)，生成硫醚-連接的抗體-美登素類偶聯(lián)物。然后，通過凝膠過濾，美登素類-抗體偶聯(lián)物可以被純化出來。
通過如上描述的分光光度分析，可以測定每個抗體分子結(jié)合的美登素類分子的數(shù)目。
因此，本發(fā)明提供了制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括經(jīng)上述方法之一制造純化的美登素類，和使純化的美登素類與細胞結(jié)合劑反應(yīng)，所述細胞結(jié)合劑含有活性的二硫基或巰基。優(yōu)選地，活性的二硫基是二硫吡啶基或取代的二硫吡啶基。特別優(yōu)選地，活性的二硫基包括硝基吡啶二硫基或二硝基吡啶二硫基。
在另一種方法中，將純化的美登素類與含有馬來酰亞胺基或鹵代乙酰基的細胞結(jié)合劑反應(yīng)。
可以評價本發(fā)明的細胞結(jié)合劑與美登素類藥物的偶聯(lián)物，評價它們在體外抑制各種不需要的細胞系的增殖的能力(圖6)。例如，可以用細胞系如人結(jié)腸癌細胞系COLO 205、人黑素瘤細胞系A(chǔ)-375、人骨髓白血病細胞系HL 60，評價這些偶聯(lián)物的細胞毒性?？梢詫⒂辉u價的細胞暴露于化合物24小時，并通過已知方法用直接測定法來測定細胞的存活部分。然后，從分析結(jié)果可以計算出IC50值。
圖6、10和12顯示了本發(fā)明的抗體-美登素類偶聯(lián)物的體外效力和靶特異性。因此，圖6顯示，huC242-DM3和huC242-DM4在殺死抗原陽性的COLO 205細胞中，均是高度有效的，IC50值分別是1.3×10-11M和1.1×10-11M。與之對照，抗原陰性的A-375細胞的敏感度低于大約500倍，這說明本發(fā)明的美登素類偶聯(lián)物是高度有效的和高度特異的。類似地，圖10和12分別說明，本發(fā)明的美登素類與抗體MY9-6和抗-B4的偶聯(lián)物的高效力和靶特異性。
在幾種不同的人腫瘤小鼠模型中，將本發(fā)明的含位阻硫醇的美登素類與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)和以前描述的美登素類偶聯(lián)物在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)進行比較。在第一個模型中(圖7)，用以前描述的美登素類DM1的抗體偶聯(lián)物(huC242-DM1)或用兩種新的美登素類偶聯(lián)物(huC242-DM3，huC242-DM4)，處理帶有已建立的人結(jié)腸腫瘤HT-29的皮下異種移植物的SCID鼠。用huC242-DM1進行處理，導(dǎo)致腫瘤生長延遲18天。與之相比，新藥劑顯著地更加有效，對于huC242-DM3，腫瘤生長延遲28天，對于huC242-DM4，腫瘤生長延遲36天。
在第二個模型中(圖8)，用以前描述的美登素類DM1的抗體偶聯(lián)物(huC242-DM1)或用兩種新的美登素類偶聯(lián)物(huC242-DM3，huC242-DM4)，處理帶有已建立的人結(jié)腸腫瘤COLO 205的皮下異種移植物的小鼠。用huC242-DM1處理，沒有導(dǎo)致腫瘤消退，使腫瘤生長延遲20天。與之對照，新藥劑顯著地更加有效。在huC242-DM3處理組中，腫瘤完全消退，持續(xù)了45天。huC242-DM4更加有效，導(dǎo)致所有被處理的小鼠痊愈。
在第三個模型中(圖9)，用以前描述的美登素類DM1的抗體偶聯(lián)物(MY-9-6-DM1)或用兩種新的美登素類偶聯(lián)物(MY-9-6-DM3，MY-9-6-DM4)，處理帶有已建立的人骨髓性白血病HL60的皮下異種移植物的小鼠。用MY-9-6-DM1處理沒有導(dǎo)致腫瘤消退，使腫瘤生長延遲5天。與之對照，新藥劑顯著地更加有效。導(dǎo)致腫瘤消退。MY-9-6-DM3和MY-9-6-DM4均使腫瘤生長延遲大于20天。
在第四個模型中(圖11)，在用HL-60細胞建立的皮下異種移植模型中，直接比較了本發(fā)明的美登素類(huMY9-6-DM4)和以前描述的美登素類的偶聯(lián)物(huMY9-6-DM1)的效應(yīng)。按照等同的劑量，用本發(fā)明的偶聯(lián)物MY9-6-DM4處理，導(dǎo)致完全的腫瘤消退，持續(xù)85天。與之相比，以前描述的美登素類的偶聯(lián)物的活性小得多，腫瘤生長延遲僅為大約48天。
在第五個模型中(圖13a)，在皮下Ramos腫瘤模型中，本發(fā)明的美登素類與huB4抗體的偶聯(lián)物以劑量依賴的方式，顯示出了高的抗腫瘤活性。在非毒性的劑量下，獲得了完全的腫瘤消退和痊愈(圖13a，b)。
上面五個效應(yīng)實驗的結(jié)果說明，用本發(fā)明的含受到空間位阻的硫醇的美登素類得到的細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，與以前描述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物相比，抗腫瘤活性大大改進。
組合物及應(yīng)用方法[202]本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括有效量的本發(fā)明的任何美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發(fā)明也提供了治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的上述的任意偶聯(lián)物。
類似地，本發(fā)明提供了用于在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，所述方法包括，用有效量的細胞毒性藥劑接觸靶細胞或含靶細胞的組織，所述細胞毒性藥劑含有本發(fā)明的任何美登素類-細胞結(jié)合劑、其鹽或溶劑化物。靶細胞是細胞結(jié)合劑可以與之結(jié)合的細胞。
如果需要，可以隨所述偶聯(lián)物給予其它的活性藥劑，如其它的抗腫瘤劑。
合適的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑是已知的，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以確定其臨床可用性。
合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的例子包括(1)Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水，pH大約是7.4，包含或不包含大約1mg/ml至25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％生理鹽水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且也可以包括抗氧化劑如色胺和穩(wěn)定劑如吐溫20。
用于在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，可以在體外(invitro)、體內(nèi)(in vivo)或離體(ex vivo)實施。
體外應(yīng)用的例子包括，為了殺死的病態(tài)或惡性的細胞，在向同一患者移植自體骨髓之前，處理自體骨髓；為了殺死感受性T細胞和預(yù)防移植物抗宿主病(GVDH)，在移植骨髓之前，處理骨髓；為了殺死除了不表達靶抗原的所需變異體之外的所有細胞，或為了殺死表達不期望的抗原的變異體，處理細胞培養(yǎng)物。
非臨床的體外應(yīng)用的條件，可以容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定。
臨床離體應(yīng)用的例子是，在癌癥治療或自身免疫病治療中，在自體移植前，從骨髓中去除腫瘤細胞或淋巴細胞，或為了預(yù)防GXDH，在移植前從自體或同種異體的骨髓或組織中去除T細胞和其它淋巴細胞。處理可以如下地進行。從患者或其它個體采集骨髓，然后在含血清的培養(yǎng)基中溫育，培養(yǎng)基中加入本發(fā)明的細胞毒劑，濃度范圍是大約10μM至1pM，在大約37℃，溫育大約30分鐘至大約48小時。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定確切的濃度條件和溫育時間，即劑量。溫育之后，用含血清的培養(yǎng)基洗滌骨髓細胞，并按照已知的方法經(jīng)靜脈輸回患者體內(nèi)。在采集骨髓和再輸入處理細胞的時期之間，如果患者接受其它治療如消融化療(ablative chemotherapy)或全身放療，則標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)療設(shè)備，在液氮中冷凍保存處理的骨髓細胞。
對于臨床的體內(nèi)用途，本發(fā)明的細胞毒劑將以溶液或凍干粉末被提供，它們經(jīng)過無菌性和內(nèi)毒素水平的檢測。給予偶聯(lián)物的合適的方案的例子如下。每周以靜脈彈丸的形式給予偶聯(lián)物，每周一次，持續(xù)4周。彈丸劑量是以50至1000ml的正常生理鹽水被給予的，其中可以加入5至10ml的人血清白蛋白。每次給予的劑量是10μg至2000mg，靜脈給予(每日劑量范圍是100ng至20mg/kg)。治療4周后，患者可以以周為單位繼續(xù)接受治療。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定臨床上允許的關(guān)于給予途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時間等的具體臨床方案。
根據(jù)在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的體內(nèi)或離體方法，可以被治療的醫(yī)學(xué)狀態(tài)的例子包括任何類型的惡性腫瘤，這包括，例如，肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌和淋巴器官癌；自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化；移植排斥，如腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病(graft versus host disease)；病毒感染，如CMV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生蟲感染，如賈第鞭毛蟲病、阿米巴病、血吸蟲病，和本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所確定的其它疾病。
實施例[214]現(xiàn)在，將參考非限制性的實施例來闡釋本發(fā)明。除非另有指明，所有的百分?jǐn)?shù)、比率、部分(parts)等等，都是按重量計。下面描述的實施例是針對R1是H或CH3，R2是CH3，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m的每一個是1和n是0的化合物而言的。對于本發(fā)明的其它化合物，可以進行類似的合成，在所述其它化合物中，R1和R2的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、或具有1至10個碳原子的更高級的烷基、烯基、或者苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；其中l(wèi)、m和n的每一個是從1至5的整數(shù)，此外n也可以是0。
所有的試劑購自新澤西州的Aldrich Chemical Co.，或來自其它商業(yè)來源。美登醇(11)是如以前所描述地制備的(美國專利6,333,410)。核磁共振(1H NMR)譜是在Bruker 400MHz設(shè)備上獲得的，質(zhì)譜是在Bruker Daltonics Esquire 3000設(shè)備上用電噴霧離子化獲得的。
實施例1美登素類4b的合成[216]4-巰基-4-甲基戊酸(7)將攪拌棒和150ml的添加漏斗裝配于500ml的燒瓶。將該體系放置在氮氣氛下。經(jīng)導(dǎo)管加入150ml無水四氫呋喃(THF)和75ml含2.5M n-BuLi的己烷(18.7mmol)，并在-78℃的干冰/丙酮浴中將溶液冷卻。在大約5分鐘的時間內(nèi)，經(jīng)注射器滴加乙腈(7.3g，9.4ml，18mmol)。當(dāng)白色的乙腈鋰沉淀形成時，攪拌反應(yīng)液30分鐘。將異丁烯基硫醚(15g，17mmol)溶于100ml無水THF中，并在大約30分鐘內(nèi)，經(jīng)添加漏斗滴加。移走冷卻浴，攪拌反應(yīng)液3小時。滴加38ml 0.5M HCl，同時在冰/水浴中冷卻燒瓶。保留THF層，用75ml乙酸乙酯洗滌水層兩次。合并THF層和乙酸乙酯層，用大約20g無水硫酸鈉進行干燥，并轉(zhuǎn)移至250ml的燒瓶中。在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到粗產(chǎn)物6。加入乙醇(30ml)和攪拌棒。當(dāng)緩慢加入含8.0g NaOH的30ml去離子水溶液時，攪拌內(nèi)容物。將回流冷凝器裝配于燒瓶并置于氬氣氛中。使反應(yīng)回流過夜，然后冷卻至室溫。加入去離子水(60ml)，用25mL的乙酸乙酯和己烷的2∶1混合物萃取混合物兩次。用濃HCl酸化水層至pH為2，之后用75ml的乙酸乙酯萃取三次。用無水Na2SO4干燥有機層，并在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到10g產(chǎn)物7(產(chǎn)率為39％)。應(yīng)用得到的物質(zhì)而無需進一步純化。1H NMR(CDCl3)δ1.38(6H，s)，1.87-1.93(2H，m)，2.08(1H，s)，2.51-2.57(2H，m)。
4-甲基-4-(甲基二硫代)戊酸(8)在250ml燒瓶中，將巰基戊酸7的溶液(6.0ml，40mmol)溶于50ml去離子水中。以不引起過度起泡的速度向酸中加入碳酸鈉(6.4g，60mmol)，并磁力攪拌。將100ml的添加漏斗裝配于燒瓶，漏斗中裝有甲基甲硫醇磺酸酯(7.5g，60mmol)的溶液，甲基甲硫醇磺酸酯溶于30ml的玻璃蒸餾(glass-distilled)的100％乙醇中。在冰/水浴中冷卻燒瓶，并在氬氣氛中維持該體系。盡可能快地將甲基甲硫醇磺酸酯溶液滴加至燒瓶中，但不引起過度的起泡。移除冷卻浴，再攪拌反應(yīng)混合物3小時。在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，直至保留大約20ml。隨后，加入10ml的飽和碳酸氫鈉和30ml的去離子水。在分液漏斗中，用25ml的乙酸乙酯洗滌混合物三次。用5MHCl調(diào)節(jié)水層至pH大約為2，并用120ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層并用20ml的溶液洗滌兩次，所述溶液由飽和NaCl和1M HCl以4∶1的比率組成。然后，用14g無水硫酸鈉干燥有機層，在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到5.4g產(chǎn)物8(產(chǎn)率是70％)?？梢詫⒃撐镔|(zhì)帶入下一步反應(yīng)，而無需進一步純化。1H NMR(CDCl3)δ1.54(6H，s)，2.5-2.21(2H，m)，2.64(3H，s)，2.69-2.72(2H，m)。MS(M+Na+)計算值217.0，實測值217.1。
N-羥基琥珀酰亞胺基4-甲基-4-(甲基二硫代)戊酸(9)將甲基二硫代戊酸8(3g，15mmol)溶于20ml的二氯甲烷中，并在加入N-羥基琥珀酰亞胺(2.65g，23mmol)時磁力攪拌，隨后加入鹽酸1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳亞二胺(EDC，4.4g，23mmol)。在氬氣氛下攪拌混合物2小時。將反應(yīng)混合物倒入125ml的分液漏斗中，加入40ml乙酸乙酯，用20ml的pH6.0的50mM磷酸鉀緩沖液洗滌溶液兩次，用12ml飽和氯化鈉洗滌溶液一次。用14g無水Na2SO4干燥有機層，并在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到4.0g產(chǎn)物9(產(chǎn)率為90％)，應(yīng)用產(chǎn)物9而無需進一步純化。1H NMR(CDCl3)δ1.30(6H，s)，2.00-2.05(2H，m)，2.39(3H，s)，2.68-2.72(2H，m)，2.73-2.83(4H，m)。MS(M+Na+)計算值314.0，實測值314.1。
N-甲基-N-(4-甲基-4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-L-丙氨酸(10)在配備有磁力攪拌棒的125ml燒瓶中，將N-甲基-L-丙氨酸(2.85g，18.0mmol)溶于二甲氧基乙烷和去離子水的1∶1溶液50ml中。加入三乙胺(6.9g，36mmol)，并滴加溶于40ml相同溶劑混合物的9(5.44g，18mmol)，同時劇烈攪拌該溶液，此過程為大約5分鐘。2小時之后，在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮反應(yīng)混合物至大約40ml，然后加入10ml去離子水和1M HCl，得到大約2的pH值。將混合物倒入分液漏斗中，用50ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層，隨后用7ml飽和氯化鈉溶液洗滌。用8.0g無水Na2SO4干燥有機層，并在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。使殘余物保留在最小體積的乙酸乙酯中，并通過二氧化硅上的層析純化(二氧化硅40微米規(guī)格(flash grade)，二氧化硅床24×3.0cm，流動相己烷∶乙酸乙酯∶乙酸為50∶48∶2)。合并含有所需產(chǎn)物的部分，在真空下去除溶劑。通過將殘余物溶解在最小體積的乙酸乙酯中并通過快速滴加己烷并同時攪拌來沉淀產(chǎn)物，去除殘留的乙酸。加入己烷，直至經(jīng)TLC分析，上清液中檢測不到產(chǎn)物。真空干燥沉淀物4小時，得到2.2g產(chǎn)物10(產(chǎn)率是51％)。1HNMR(CDCl3)δ1.32(6H，s)，1.42(3H，d，J＝7Hz)，1.90-97(2H，m)，2.40(3H，s)，2.42-2.49(2H，m)，2.9(3H，s)，5.15(1H，q，J＝7Hz)。MS(M+Na+)計算值302.1，實測值302.0。
N2’-脫乙酰-N2’-(4-甲基-4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(L-DM4-SMe，4e)。在氬氣氛下，磁力攪拌含有美登醇(11，25mg，0.44mmol)和N-甲基-N-(4-甲基-4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-L-丙氨酸(10，42.0mg，0.177mmol)的3mL二氯甲烷溶液，同時加入含有二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，57.1g，0.277mmol)的0.67ml二氯甲烷溶液。1分鐘之后，加入含有1M ZnCl2的二乙醚(0.03ml，0.03mmol)溶液。在室溫下攪拌混合物2小時，隨后加入5ml乙酸乙酯，經(jīng)course濾紙真空過濾混合物。用2ml飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾過物，隨后用1ml飽和氯化鈉溶液洗滌。用2g無水硫酸鈉干燥有機層。在真空下去除溶劑，并用二氯甲烷和乙醇的混合物經(jīng)二氧化硅層析純化殘余物，以去除未反應(yīng)的美登醇。合并含有所需產(chǎn)物的部分，并在真空下去除溶劑，以得到非對映異構(gòu)體4e和4f的混合物。將殘余物吸收到最小體積的乙酸乙酯中，并用比率為68∶8∶24的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯的混合物作為流動相，在50cm乘250cm、10微米DiazemTMCN柱上純化。流速是118mL/min。在這些條件下，所需產(chǎn)物4e在保留時間11分鐘時被洗脫出來，不需要的對映異構(gòu)體4f的保留時間是19分鐘。合并含有所需產(chǎn)物的部分，在真空下去除溶劑，得到12.0mg產(chǎn)物4e(產(chǎn)率是36％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.28-1.36(13H，m)，1.42-1.46(2H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.75-1.85(1H，m)，1.90-2.10(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.31(3H，s)，2.40-2.49(1H，m)，2.50-2.65(1H，m)，2.85(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。高分辨率MS(M+H+)計算值826.3174，實測值826.3150。
N2’-脫乙酰-N2’-(4-巰基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(L-DM4，4b)將上面得到的二硫化物4e(12mg，0.015mmol)溶解在1.0ml的1∶1乙酸乙酯∶甲醇中。然后，加入溶于0.50mL 50mM磷酸緩沖液pH7.5的二硫蘇糖醇(18mg，0.117mmol)溶液。在氬氣氛下磁力攪拌溶液3小時，然后加入1mL 200mM磷酸緩沖液，pH 6.0，用2mL的乙酸乙酯萃取該混合物三次。合并有機層并用1mL飽和氯化鈉溶液洗滌，隨后用1g無水硫酸鈉干燥。在真空下去除溶劑，將殘余物吸收到最小體積的乙酸乙酯中，并用比率為70∶8∶22的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯混合物作為流動相，在50cm×250cm、10微米DiazemTMCN柱上純化。流速是22mL/min。所需產(chǎn)物4b在保留時間10分鐘時被洗脫出來。合并含有純化的4b的部分，在真空下去除溶劑，得到11mg 4b(產(chǎn)率是97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.19-1.23(1H，m)，1.28-1.36(12H，m)，1.42-1.46(2H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.75-1.85(1H，m)，1.90-2.10(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.40-2.49(1H，m)，2.50-2.65(2H，m)，2.88(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。高分辨率MS(M+Na+)計算值802.3101，實測值802.3116。
實施例2美登素類4a的合成[222]4-甲基二硫代-戊酸(13)在500mL的燒瓶中，將4-巰基戊酸(12，16.6mg，124mmol)溶液溶于350mL去離子水中。磁力攪拌該溶液，同時向該酸中加入碳酸鈉(19.7g，186mmol)，碳酸鈉加入的速度不引起過度起泡。將250ml的添加漏斗裝配于燒瓶，漏斗中裝有甲基甲硫醇磺酸酯(23.4g，186mmol)溶液，其溶于220ml玻璃蒸餾的100％乙醇中。在冰/水浴中冷卻燒瓶，并在氬氣氛中維持該體系。盡可能快地將甲基甲硫醇磺酸酯溶液滴加至燒瓶中，但滴加速度不致于引起過度的起泡。移走冷卻浴，再攪拌反應(yīng)混合物2小時。在真空下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，直至留下大約250ml。隨后，加入30ml飽和碳酸氫鈉溶液和50ml去離子水。在分液漏斗中，用200ml的乙酸乙酯洗滌該混合物三次。用5M HCl調(diào)節(jié)水層至pH大約為2，并用400ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層，再用60ml的飽和NaCl溶液和1M HCl的4∶1混合物洗滌，然后，用50g無水硫酸鈉干燥，最后，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到10.2g的產(chǎn)物13(產(chǎn)率是45％)。在下一反應(yīng)中應(yīng)用該物質(zhì)，而不需進一步純化。1H NMR(CDCl3)δ1.36(3H，d，J＝7Hz)，1.84-1.95(H，m)，1.85-2.56(1H，m)，2.42(3H，s)，2.53(2H，t，J＝7Hz)，2.85-2.95(1H，m)，MS(M+Na+)計算值203.3，實測值203.2。
N-羥基琥珀酰亞胺基4-甲基二硫代-戊酸酯(14)將甲基二硫代-戊酸(13，0.75g，4.16mmol)溶于7.0ml二氯甲烷中，磁力攪拌，同時加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.526g，4.57mmol)，隨后加入鹽酸1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳亞二胺氫氯化物(0.877g，4.57mmol)。在氬氣氛下攪拌混合物2.5小時，然后將混合物倒入60ml的分液漏斗中，分液漏斗中含有20mL的乙酸乙酯。用15ml的pH6.0的50mM磷酸鉀緩沖液洗滌得到的溶液兩次，用5ml飽和氯化鈉洗滌一次。用8g無水Na2SO4干燥有機層，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到1.15g產(chǎn)物14(產(chǎn)率為87％)，其可以被用于下一反應(yīng)而無需進一步純化。1HNMRδ1.48(3H，d，J＝7)，2.06(1H，m)，2.17(1H，m)，2.55(3H，s)，2.93(2H，t，J＝7)，2.98(4H，s)，3.15(1H，m)。MS(M+Na+)計算值304.1，實測值304.0。
N-甲基-N-(4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-L-丙氨酸(15)在配備有磁力攪拌棒的125ml燒瓶中，將N-甲基-L-丙氨酸(0.64g，6.2mmol)溶于二甲氧基乙烷和去離子水的1∶1混合液8ml中。加入三乙胺(0.841g，8.3mmol)，劇烈攪拌該燒瓶，同時滴加溶于8ml相同溶劑混合物的14(1.0g，3.6mmol)的溶液，此過程大約5分鐘。2小時之后，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮反應(yīng)混合物至大約3ml，然后加入15ml去離子水和1M HCl，得到大約2的pH值。將混合物倒入60mL的分液漏斗中，用15ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層，用3ml飽和氯化鈉溶液洗滌，隨后用8.0g無水Na2SO4干燥，最后，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。將殘余物吸收到最小體積的乙酸乙酯中，并經(jīng)二氧化硅層析純化(二氧化硅40微米flash grade，二氧化硅床24×3.0cm，流動相己烷∶乙酸乙酯∶乙酸為50∶48∶2)。合并含所需產(chǎn)物15的部分，在真空下去除溶劑。通過將殘余物溶解在最小體積的乙酸乙酯中并沉淀產(chǎn)物，去除殘留乙酸，沉淀產(chǎn)物是通過快速滴加己烷并同時攪拌而實施的。加入己烷，直至經(jīng)TLC分析上清液中檢測不到產(chǎn)物。真空干燥沉淀物，得到0.60g產(chǎn)物15(產(chǎn)率是62％)。1H NMR(CDCl3)δ1.35(3H，d，J＝7)，1.41(3H，d，J＝7)，1.94-2.03(2H，m)，2.43(3H，s)，2.50-2.55(2H，m)，2.83-2.93(1H，m)，2.98(3H，s)，5.14(1H，q，J＝7)。MS(M+Na+)計算值288.1，實測值288.1。
N2’-脫乙酰-N2’-(4-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(L-DM3-SMe，4c)在氬氣氛下，磁力攪拌含有美登醇(25mg，0.44mmol)和15(42.0mg，0.177mmol)的3mL二氯甲烷溶液，同時加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，57.1g，0.277mmol)在0.67ml二氯甲烷中的溶液。1分鐘之后，加入含有1M ZnCl2的二乙醚(0.03ml，0.03mmol)溶液。在室溫下攪拌混合物2小時，隨后加入5ml乙酸乙酯，經(jīng)course濾紙真空過濾混合物。用2ml飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾過物，隨后用1ml飽和氯化鈉溶液洗滌。用2g無水硫酸鈉干燥有機層，然后在真空下去除溶劑。用二氯甲烷和甲醇的混合物經(jīng)二氧化硅層析純化殘余物，以去除未反應(yīng)的美登醇。合并含有所需產(chǎn)物的部分，并在真空下去除溶劑，得到非對映異構(gòu)體4c和4d的混合物。將殘余物吸收到最小體積的乙酸乙酯中，并用比率為68∶8∶24的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯混合物作為流動相，在50cm乘250cm、10微米DiazemTMCN柱上純化。流速是118mL/min。所需產(chǎn)物4c在保留時間11分鐘時被洗脫出來，不需要的對映異構(gòu)體4d的保留時間是19分鐘。合并含有所需產(chǎn)物的部分，在真空下去除溶劑，得到12.0mg產(chǎn)物4c(產(chǎn)率是36％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.19-1.23(1H，m)，1.28-1.36(9H，m)，1.42-1.46(1H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.80-1.89(1H，m)，1.90-2.09(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.32(3H，s)，2.33-2.42(1H，m)，2.49-2.62(2H，m)，2.88(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。MS(M+Na+)計算值834.3，實測值834.3。
N2’-脫乙酰-N2’-(4-巰基-1-氧代戊基)-美登素(L-DM3，4a)將L-DM3-SMe(4c，12mg，0.015mmol)溶解在1.0ml的1∶1乙酸乙酯∶甲醇混合物中。加入溶于pH 7.5的0.50ml 50mM磷酸緩沖液的二硫蘇糖醇(18mg，0.117mmol)溶液。在氬氣氛下磁力攪拌反應(yīng)液3小時，然后加入1mL 200mM磷酸緩沖液，pH 6.0，用2mL的乙酸乙酯萃取混合物三次。合并有機層并用1mL飽和氯化鈉溶液洗滌，隨后用1g無水硫酸鈉干燥。在真空下去除溶劑，將殘余物吸收到最小體積的乙酸乙酯中，并用比率為70∶8∶22的己烷、2-丙醇和乙酸乙酯混合物作為流動相，在50cm×250cm、10微米DiazemTMCN柱上純化。流速是22mL/min。所需產(chǎn)物在保留時間10分鐘時被洗脫出來。合并含有純化產(chǎn)物的部分，在真空下去除溶劑，得到11mg的產(chǎn)物4a(產(chǎn)率是97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.80(3H，s)，1.19-1.23(1H，m)，1.28-1.36(9H，m)，1.42-1.46(1H，m)，1.53-1.63(2H，m)，1.64(3H，s)，1.80-1.89(1H，m)，1.90-2.09(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝3Hz和14Hz)，2.33-2.42(1H，m)，2.49-2.62(2H，m)，2.88(3H，s)，3.04(1H，d，J＝9Hz)，3.11(1H，d，J＝11Hz)，3.23(3H，s)，3.35(3H，s)，3.49(1H，d，J＝9Hz)，3.63(1H，d，J＝12Hz)，3.98(3H，s)，4.27(1H，t，J＝10Hz)，4.79(1H，dd，J＝3Hz和12Hz)，5.41(1H，q，J＝7Hz)，5.66(1H，dd J＝9Hz和15Hz)，6.21(1H，s)，6.42(1H，dd，J＝11Hz和15Hz)，6.65(1H，d，J＝1.5Hz)，6.73(1H，d，J＝11Hz)，6.81(1H，d，J＝1.5Hz)。MS(M+Na+)計算值788.3，實測值788.3。
實施例3美登素類4g、4h的合成(圖3c)[227]R-1，3-二-O-對甲苯磺酰-丁烷(17)在0℃，在氬氣氛下，用對甲苯磺酰氯(12.70g，66.84mmol)處理溶于無水吡啶(40mL)和無水甲苯(60mL)的混合物的R-(-)-1，3-丁二醇(16，2.00g，22.22mmol)溶液。在0℃攪拌5分鐘后，室溫攪拌2小時，在真空下蒸發(fā)混合物，再溶解在乙酸乙酯中，并用0.1M含水NaHCO3洗滌，隨后用飽和NaCl洗滌。用MgSO4干燥有機層，過濾，蒸發(fā)溶劑。在硅膠上經(jīng)層析純化，用1∶2(v/v)乙酸乙酯/己烷洗脫，得到6.51g(74％)的標(biāo)題產(chǎn)物17。
Rf＝0.40(1∶1EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)7.76(dd，4H，J＝1.0，8.0Hz)，7.35(dt，4H，J＝0.4，8.0+8.0Hz)，4.70(m，1H)，4.03(m，1H)，3.94(m，1H)，2.46(s，6H)，1.92(m，2H)，1.26(d，3H，J＝6.3Hz)；13C NMR 145.17，133.00，130.11，128.12，127.91，76.28，66.21，36.08，21.86，21.06；MS420.99(M+Na)+，421.93(M+1+Na)+。
S-4-O-乙基黃原酸-戊腈(S-4-O-Ethylxanthic-pentanenitrile)(18)用NaCN(0.65)處理溶于無水DMSO(50mL)中的R-1，3-二-O-對甲苯磺酰-丁烷(17，4.80g，12.06mmol)的溶液。在氬氣氛下，室溫攪拌18小時后，用乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，連續(xù)用冷的pH 7.5的1.0M NaH2PO4、水和pH 4.0的1.0M NaH2PO4洗滌。分離有機層并用MgSO4干燥，過濾，然后蒸發(fā)，得到2.63g粗產(chǎn)物R-3-O-對甲苯磺酰-戊腈。MS 275.80(M+Na)+，276.75(M+1+Na)+。直接應(yīng)用產(chǎn)物而不需進一步純化。
向粗產(chǎn)物R-3-O-對甲苯磺酰-戊腈(2.63g)的乙醇(15ml)溶液中，加入含有O-黃原酸乙酯鉀(potassium O-ethylxanthate)(4.55g)的乙醇(50ml)。在氬氣氛下攪拌過夜之后，濃縮該混合物，用乙酸乙酯稀釋，通過短的二氧化硅柱進行過濾。濃縮洗脫物并經(jīng)硅膠層析而純化，用1∶4(v/v)的EtOAc/己烷洗脫，得到1.54g標(biāo)題產(chǎn)物18(63％，2步)。Rf＝0.40(1∶4EtOAc/己烷)。1H NMR(CDCl3)4.67(dd，2H，J＝7.1，14.2Hz)，3.86(ddd，1H，J＝7.0，14.0，21.9Hz)，2.50(t，2H J＝7.3+7.6Hz)，2.06(m，2H)，1.44(m，6H)；13C NMR 213.04，119.16，70.28，44.57，32.10，20.20，15.21，13.93；MS226.51(M+Na)+，242.51(M+K)+。
S-(+)-4-甲基二硫代-戊酸(19)向含有S-4-O-乙基黃原酸-戊腈(18，1.95g(9.61mmol))的乙醇(10ml)和水(150ml)的混合物的溶液中，加入5.0g NaOH。在氬氣氛下，回流反應(yīng)混合物過夜。冷卻混合物至室溫，用水(150ml)稀釋，用1∶1的EtOAc/己烷(2×100ml)萃取。用H3PO4酸化水層至pH 2.5-3.0，并用EtOAc(6×75ml)萃取。合并有機層，用MgSO4干燥，過濾和蒸發(fā)至干燥，得到粗產(chǎn)物S-4-巰基戊酸。將粗產(chǎn)物直接用于下一步驟而不需進一步純化。
在0℃，在45分鐘的時間內(nèi)，向粗提的S-4-巰基戊酸(1.2g)溶于乙醇(50ml)和0.5M NaH2PO3pH 7.0(75mL)的混合物的溶液中，滴加含有甲基甲硫醇磺酸酯(1.47g，11.65mmol)的5無水TNF(5ml)。在0℃，在氬氣氛下攪拌30分鐘之后，濃縮混合物并用二氯甲烷(2×50ml)萃取。用H3PO4酸化水層至pH 2.5-3.0，并用EtOAc(4×100ml)萃取。合并有機層，用MgSO4干燥，過濾和蒸發(fā)。經(jīng)硅膠層析純化殘留物，用(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)洗脫，得到1.43g(83％)的標(biāo)題產(chǎn)物19。Rf＝0.32(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)2.91(ddd，1H，J＝6.8，13.7，20.5Hz)，2.53(t，2H，J＝7.7+7.4Hz)，2.42(s，3H)，1.94(m，2H)，1.36(d，3H，J＝6.8Hz)；13C NMR 179.18，45.35，31.58，30.73，24.70，21.05；MS202.92(M+Na)+，203.91(M+1+Na)+；[α]＝41.35(c＝2，CH3OH)。
N-甲基-N-[4-(S)-甲基二硫代-1-氧代戊基]-S-丙氨酸(15a)用上面針對化合物14而描述的方法，將S-(+)-4-(甲基二硫代)-戊酸(19)轉(zhuǎn)變?yōu)镹-羥基琥珀酰亞胺酯20。通過上面針對化合物15而描述的方法，與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到15a，(產(chǎn)率是62％)。H1NMRδ1.36(3H，d，J＝7)，1.42(3H，d，J＝7)，1.93-1.98(2H，m)，2.40(3H，s)，2.50-2.53(2H，m)，2.90-2.95(1H，m)，2.99(3H，s)，5.14(1H，q，J＝7)，MS(M+Na)計算值288.1，實測值288.1。
N2’-脫乙酰-N2’-(4-(S)-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(DM3-SMe，4g，h)如上述的4c的合成，應(yīng)用含有DCC和氯化鋅的二氯甲烷，連接美登醇(11)和15a。獲得帶有N-甲基-S-丙氨酰部分(4g，S，S)和N-甲基-R-丙氨酰部分(4h，R，S)的2種非對映異構(gòu)體的混合物。用己烷∶乙酸乙酯∶2-丙醇(68∶24∶8，v/v/v)進行等強度洗脫，流速是1mL/min，通過Kromasil氰柱(4.6mm×250mm)上的HPLC分離非對映異構(gòu)體。在這些條件下，異構(gòu)體4g(S，S)在24.5分鐘時被洗脫出來。質(zhì)譜m/z 834.2(M+Na)+。在34.6分鐘時，另一異構(gòu)體4H(R，S)的峰被很好地分離和洗脫出來。MSm/z 834.2(M+Na)+。
實施例4美登素類4k，l的合成(圖3d)[234]S-1，3-二-O-對甲苯磺酰-丁烷22在0℃，在氬氣氛下，用對甲苯磺酰氯(12.70g，66.84mmol)處理S-(-)-1，3-丁二醇(21，2.00g(22.22mmol))溶于無水吡啶(40ml)和無水甲苯(60ml)混合物的溶液。在0℃下攪拌5分鐘后，室溫攪拌2小時，在真空下蒸發(fā)混合物。將殘留物在乙酸乙酯中再溶解，用0.1M含水NaHCO3和飽和NaCl洗滌。分離有機層，用MgSO4干燥，過濾并蒸發(fā)。通過硅膠層析純化殘余物，用1∶2乙酸乙酯/己烷洗脫，得到6.25g(71％)的標(biāo)題產(chǎn)物22。Rf＝0.40(1∶1EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)7.76(dd，4H，J＝1.0，8.0Hz)，7.35(dt，4H，J＝0.4，8.0+8.0Hz)，4.70(m，1H)，4.03(m，1H)，3.94(m，1H)，2.46(s，6H)，1.92(m，2H)，1.26(d，3H，J＝6.3Hz)；13C NMR145.17，133.00，130.11，128.12，127.91，76.28，66.21，36.08，21.86，21.06；MS420.99(M+Na)+。
R-4-O-乙基黃原酸-戊腈(23)用NaCN(0.85g)處理S-1，3-二-O-對甲苯磺酰-丁烷(22，6.25g(15.70mmol))在60無水DMSO(50mL)中的溶液。在氬氣氛下，室溫攪拌反應(yīng)混合物18小時。然后，用乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，連續(xù)用冷的pH 7.5的1.0M NaH2PO4、水和pH 4.0的1.0M NaH2PO4洗滌。用MgSO4干燥有機層，過濾，蒸發(fā)，得到3.62g粗產(chǎn)物S-3-O-對甲苯磺酰-戊腈。直接應(yīng)用產(chǎn)物而不需進一步純化。
向含有粗產(chǎn)物S-3-O-對甲苯磺酰-戊腈(3.62g)的乙醇(50ml)溶液中，加入含有O-黃原酸乙酯鉀(5.72g)的乙醇(100ml)。在氬氣氛下攪拌過夜之后，濃縮混合物，用乙酸乙酯稀釋，并經(jīng)過短的硅膠柱過濾。濃縮洗脫物并經(jīng)硅膠層析純化殘余物，用1∶4的EtOAc/己烷洗脫，得到2.0g的標(biāo)題產(chǎn)物23(62％，2步)。Rf＝0.40(1∶4EtOAc/己烷)。1H NMR(CDCl3)4.67(dd，2H，J＝7.1，14.2Hz)，3.86(ddd，1H，J＝7.0，14.0，21.9Hz)，2.50(t，2H J＝7.3+7.6Hz)，2.06(m，2H)，1.44(m，6H)；13C NMR 213.04，119.16，70.28，44.57，32.10，20.20，15.21，13.93；MS226.51(M+Na)+，242.51(M+K)+。
R-(-)-4-甲基二硫代-戊酸(24)用NaOH(6.0g)處理含有R-4-O-乙基黃原酸-戊腈(23，2.0g(9.85mmol))的乙醇(10ml)和水200ml的混合物的溶液。在氬氣氛下，回流反應(yīng)混合物過夜。用水(150ml)稀釋混合物并用1∶1的EtOAc/己烷(2×100ml)萃取。用H3PO4酸化水層至pH 2.5-3.0，并用EtOAc(6×75ml)萃取。合并有機層，經(jīng)MgSO4干燥，過濾和蒸發(fā)至干燥，得到粗產(chǎn)物R-4-巰基戊酸。將粗產(chǎn)物直接用于下一步驟而不需進一步純化。
在0℃，在45分鐘的時間內(nèi)，向含有1.60g粗提的R-4-巰基戊酸的乙醇(50ml)和0.5M NaH2PO4pH 7.0(75mL)的混合物的溶液中，滴加含有甲基甲硫醇磺酸酯(1.96g，15.53mmol)的無水TNF(7ml)。在0℃，在氬氣氛下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時。濃縮混合物并用二氯甲烷(2×50ml)萃取。用H3PO4酸化水層至pH 2.5-3.0，用EtOAc(4×100ml)萃取。合并有機層，經(jīng)MgSO4干燥，過濾和蒸發(fā)。經(jīng)硅膠層析純化殘留物，用(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)洗脫，得到1.65g(93％)的標(biāo)題產(chǎn)物24。Rf＝0.32(1∶100∶400的HOAc/EtOAc/己烷)；1H NMR(CDCl3)2.91(ddd，1H，J＝6.8，13.7，20.4Hz)，2.53(t，2H，J＝7.7+7.4Hz)，2.42(s，3H)，1.96(m，2H)，1.36(d，3H，J＝6.8Hz)；13C NMR 179.46，45.67，31.91，31.07，25.02，21.36；MS202.9(M+Na)+，203.9(M+1+Na)+；[α]＝-39.16(c＝2，CH3OH)。
N-甲基-N-[4-(R)-甲基二硫代-1-氧代戊基]-S-丙氨酸(15b)用上述的針對化合物14的方法，將R-(+)-4-(甲基二硫代)-戊酸(24)轉(zhuǎn)變?yōu)镹-羥基琥珀酰亞胺酯25。通過上述針對化合物15的方法，與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到15b。MSm/z(M+Na)計算值288.1，實測值288.1。
N2’-脫乙酰-N2’-(4-(R)-甲基二硫代-1-氧代戊基)-美登素(DM3-SMe，4k，l)如上述的4c的合成，應(yīng)用溶于二氯甲烷中的DCC和氯化鋅，連接美登醇(11)和15b。獲得帶有N-甲基-S-丙氨酰部分(4k，S，R)和N-甲基-R-丙氨酰部分(4l，R，R)的2種非對映異構(gòu)體的混合物。用己烷∶乙酸乙酯∶2-丙醇(68∶24∶8，v/v/v)等強度洗脫，在Kromasil氰柱(4.6mm×250mm)上經(jīng)HPLC分離非對映異構(gòu)體，流速是1mL/min。在這些條件下，異構(gòu)體4k(S，R)在23.9分鐘時被洗脫出來。質(zhì)譜m/z 834.2(M+Na)+。在33.7分鐘時，另一異構(gòu)體4l(R，R)的峰被很好地分離和洗脫出來。MSm/z 834.2(M+Na)+。
實施例5a美登素類和抗體-美登素類偶聯(lián)物的體外細胞毒性[241]KB(ATCC CCl-17)細胞系是人上皮來源。SK-BR-3(ATCCHTB-30)細胞系是由人乳腺腺癌建立的。人結(jié)腸腫瘤細胞系COLO 205(ATCC CCL-222)和HT-29(ATCC HTB 38)、人黑素瘤細胞系A(chǔ)-375(ATCC CRL 1619)、人伯基特淋巴瘤細胞系Ramos(ATCC CRL-1596)和人骨髓性白血病細胞系HL 60(ATCC CCL-240)均是從馬里蘭州的ATCC獲得的。細胞系是在帶有L-谷氨酰胺的Dulbecco′s modifiedEagles Medium(DMEM，Biowhittaker，Walkersville，MD)中生長的，培養(yǎng)基中補充有10％的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)和50μg/ml的硫酸慶大霉素(Life Technologies，Rockville，MD)。在含有6％CO2的潮濕氣氛中，于36-37.5℃保持細胞。
進行的細胞毒性研究應(yīng)用的是克隆形成試驗(clonogenic assay)。以每孔1000個細胞的固定數(shù)值，將測試細胞系鋪在6孔培養(yǎng)皿中。用各種美登素類(游離的或者偶聯(lián)于抗體的)的各種濃度(0至3nm)溫育細胞72小時。然后，從板中吸出培養(yǎng)基并放置新鮮的培養(yǎng)基。讓培養(yǎng)物生長并形成集落，鋪板后，維持7-10天。然后，用溶于10％福爾馬林/PBS的0.2％結(jié)晶紫固定并染色培養(yǎng)物，計集落數(shù)。用數(shù)出的集落數(shù)目除以被鋪的細胞數(shù)目，確定出非處理細胞(單獨的培養(yǎng)基)的鋪板效率。用暴露于藥物的孔中的集落數(shù)除以對照孔中的集落數(shù)，確定出暴露于藥物的細胞的存活分?jǐn)?shù)。
圖4顯示了本發(fā)明的新的美登素類的體外細胞毒性測定結(jié)果。對于被測試的細胞系，SK-BR-3和A-375，帶有具有位阻的二硫鍵的新的美登素類4c，e均是高度細胞毒性的，IC50值的范圍是從7×10-12M至2.5×10-11M。因此，在帶有二硫化物部分的碳上引入烷基取代基，保持了高的細胞毒力。本發(fā)明的含具有空間位阻的硫醇的美登素類4a，比以前描述的相應(yīng)的非位阻美登素類1的效力大30至50倍。因此，在帶有硫醇部分的碳上引入烷基取代基大大增加了效力。
圖4c和4d中顯示了本發(fā)明的美登素類的抗體偶聯(lián)物的體外測試結(jié)果。在針對人結(jié)腸腫瘤的huC242抗體上連接兩種新的美登素類，4a或4b，導(dǎo)致對靶細胞的抗原特異性殺傷。因此，這些偶聯(lián)物對于抗原陽性COLO 205細胞是高度有效的，IC50值的范圍是從1.1×10-11M至1.3×10-11M。與之對照，這些偶聯(lián)物對抗原陰性的A-375細胞的細胞毒性要小100至250倍，這說明，本發(fā)明的新的美登素類產(chǎn)生擁有具有空間位阻的二硫鍵的偶聯(lián)物，它們顯示出高度的靶向特異性的細胞毒性。
實施例5b用美登素類4a或4b制備huC242抗體的細胞毒性偶聯(lián)物(方法A，圖5a，b)[245]將huC242抗體(8mg/ml)在pH6.5的含水緩沖液(50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM乙二胺四乙酸二鈉鹽)中的溶液，與7至10倍的過量摩爾數(shù)的SPDP[琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯，3a]，或與N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫)-丁酸酯(SPDB，3b)溫育。反應(yīng)混合物通過Sephadex G25凝膠過濾柱而被純化。應(yīng)用抗體的已知的消光系數(shù)ε280nm＝217,560M-1cm-1，用分光光度法測定抗體濃度。
用pH 6.5的含水緩沖液(50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM乙二胺四乙酸二鈉鹽)稀釋修飾的抗體至2.5mg/ml，然后用二甲基乙胺中的1.5至2.5倍過量摩爾數(shù)的DM3或DM4處理(DMA的終濃度是3％v/v)。在室溫下溫育反應(yīng)混合物18小時。經(jīng)過Sephadex G25凝膠過濾柱純化反應(yīng)混合物。應(yīng)用抗體的已知消光系數(shù)ε280nm＝217,560M-1cm-1和ε252nm＝80,062M-1cm-1；DM3或DM4的已知消光系數(shù)ε280nm＝5,700M-1cm-1和ε252nm＝26,790M-1cm-1用分光光度法測定偶聯(lián)物的濃度。得到的偶聯(lián)物是單體的，并且，平均每個抗體分子連接有3.2-3.5個DM3或DM4。
實施例5c用美登素類4a或4b制備huC242抗體的細胞毒性偶聯(lián)物(方法B，圖5c)[247]將huC242抗體(8mg/ml)在pH6.5的含水緩沖液(50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM乙二胺四乙酸二鈉鹽)中的溶液，與7至10倍的過量摩爾數(shù)的SMCC[琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯，26]溫育2小時。經(jīng)過Sephadex G25凝膠過濾柱純化反應(yīng)混合物。用抗體的已知消光系數(shù)ε280nm＝217,560M-1cm-1，用分光光度法測定抗體濃度。
用pH 6.5的含水緩沖液(50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM乙二胺四乙酸二鈉鹽)稀釋修飾的抗體至2.5mg/ml，然后用二甲基乙胺中的1.5至2.5倍過量摩爾數(shù)的DM3或DM4處理(DMA的終濃度是3％v/v)。在室溫下溫育反應(yīng)混合物18小時。經(jīng)過Sephadex G25凝膠過濾柱純化反應(yīng)混合物。應(yīng)用已知的消光系數(shù)(對于抗體，ε280nm＝217,560M-1cm-1和ε252nm＝80,062M-1cm-1；對于DM3或DM4，ε280nm＝5,700M-1cm-1和ε252nm＝26,790M-1cm-1)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的濃度。得到的偶聯(lián)物是單體的，并且，平均每個抗體分子連接有3.2-3.5個DM3或DM4。
實施例5d用美登素類4a或4b制備huC242抗體的細胞毒性偶聯(lián)物(方法C，圖5d)[249]將huC242抗體(8mg/ml)在pH 6.5的含水緩沖液(50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM乙二胺四乙酸二鈉鹽)中的溶液，與7至10倍的過量摩爾數(shù)的SIAB[N-琥珀酰亞胺基4-(碘乙酰)-氨基苯甲酸酯，27]溫育2小時。經(jīng)過Sephadex G25凝膠過濾柱純化反應(yīng)混合物。用抗體的已知消光系數(shù)ε280nm＝217,560M-1cm-1，用分光光度法測定抗體濃度。
實施例6huC242-美登素類偶聯(lián)物在體內(nèi)抵抗HT-29異種移植物的效率[250]五周齡的雌性SCID鼠(20只動物)右側(cè)皮下接種HT-29人結(jié)腸癌細胞(1.5×106細胞/鼠)，所述細胞溶于0.1ml的無血清培養(yǎng)液中。讓腫瘤生長11天至平均體積為100mm3。然后，將動物隨機分為四組(每組五只動物)。第一組接受靜脈給予的huC242-DM1偶聯(lián)物(DM1的劑量是75μg/kg，qd×5)。第二組接受靜脈給予的huC242-DM3偶聯(lián)物(DM3的劑量是75μg/kg，qd×5)。第三組接受靜脈給予的huC242-DM4偶聯(lián)物(DM4的劑量是75μg/kg，qd×5)，第四組動物作為對照組并接受PBS，處理方案與組1-3中的方案相同。
每周兩次測定腫瘤的體積，用公式腫瘤體積＝1/2(長×寬×高)計算腫瘤體積。動物的體重也是每周測定兩次。結(jié)果顯示在圖7中。小鼠對照組的腫瘤在35天時生長至接近1000mm3的體積。用huC242-DM1處理，導(dǎo)致腫瘤生長延遲18天，而用本發(fā)明的美登素類4a和4b制成的偶聯(lián)物顯著地更有效，分別延遲腫瘤生長至28天和36天。
實施例7huC242-美登素類偶聯(lián)物在體內(nèi)抵抗COLO 205異種移植物的效率 五周齡的雌性SCID鼠(20只動物)右側(cè)皮下接種COLO 205人結(jié)腸癌細胞(1.5×106細胞/鼠)，所述細胞溶于0.1ml的無血清培養(yǎng)基中。讓腫瘤生長11天至平均體積為100mm3。然后，將動物隨機分為四組(每組五只動物)。第一組接受靜脈給予的huC242-DM1偶聯(lián)物(DM1的劑量是75μg/kg，qd×5)。第二組接受靜脈給予的huC242-DM3偶聯(lián)物(DM3的劑量是75g/kg，qd×5)。第三組接受靜脈給予的huC242-DM4偶聯(lián)物(DM4的劑量是75μg/kg，qd×5)，而第四組動物作為對照組接受PBS，處理方案與組1-3中的方案相同。[253]每周兩次測定腫瘤的體積，用公式腫瘤體積＝1/2(長×寬×高)計算腫瘤體積。動物的體重也是每周測定兩次。結(jié)果顯示在圖8中。小鼠對照組的腫瘤在24天時生長至接近900mm3的體積。用huC242-DM1處理，導(dǎo)致腫瘤生長延遲20天，而用本發(fā)明的美登素類4a制成的偶聯(lián)物顯著地更有效，引起持續(xù)45天的完全腫瘤消退。用本發(fā)明的美登素類4b制成的偶聯(lián)物甚至更有效，導(dǎo)致所有被治療動物痊愈。
實施例8MY9-6-美登素類偶聯(lián)物在體內(nèi)抵抗HL-60異種移植物的效率[254]五周齡的雌性SCID鼠(20只動物)右側(cè)皮下接種HL-60人骨髓性白血病細胞(1.5×106細胞/小鼠)，所述細胞溶于0.1ml的無血清培養(yǎng)基中。讓腫瘤生長12天至平均體積為100mm3。然后，將動物隨機分為四組(每組五只動物)。第一組接受靜脈給予的MY9-6-DM1偶聯(lián)物(DM1的劑量是200μg/kg，qd×5)。第二組接受靜脈給予的MY9-6-DM3偶聯(lián)物(DM3的劑量是200μg/kg，qd×5)。第三組接受靜脈給予的MY9-6-DM4偶聯(lián)物(DM4的劑量是200μg/kg，qd×5)，而第四組動物作為對照組接受PBS，處理方案與組1-3中的方案相同。
每周兩次測定腫瘤的體積，用公式腫瘤體積＝1/2(長×寬×高)計算腫瘤體積。動物的體重也是每周測定兩次。結(jié)果顯示在圖9中。小鼠對照組的腫瘤在21天快速生長至接近1600mm3的體積。用MY9-6-DM1處理，導(dǎo)致腫瘤生長延遲大約5天，而用本發(fā)明的美登素類4a和4b制成的偶聯(lián)物顯著地更有效，延遲腫瘤生長大于20天。
實施例9用美登素類DM4(4b)制備huMy9-6抗體的細胞毒性偶聯(lián)物[256]在含有2mM乙二胺四乙酸(緩沖液A)和5％乙醇的pH 6.550mM磷酸鉀溶液中，將濃度為8mg/ml的huMy9-6抗體溶液與6.5倍過量摩爾數(shù)的SSNPB[硫代琥珀酰亞胺4-(5′-硝基-2′-吡啶基二硫代)丁酸酯]溫育。修飾的抗體通過用緩沖液A平衡的Sephadex G25凝膠過濾柱而被純化，純化抗體的濃度利用抗體在280nm處的消光系數(shù)，用分光光度法測定。用緩沖液A將修飾的抗體稀釋至4.9mg/ml，并用1.7倍過量摩爾數(shù)的DM4室溫溫育18小時，DM4是以二甲基乙胺中的儲存液形式被加入反應(yīng)混合物中的(二甲基乙酰胺的終濃度是3％v/v)。經(jīng)過用pH6.5的PBS平衡的Sephadex G25柱，純化抗體-藥物偶聯(lián)物。用抗體和DM4的已知消光系數(shù)(對于抗體，ε280nm＝206,460M-1cm-1，ε252nm＝72,261M-1cm-1；對于DM4，ε280nm＝5,700M-1cm-1，ε252nm＝26,790M-1cm-1)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的濃度。得到的抗體-藥物偶聯(lián)物中，每個抗體分子平均有3.6個DM4分子。生物化學(xué)分析證明，抗體在偶聯(lián)后維持有大于94％的單體并具有結(jié)合親和性，這是與未被修飾的抗體相比較而言的，這可以利用流式細胞儀來測定。通過HPLC分析來測定沒有共價地連接于抗體的藥物(游離藥物)的量，發(fā)現(xiàn)其不到所有連接藥物的1％。
實施例10huMy9-6-DM4偶聯(lián)物的體外選擇性和效應(yīng)[257]用集落形成分析來檢測huMy9-6-DM4對CD33表達細胞(HL-60)和CD33陰性Namalwa細胞的細胞毒性，其中細胞殺傷活性是通過對處理后可以生長的集落數(shù)目進行定量而確定的。對于CD-33陽性HL-60人腫瘤細胞，huMy9-6-DM4顯示了體外有效的細胞殺傷活性(圖10)。對于CD33陰性人Namalwa細胞，沒有觀察到明顯的細胞毒性，這提示，CD33-依賴性細胞毒性歸因于偶聯(lián)物的抗-CD33抗體huMy9-6的特異性靶向作用。
實施例11SCID鼠中，huMy9-6-DM4偶聯(lián)物對抗HL60人腫瘤異種移植物的體內(nèi)效應(yīng)[258]在帶有人HL-60腫瘤異種移植物的SCID鼠中，測定了huMy9-6-DM4的體內(nèi)效應(yīng)。皮下注射HL-60細胞，讓腫瘤生長至平均體積為100mm3。經(jīng)靜脈輸送huMy9-6-DM4，每日一次，持續(xù)5天，劑量是圖11中指出的劑量。劑量是用偶聯(lián)物中的DM4的微克數(shù)來表示的，對應(yīng)地，每μgDM4有大約67μg的抗體劑量。測量腫瘤體積，將其作為治療效果的指示物，并監(jiān)測鼠的體重，以表示治療造成的毒性。在幾乎不引起毒性的劑量下，huMy9-6-DM4誘導(dǎo)人HL-60細胞異種移植物的腫瘤生長延遲時間延長(圖11)。也比較了huMy9-6-DM4的效應(yīng)和huMy9-6-DM1的效應(yīng)。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)huMy9-6-DM4比huMy9-6-DM1更有效。huMy9-6-DM4維持動物的完全緩解(CR)幾乎達60天，而用huMy9-6-DM1處理的動物在大約20天的CR之后復(fù)發(fā)。
實施例12用美登素類DM4(4b)制備huB4抗體的細胞毒性偶聯(lián)物[259]在含有2mM乙二胺四乙酸(緩沖液A)和5％的二甲基乙酰胺的pH 6.5的50mM磷酸鉀緩沖液中，將濃度為20mg/ml的huB4抗體溶液與8倍過量摩爾數(shù)的SSNPB[磺基琥珀酰亞胺4-(5′-硝基-2′-吡啶基二硫代)丁酸酯]溫育。經(jīng)過用緩沖液A平衡的Sephadex G25凝膠過濾柱，純化修飾的抗體，并利用抗體在280nm處的消光系數(shù)(199,560M-1cm-1)，用分光光度法測定純化的抗體的濃度。用緩沖液A將修飾的抗體稀釋至8mg/ml，并用1.7倍過量摩爾數(shù)的DM4室溫溫育3小時，DM4是以二甲基乙酰胺中的儲存液形式被加入反應(yīng)混合物中的(二甲基乙酰胺的終濃度是3％v/v)。經(jīng)過用pH 6.5的PBS緩沖液平衡的Sephadex G25柱和Sephadex S300柱，純化抗體-藥物偶聯(lián)物。用抗體(ε280nm＝199,560M-1cm-1；ε252nm＝67,850M-1cm-1)和DM4(ε280nm＝5,700M-1cm-1，ε252nm＝26,790M-1cm-1)的已知消光系數(shù)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的濃度。在得到的抗體-藥物偶聯(lián)物中，每個抗體分子平均有4.0個DM4分子。生物化學(xué)分析證明，抗體在偶聯(lián)之后多于98％的維持為單體并具有結(jié)合親和性，這是與未被修飾的抗體相比較而言的，這可以利用流式細胞儀來測定。通過HPLC分析來測定沒有共價連接于抗體的藥物(游離藥物)的量，其為總連接藥物的大約2％。
實施例13huB4-DM4偶聯(lián)物的體外選擇性和效應(yīng)[260]應(yīng)用基于MTT的分析，檢測huB4-DM4對CD-19表達細胞(Ramos)和CD-19陰性細胞系(Colo 205)的細胞毒性，其中細胞殺傷活性是通過對用偶聯(lián)物處理后殘留的存活細胞數(shù)目進行定量而確定的。存活細胞數(shù)目是用活體染料MTT溫育細胞后，經(jīng)分光光度法定量測定的。在體外HuB4-DM4顯示了對CD-19陽性Ramos人腫瘤細胞的有效的細胞殺傷活性(圖12)。對于CD-19陰性細胞，沒有觀察到明顯的毒性，這提示，CD-19依賴性細胞毒性歸因于抗CD-19抗體huB4的特異性靶向作用。
實施例14SCID鼠中，huB4-DM4偶聯(lián)物對抗Ramos人腫瘤異種移植物的體內(nèi)效應(yīng)[261]使用帶有已建立的人Ramos腫瘤異種移植物的SCID鼠，測定huB4-DM4的體內(nèi)效應(yīng)。皮下注射Ramos細胞，讓腫瘤生長至平均體積為100mm3。經(jīng)靜脈輸送huB4-DM4偶聯(lián)物，單次注射，劑量是圖13a中指出的劑量。劑量被表示為偶聯(lián)物中的DM4微克數(shù)，其對應(yīng)于每μg DM4大約44μg抗體的抗體劑量。測量腫瘤體積，將其作為治療效果的指示物，并監(jiān)測小鼠的體重，以提示治療造成的毒性。在高于50μg/kg的劑量，huB4-DM4引起所有動物中腫瘤的完全消退。在100μg/kg處理組中，動物的沒有可測到的疾病的狀態(tài)維持了大約35天，在兩個最高劑量組中，此狀態(tài)維持了超過55天。如果是按照被處理的動物的體重變化來判定毒性的話，則這些處理幾乎不造成這樣的變化(圖13b)。
權(quán)利要求
1.美登素類，其在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處，具有?；陌被醾?cè)鏈，該側(cè)鏈帶有?；鶊F，該?；鶊F帶有具有位阻的巰基，其中帶有硫醇功能基的?；荚泳哂幸粋€或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，取代基之一可以是H，并且其中所述酰基基團在羰基功能基和硫原子之間具有至少3個碳原子的線性鏈長度。
2.式4’所表示的化合物 其中Y’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B、D是具有3-10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少兩個不同時為0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
3.權(quán)利要求2所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，Z是H。
4.權(quán)利要求2所述的化合物，其中R1和R2是甲基，Z是H。
5.權(quán)利要求2所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，Z是-SCH3。
6.權(quán)利要求2所述的化合物，其中R1和R2是甲基，Z是-SCH3。
7.式(I-L)、(I-D)或(I-D，L)所表示的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，此外n可以是0；Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基、分支烷基或環(huán)烷基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；和May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處帶有側(cè)鏈的美登素類。
8.權(quán)利要求7所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是H。
9.權(quán)利要求7所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是H。
10.權(quán)利要求7所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是-SCH3。
11.權(quán)利要求7所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3。
12.權(quán)利要求1至11或12中的任一項所述的化合物，其中該化合物為式(I-L)所表示。
13.由式4所表示的化合物 其中Y代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，此外n可以是0；和Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
14.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是H。
15.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是H。
16.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0，Z是-SCH3。
17.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8的每一個是H，l和m是1，n是0，Z是-SCH3。
18.美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其包括至少一個連接于細胞結(jié)合劑的美登素類，其中所述細胞結(jié)合劑是用硫醇或二硫功能基被連接于美登素類的，所述硫醇或二硫功能基存在于?；陌被醾?cè)鏈的?；鶊F上，該?；陌被醾?cè)鏈存在于美登素類的C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基上，其中，所述的?；陌被醾?cè)鏈的?；鶊F具有硫醇或二硫功能基，它們位于帶有一個或兩個取代基的碳原子上，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，取代基之一可以是H，其中所述酰基基團在羰基功能基和硫原子之間具有至少3個碳原子的線性鏈長度。
19.權(quán)利要求18所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述細胞結(jié)合劑包括至少一個抗體結(jié)合位點。
20.權(quán)利要求19所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是MY9、抗-B4或C242。
21.權(quán)利要求19所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是人源化的或表面重構(gòu)的MY9、人源化的或表面重構(gòu)的抗-B4，或人源化的或表面重構(gòu)的C242。
22.美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中美登素類由式41’表示 其中Y1’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-，其中A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的或取代的芳基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；和l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0。
23.權(quán)利要求22所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述R1是H，R2是甲基。
24.權(quán)利要求22所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述R1和R2是甲基。
25.權(quán)利要求22、23或24中的任一項所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述細胞結(jié)合劑包括至少一個抗體結(jié)合位點。
26.權(quán)利要求25所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是MY9、抗-B4或C242。
27.權(quán)利要求25所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是人源化的或表面重構(gòu)的MY9、人源化的或表面重構(gòu)的抗-B4，或人源化的或表面重構(gòu)的C242。
28.美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其包括至少一個連接于細胞結(jié)合劑的美登素類，其中所述美登素類由式(II-L)、(II-D)或(II-D，L)表示 其中Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，此外n可以是0；和May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處帶有側(cè)鏈的美登素類。
29.權(quán)利要求28所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0。
30.權(quán)利要求28所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m是1；n是0。
31.權(quán)利要求28所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述美登素類由式(II-L)表示。
32.權(quán)利要求29所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述美登素類由式(II-L)表示。
33.權(quán)利要求30所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述美登素類由式(II-L)表示。
34.權(quán)利要求28至32或33中的任一項所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述細胞結(jié)合劑包括至少一個抗體結(jié)合位點。
35.權(quán)利要求34所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是MY9、抗-B4或C242。
36.權(quán)利要求34所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是人源化的或表面重構(gòu)的MY9、人源化的或表面重構(gòu)的抗-B4，或人源化的或表面重構(gòu)的C242。
37.美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述美登素類由式41表示 其中Y1代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，此外n可以是0。
38.權(quán)利要求37所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H，l和m的每一個是1，n是0。
39.權(quán)利要求37所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m是1；n是0。
40.權(quán)利要求37、38或39中的任一項所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述細胞結(jié)合劑包括至少一個抗體結(jié)合位點。
41.權(quán)利要求40所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是MY9、抗-B4或C242。
42.權(quán)利要求40所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其中所述抗體是人源化的或表面重構(gòu)的MY9、人源化的或表面重構(gòu)的抗-B4，或人源化的或表面重構(gòu)的C242。
43.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求18至24、28至33、37、38或39中的任一項所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
44.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求25所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
45.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求26所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
46.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求27所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
47.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求34所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
48.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求35所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
49.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求36所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
50.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求40所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
51.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求41所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
52.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求42所述的美登素類-細胞結(jié)合劑、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
53.用?；陌被釋γ赖撬仡愒贑-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處進行酯化的方法，所述的?；陌被岬孽；鶊F帶有被保護的巰基，其中帶有被保護的巰基的?；荚泳哂幸粋€或兩個取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外取代基之一可以是H，而且其中所述酰基基團在羰基功能基和硫原子之間具有至少3個碳原子的線性鏈長度，所述方法包括使美登素類在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處與?；陌被岱磻?yīng)，所述的酰化的氨基酸中的酰基基團帶有被保護的巰基。
54.酯化美登醇從而得到式42’的美登素類的方法 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)狀烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的或取代的芳基、或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，所述方法包括使結(jié)構(gòu)11的美登醇 在C-3處與式(III’-L)、(III’-D)或(III’-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2’代表(CR7CR8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；A、B和D的每一個獨立地是具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、單純的或取代的芳基，或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m、n、o、p、q、r、s和t的每一個獨立地是0或從1至5的整數(shù)，只要l、m、n、o、p、q、r、s和t中的至少2個不同時為0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
55.權(quán)利要求54所述的方法，其中式(I)的化合物表示為式(I-L)。
56.權(quán)利要求54所述的方法，其中R1是H，R2是甲基。
57.酯化美登素類從而生成式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)所表示的美登素類酯的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；和May是美登素類；所述方法包括使所述美登素類在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處，與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
58.權(quán)利要求57所述的方法，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m的每一個是1；n是0。
59.權(quán)利要求58的任一項所述的方法，其中式(I)的化合物表示為式(I-L)。
60.權(quán)利要求58所述的方法，其中所述式(III-L)的化合物是化合物15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
61.權(quán)利要求58所述的方法，其中所述式(III-D)的化合物是化合物15(R，S)、15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物。
62.權(quán)利要求58所述的方法，其中所述式(III-D，L)的化合物是用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
63.權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是通過下列過程制得的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
64.權(quán)利要求60所述的方法，其中所述化合物15a(S，S)是通過下列過程制得的，包括(1)將(R)-1，3-丁二醇轉(zhuǎn)變?yōu)?S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)將化合物19轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)。
65.權(quán)利要求60所述的方法，其中所述化合物15b(S，R)是通過下列過程制得的，包括(1)將(S)-1，3-丁二醇轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)將化合物24轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(3)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15b(S，R)。
66.權(quán)利要求61所述的方法，其中所述的15(R，S)和15(R，R)的混合物可以通過下列過程制得，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
67.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀齆-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物，是通過下列過程制成的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀齆-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
68.權(quán)利要求56所述的方法，其中R1和R2是甲基；R3、R4、R5和R6的每一個是H；l和m是1；n是0。
69.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的式(III-L)的化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10。
70.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的式(III-D)的化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10。
71.權(quán)利要求68所述的方法，其中所述的式(III-D，L)的化合物是含有外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
72.權(quán)利要求69、70或71中的任一項所述的方法，其中所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通過下列過程制得的，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈的陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，將化合物7轉(zhuǎn)變?yōu)槎蚧?；(4)將化合物8轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
73.通過權(quán)利要求57、58、59或60中的任一項所述的方法來制備美登素類的方法，進一步包括，如果存在非對映異構(gòu)體的話，分離非對映異構(gòu)體，以及在氰鍵合的二氧化硅上經(jīng)HPLC來純化美登素類。
74.制備美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過權(quán)利要求73的方法制備純化的美登素類，和使純化的美登素類與細胞結(jié)合劑反應(yīng)，所述細胞結(jié)合劑包含活性二硫基團或巰基基團。
75.權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的活性二硫基團是二硫吡啶基團或取代的二硫吡啶基團。
76.制備美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過權(quán)利要求72的方法制備純化的美登素類，和使純化的美登素類與細胞結(jié)合劑反應(yīng)，所述細胞結(jié)合劑包含馬來酰亞胺基團或鹵代乙?；鶊F。
77.酯化美登醇從而得到式42的美登素類的方法 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；所述方法包括使結(jié)構(gòu)11的美登醇 在C-3位置與式(III-L)、(III-D)或(III-D，L)的化合物反應(yīng) 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
78.權(quán)利要求77所述的方法，其中式(I)的化合物表示為式(I-L)。
79.權(quán)利要求77所述的方法，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m的每一個是1；n是0。
80.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述式(III-L)的化合物是化合物15a(S，S)、15b(S，R)或15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
81.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述式(III-D)的化合物是化合物15(R，S)、15(R，R)或15(R，S)和15(R，R)的混合物。
82.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述式(III-D，L)的化合物是用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
83.權(quán)利要求80所述的方法，其中所述的15a(S，S)和15b(S，R)的混合物是通過下列過程制備的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(14)；和(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
84.權(quán)利要求80所述的方法，其中所述的化合物15a(S，S)是經(jīng)下列方法制得的，包括(1)將(R)-1，3-丁二醇轉(zhuǎn)變?yōu)?S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)將化合物19轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)。
85.權(quán)利要求80所述的方法，其中所述的化合物15b(S，R)是經(jīng)下列方法制得的，包括(1)將(S)-1，3-丁二醇轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)將化合物24轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(3)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15b(S，R)。
86.權(quán)利要求81所述的方法，其中所述的15(R，S)和15(R，R)的混合物可以經(jīng)下列過程制得，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
87.權(quán)利要求82所述的方法，其中所述的用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物，是通過下列過程制備的，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀齆-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
88.權(quán)利要求77所述的方法，其中R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8的每一個是H；l和m是1；n是0。
89.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述的式(III-L)的化合物是含有N-甲基-L-丙氨酸的化合物10。
90.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述的式(III-D)的化合物是含有N-甲基-D-丙氨酸的化合物10。
91.權(quán)利要求77所述的方法，其中所述的式(III-D，L)的化合物是含有外消旋N-甲基丙氨酸的化合物10。
92.權(quán)利要求89、90或91中的任一項所述的方法，其中所述的含有N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10是通過下列過程制得的，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈的陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，將化合物7轉(zhuǎn)變?yōu)槎蚧?；(4)將化合物8轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
93.權(quán)利要求77、79或88中的任一項所述的制造美登素類的方法，進一步包括，如果存在非對映異構(gòu)體的話，分離非對映異構(gòu)體，以及在氰鍵合的二氧化硅上經(jīng)HPLC來純化美登素類。
94.制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過權(quán)利要求93的方法制造純化的美登素類，和使純化的美登素類與細胞結(jié)合劑反應(yīng)，所述細胞結(jié)合劑包含活性二硫基團或活性巰基基團。
95.權(quán)利要求94所述的方法，其中所述的活性二硫基團是二硫吡啶基團或取代的二硫吡啶基團。
96.制造美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的方法，包括通過權(quán)利要求93的方法制造純化的美登素類，和使純化的美登素類與細胞結(jié)合劑反應(yīng)，所述細胞結(jié)合劑包含馬來酰亞胺基團或鹵代乙?；鶊F。
97.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求18至24、28至33、37、38或39中的任一項所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
98.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求25所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
99.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求26所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
100.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求27所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
101.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求34所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
102.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求35所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
103.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求36所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
104.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求40所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
105.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求41所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
106.治療方法，其包括向需要治療的對象給予有效量的權(quán)利要求42所述的偶聯(lián)物、或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。
107.式III的化合物 其中Y2代表(CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2，其中R1和R2的每一個獨立地是CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性烷基或烯基、具有3至10個碳原子的分支的或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基，此外，R2可以是H；R3、R4、R5、R6、R7和R8的每一個獨立地是H、CH3、C2H5、具有1至10個碳原子的線性分支的或烷基或烯基、具有3至10個碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基、苯基、取代的苯基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基；l、m和n的每一個獨立地是從1至5的整數(shù)，另外n可以是0；和Z2是SR或-COR，其中R是具有1至10個碳原子的線性烷基、分支烷基或環(huán)烷基，或單純的或取代的芳基或雜環(huán)芳基或雜環(huán)烷基。
108.化合物10(S)、10(R)或外消旋的10。
109.制造含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10的方法，包括(1)使異丁烯基硫醚(5)與乙腈的陰離子反應(yīng)，得到化合物6；(2)水解化合物6，得到4-巰基-4-甲基戊酸(7)；(3)通過與甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，將化合物7轉(zhuǎn)變?yōu)槎蚧?；(4)將化合物8轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯9；和(5)使化合物9與N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的含N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸或外消旋的N-甲基丙氨酸的化合物10。
110.化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
111.制造化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(14)；和(3)使化合物14與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)和15b(S，R)的混合物。
112.化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
113.制造化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物的方法，包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；和(3)使化合物14與N-甲基-D-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15(R，S)和15(R，R)的混合物。
114.用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀腘-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，從而得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
115.制造用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團?；耐庀齆-甲基丙氨酸的方法，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物，該方法包括(1)使4-巰基戊酸(12)和甲基甲硫醇磺酸酯反應(yīng)，得到化合物13；(2)將化合物13轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯14；(3)使化合物14與外消旋的N-甲基丙氨酸反應(yīng)，得到所述的用帶有被保護的硫醇功能基的羧基基團酰化的外消旋N-甲基丙氨酸，其中帶有硫原子的碳中心或是外消旋的或是R手性或S手性的，以得到結(jié)構(gòu)15的化合物。
116.化合物15a(S，S)。
117.制造化合物15a(S，S)的方法，包括(1)將(R)-1，3-丁二醇轉(zhuǎn)變?yōu)?S)-4-(甲基二硫代)戊酸19；(2)將化合物19轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(20)；和(3)使化合物20與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15a(S，S)。
118.化合物15b(S，R)。
119.制造化合物15b(S，R)的方法，包括(1)將(S)-1，3-丁二醇轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-(甲基二硫代)戊酸24；(2)將化合物24轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷-羥基琥珀酰亞胺酯(25)；和(3)使化合物25與N-甲基-L-丙氨酸反應(yīng)，得到所述的化合物15b(S，R)。
120.藥物組合物，其包括有效量的權(quán)利要求2、8、13或108中的任一項所述的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
121.權(quán)利要求120所述的藥物組合物，進一步包括抗體。
122.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求18至24、28至33、37至40或41中的任一項所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
123.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求25所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
124.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求26所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
125.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求27所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
126.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求34所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
127.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求35所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
128.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求36所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
129.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求42所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
130.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求43所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
131.在所選擇的細胞群中誘導(dǎo)細胞死亡的方法，包括用有效量的權(quán)利要求44所述的美登素類-細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或其溶劑化物接觸靶細胞或含有靶細胞的組織。
全文摘要
公開了含硫醇和二硫化物的新的美登素類，其在帶有硫原子的α－碳原子上具有單烷基取代或雙烷基取代。也公開了用于合成這些新的美登素類的方法以及用于將這些新的美登素類連接于細胞結(jié)合劑的方法。美登素類－細胞結(jié)合劑偶聯(lián)物作為治療劑是有用的，其被特異性地輸送至靶細胞并且是細胞毒性的。與以前描述的藥劑相比，這些偶聯(lián)物在動物腫瘤模型中顯示了大大改進的治療效果。
文檔編號C07D498/16GK1956722SQ200480013488
公開日2007年5月2日 申請日期2004年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者W·C·威迪遜, R·V·J·沙利 申請人:伊繆諾金公司