專利名稱：：抗腫瘤活性成分陵水醇、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一類從中國南海甲藻中分離得到的新型長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物陵水醇A，B，C(lingshuiolA，B，C)和它們的制備方法及用途。該類化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有強(qiáng)烈的抑制作用，可作為一類研制新的抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，也可能作為治療各種臨床常見多發(fā)癌癥的藥物。
背景技術(shù)：
：甲藻是植物分類系統(tǒng)中的一個(gè)門。主要由甲藻類(Dinoflagellata)的運(yùn)動(dòng)性單細(xì)胞藻類所構(gòu)成。共分為5個(gè)綱，其中3綱為腐生，寄生或附著生種類，在海洋浮游生物中經(jīng)常出現(xiàn)的是甲藻綱(Dinophyceae)和縱裂甲藻綱(Desmophyceae)。甲藻門藻類全世界約有4000種，我國已查明的有251種，廣泛分布于我國東海和南海海域。前溝藻屬(Amphidiniumsp.)屬于環(huán)溝藻科，是一種寄生性微藻。對(duì)前溝藻屬甲藻化學(xué)成份的研究目前集中于其中的大環(huán)內(nèi)酯類和長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物，這兩類化合物都具有顯著生物活性。陵水醇A，B，C(lingshuiolA，B，C)是首次從我國南海前溝藻屬甲藻中提取分離出來新型長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物，第一個(gè)結(jié)構(gòu)類似物amphidinol1于1991年見諸報(bào)道，它具有很強(qiáng)的生物活性，對(duì)真菌Aspergillusniger的抑制作用是兩性霉素B(amphotericinB)的3倍，其溶血活性為Merck標(biāo)準(zhǔn)皂苷的120倍。另一個(gè)類似物amphidinol2也顯示出類似生物活性，能夠明顯抑制的A.niger增殖，同時(shí)具有強(qiáng)烈的溶血作用，其溶血活性為Merck標(biāo)準(zhǔn)皂苷的數(shù)百倍(EC50為7.3nM)。LuteophanolsA，B，andC是該化合物的另一類結(jié)構(gòu)類似物，其中l(wèi)uteophanolA具有微弱的抗菌作用，但沒有抗真菌活性。LuteophanolsB和C及其它幾個(gè)類似物的生物活性則未見報(bào)道。lingshuiolA，B，C代表了一類結(jié)構(gòu)新穎的化合物，目前對(duì)此類化合物生物活性的報(bào)道僅限于抗真菌、抗菌及其溶血作用等方面，對(duì)其抗腫瘤活性的研究尚屬空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于從我國南海甲藻中提取分離三個(gè)新型長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物；本發(fā)明的另一目的是提供一種從我國南海甲藻中提取分離長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物的方法；本發(fā)明的再一目的是提供一種上述長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物的用途。本發(fā)明的長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)其中化合物2為其中化合物3為化合物1-3系首次從我國三亞陵水產(chǎn)前溝藻屬甲藻中提取得到，故分別命名為陵水醇A，B，C(lingshuiolA，B，C)。本發(fā)明還提供從甲藻中提取分離化合物lingshuiolA，B，C的方法，其步驟如下我國南海甲藻用甲醇/甲苯混合溶劑提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏。將該浸膏溶于0.7～1.5NNaCl溶液，混懸均勻后用甲苯萃取，濃縮甲苯萃取液得到甲苯浸膏。甲苯部位經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿/甲醇梯度洗脫，氯仿/甲醇50∶50洗脫部分，以反相RP-18硅膠純化，甲醇/水洗脫，甲醇/水60∶40洗脫部分經(jīng)高效液相色譜純化，不同比例的乙腈/水作流動(dòng)相，分別得到化合物lingshuiolA，B，C。LingshuiolA的理化性狀如下淺黃色固體，光學(xué)活性{[α]D25-8.0°(c，0.283，MeOH)}；IR譜中出現(xiàn)3411(-OH)，1735(α，β-不飽和酮)，1070(C-O)cm-1等吸收峰；正離子模式電噴霧質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z1373[M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質(zhì)譜顯示其分子式為C69H122O25{m/z1373.8209[M+Na]+，△＝+2.6mmu}。1H與13CNMR數(shù)據(jù)見表1。同時(shí)，通過測(cè)定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)和H-C相關(guān)譜(HMQC)及H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)以及H-H接力相關(guān)譜(TOCSY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。LingshuiolB的理化性狀如下淺黃色固體，光學(xué)活性[α]D25-2.8(c，0.416，MeOH)；IR譜中出現(xiàn)3403(-OH)，1637(C＝C)，1066(C-O)cm-1等吸收峰；紫外譜中出現(xiàn)UVmax(MeOH).259(ε11200)，269(ε18400)，280(ε10800)(C＝C＝C＝C)。正離子模式電噴霧質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z1295[M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質(zhì)譜顯示其分子式為C66H112O23{m/z1295.7466[M+Na]+，△＝-2.0mmu；m/z1271.7521[M-H]-，△＝+0.4mmu}。1H與13CNMR數(shù)據(jù)見表2。同時(shí)，通過測(cè)定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)和H-C相關(guān)譜(HMQC)及H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)，以及H-H接力相關(guān)譜(TOCSY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。LingshuiolC的理化性狀如下淺黃色固體，光學(xué)活性[α]D25+2.5(c，0.475，MeOH)；IR譜中出現(xiàn)3420(-OH)，1637(C＝C)，1250(-OSO3Na)，1066(C-O)cm-1等吸收峰；紫外譜中出現(xiàn)UVmax(MeOH).259(ε14600)，269(ε22600)，280(ε14900)(C＝C＝C＝C).正離子模式電噴霧質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z1265[M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質(zhì)譜顯示其分子式為C60H99O23SNa{m/z1265.5985[M+Na]+，△＝-8.5mmu}。1H與13CNMR數(shù)據(jù)見表3。同時(shí)，通過測(cè)定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)和H-C相關(guān)譜(HMQC)及H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)，以及H-H接力相關(guān)譜(TOCSY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。表1.LingshuiolA的1H，13C以及DQF-COSY，HMBCb等波譜數(shù)據(jù)對(duì)照表注aVarianlnova600MHz；溶劑CD3OD/C5D5N(2∶1)，δ化學(xué)位移單位ppm，以氘代吡啶為內(nèi)標(biāo)(δH7.19andδC123.5)；bJ＝6.5Hz；c氫譜信號(hào)被水峰覆蓋，以HMQC完成信號(hào)歸屬。表2.LingshuiolB的1H，13C以及DQF-COSY，HMBCb等波譜數(shù)據(jù)對(duì)照表注aVarianInova600MHz；溶劑CD3OD/C5D5N(2∶1)，δ化學(xué)位移單位ppm，以氘代吡啶為內(nèi)標(biāo)(δH7.19andδC123.5)；bJ＝6.5Hz；c氫譜信號(hào)被水峰覆蓋，以HMQC完成信號(hào)歸屬。表3.LingshuiolC的1H，13C以及DQF-COSY，HBCb等波譜數(shù)據(jù)對(duì)照表注aVarianInova600MHz；溶劑CD3OD/C5D5N(2∶1)，δ化學(xué)位移單位ppm，以氘代甲醇為內(nèi)標(biāo)(δH3.54andδC49.3)；bJ＝6.5Hz；c氫譜信號(hào)被水峰覆蓋，以HMQC完成信號(hào)歸屬。本發(fā)明對(duì)lingshuiol型長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性測(cè)試，表明具有明顯的抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)判與解析<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="811">長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物IC50(μM)A-549HL-60LingshuiolA(1)LingshuiolB(2)LingshuiolC(3)0.210.870.0450.230.820.49</table></tables>測(cè)試原理MTT法按不同腫瘤生成速率，將一定數(shù)量處于對(duì)表數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)后加入藥液10μl/孔，對(duì)每個(gè)細(xì)胞株，每個(gè)濃度均為三個(gè)復(fù)孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理鹽水配制20μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于C～O2培養(yǎng)箱中過夜。然后在570nm用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。觀測(cè)指標(biāo)按下列公式計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，半數(shù)抑制量IC50值采用Logit法計(jì)算。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。1H-NMR用VarianInova600型儀測(cè)定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Finnigan-MAT-95型儀測(cè)定；所使用的硅膠，為青島海洋化工廠生產(chǎn)，反相硅膠為天津市化學(xué)試劑二廠色譜技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；所使用的高效液相系統(tǒng)Agilent1100，檢測(cè)器VWDG1314A，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，半制備柱ODS-HG-5[5μm，10mm(i.d.)×25cm]，洗脫系統(tǒng)乙腈/水。實(shí)施例一長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物lingshuiolA，B，C的制備(1).提取中國南海前溝藻屬(Amphidiniumsp.)甲藻(濕重2.0kg)用甲苯/甲醇(1∶3)反復(fù)超聲提取3次，提取液合并后減壓濃縮，所得流浸膏混懸于1NNaCl(500ml)溶液，以甲苯反復(fù)萃取該混懸液3次，所得萃取液合并后減壓濃縮得到甲苯層9.0g。(2).分離甲苯提取物9.0g以200-300目硅膠柱層析，氯仿/甲醇(98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，50∶50，甲醇)梯度洗脫，氯仿/甲醇50∶50洗脫部分7.6g，以反相RP-18硅膠純化，甲醇/水(40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，80∶20，MeOH)洗脫，甲醇/水60∶40洗脫部分經(jīng)高效液相色譜純化〔Agilent1100，檢測(cè)器VWDG1314A，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，半制備柱ODS-HG-5[5μm，10mm(i.d.)×25cm]洗脫系統(tǒng)乙腈/水(35∶65)，保留時(shí)間41.2min得到新化合物lingshuiolA(16.0mg，0.0008％wetweight)；洗脫系統(tǒng)乙腈/水(33∶67)，保留時(shí)間15.7min得到新化合物lingshuiolB(25.7mg，0.0013％wetweight)。洗脫系統(tǒng)乙腈/水(22∶78)，保留時(shí)間41.1min得到新化合物lingshuiolC(22.5mg，0.0011％wetweight)。權(quán)利要求1.一類從海洋甲藻中提取的抗腫瘤活性成份陵水醇，其特征在于具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)其中化合物2為其中化合物3為2.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于甲藻用甲醇/甲苯混合溶劑提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏；將該浸膏溶于NaCl溶液，混懸均勻后用甲苯萃取，濃縮甲苯萃取液得到甲苯浸膏；甲苯部位經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，最后經(jīng)高效液相色譜純化得到長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于甲苯∶甲醇＝1∶3反復(fù)超聲波提取。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于該浸膏溶于NaCl溶液的當(dāng)量為0.7～1.5N。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于甲苯提取液經(jīng)硅膠柱層析、流動(dòng)相為氯仿∶甲醇為98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，50∶50，甲醇梯度冼脫。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于氯仿∶甲醇＝50∶50的冼脫部分濃縮后以反相RP-18硅膠純化，甲醇/水40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，80∶20，甲醇梯度冼脫，甲醇/水60∶40洗脫部分經(jīng)HPLC純化，洗脫系統(tǒng)乙腈/水(35∶65)，保留時(shí)間41.2min得到新化合物lingshuiolA(16.0mg，0.0008％wetweight)；洗脫系統(tǒng)乙腈/水(33∶67)，保留時(shí)間15.7min得到新化合物lingshuiolB(25.7mg，0.0013％wetweight)。洗脫系統(tǒng)乙腈/水(22∶78)，保留時(shí)間41.1min得到新化合物lingshuiolC(22.5mg，0.0011％wetweight)。7.如權(quán)利要求1所述的陵水醇的醫(yī)學(xué)用途是制備預(yù)防、治療腫瘤疾病藥物中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一類從海洋甲藻(Amphidiniumsp.)中提取、分離獲得的新型的具有顯著抗腫瘤活性的長(zhǎng)鏈多羥基多烯類化合物，結(jié)構(gòu)如右式經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，該類化合物具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞活性，可望在制備抗癌癥藥物中應(yīng)用。本發(fā)明可為研制新的治療各種常見多發(fā)癌癥藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)利用中國的海洋生物資源具有重要意義。文檔編號(hào)C07C309/00GK1680304SQ20041001759公開日2005年10月12日申請(qǐng)日期2004年4月9日優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日發(fā)明者郭躍偉,黃孝春,趙迪,吳厚銘,丁健,林莉萍申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海藥物研究所