專利名稱：法氏囊活性肽的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑的制備工藝，特別涉及一種法氏囊活性肽的制備工藝。
背景技術(shù)：
法氏囊活性肽是從動物法氏囊中提取制備的含有多種肽的復合物藥品。該藥品含有家禽免疫系統(tǒng)中B淋巴細胞成熟、分化和功能化的各種必須因子，作為藥物是一種免疫調(diào)節(jié)劑。1960年，Glick等首次發(fā)現(xiàn)法氏囊提取液能提高雛雞對綿羊紅細胞產(chǎn)生的抗體水平。1976年，Baba等發(fā)現(xiàn)法氏囊提取液能使切除了法氏囊的雛雞法氏囊復生，并恢復產(chǎn)生特異性抗體和免疫球蛋白的能力。1986年，Audhya等通過高壓液相色譜分析技術(shù)和氨基酸序列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)法氏囊提取液中發(fā)揮主要作用的成份是一種三肽(由三個氨基酸組成)，并將其命名為囊素(Bursin)。Audhya還發(fā)現(xiàn)，囊素能促進B淋巴細胞的分化和增殖，對哺乳類動物(包括人)也有同樣的作用。此后，許多關(guān)于法氏囊活性肽的研究大多集中于對囊素的基礎(chǔ)研究和臨床研究，并將囊素作為法氏囊活性肽研究的參照品或標準品。有人直接采用法氏囊粗提物作為研究囊素的材料，因法氏囊粗提物中含有大量非特異的大分子蛋白質(zhì)等組織成分，給雞注射可能會引起不良反應(yīng)，甚至發(fā)生過敏而死亡，干擾或掩蓋了囊素的作用。隨著超濾技術(shù)的發(fā)展和普及，目前，人們一般采用超濾技術(shù)制備法氏囊活性肽?，F(xiàn)有技術(shù)制備法氏囊活性肽的工藝一般包括以下步驟1、用高速組織搗碎機將法氏囊勻漿，并反復凍融，以破碎細胞；2、冷凍離心；3、取上清液經(jīng)超濾系統(tǒng)超濾，回收分子量在10000以下的組分；4、冷凍真空干燥，得產(chǎn)品。
上述制備工藝存在的問題是，用勻漿器并進行反復凍融，不能完全破碎法氏囊中的細胞，法氏囊活性肽的利用率低，而且制備時間長，生產(chǎn)成本高。還有一種方案在上述方案的第一、第二步之間加入一個在80度下進行熱處理去除蛋白的步驟，但這種熱處理方法對法氏囊活性肽的活性影響較大，實驗證明，在80度下處理15分鐘，法氏囊活性肽的空斑形成細胞活性顯著下降，下降率達51.5％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種可提高法氏囊活性肽收率、縮短生產(chǎn)時間、降低生產(chǎn)成本的法氏囊活性肽的制備工藝。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種法氏囊活性肽的制備工藝，以法氏囊組織為原料，采用以下步驟制備步驟一、預(yù)處理將新鮮的法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗干凈；步驟二、制備勻漿液將步驟一漂洗干凈的法氏囊組織置于勻漿機中，加入預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水浸沒，并在0-10℃下進行高速勻漿，制備成勻漿液；步驟三、制備酶處理液在步驟二所得勻漿液中加入相當于勻漿液體積1-20％的蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0-4.0，在30-50℃下消化12-36小時，制備成酶處理液；步驟四、制備法氏囊活性肽原液在步驟三所得酶處理液中加入相當于酶處理液重量5-30％的吸附劑攪拌均勻，吸附1-3小時，然后加入相當于酶處理液體積10-60％的預(yù)冷至4-20℃的有機溶劑，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；步驟五、過濾將步驟四所得法氏囊活性肽原液用超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；步驟六、干燥在步驟五所得濾液中加入相當于濾液體積0.01-2％的穩(wěn)定劑，混勻后進行真空冷凍干燥，得法氏囊活性肽粉劑。
步驟四中所述的吸附劑為活性白土、活性碳、氧化鋁、磷酸鈣或羥基磷灰石中的一種或幾種的混合物，所述的有機溶劑為丙酮、甲醇、乙醇或丙醇中的一種或幾種的混合物；步驟六中所述的穩(wěn)定劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸鈉、苯甲酸鈉、谷氨酸鈉或維生素C中的一種或幾種的混合物。
步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為10000的超濾膜。
步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為50000的超濾膜。
本發(fā)明法氏囊活性肽的制備工藝由于采用了以上技術(shù)方案，使其與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點和特點；1、由于在勻漿液中加入了濃鹽酸將其pH值調(diào)節(jié)至2.0-4.0，可抑制蛋白溶解酶液的活性，提高了法氏囊活性肽的穩(wěn)定性。
2、由于利用蛋白溶解酶液對法氏囊進行處理，可使法氏囊中的細胞完全破碎，不留任何完整細胞，既避免了反復凍融，節(jié)省了時間，又提高了法氏囊活性肽的收率。
3、由于采用熱處理技術(shù)加上化學處理和物理吸附的方法去除大的雜蛋白，既提高了過濾的效率，又提高了法氏囊活性肽的收率。
4、由于在離心液過濾時，根據(jù)應(yīng)用目的分別選用了截流分子量為50000或10000的超濾膜進行過濾，既保證了產(chǎn)品的安全性，又提高了活性多肽的比例。
5、由于在過濾液中加入了穩(wěn)定劑，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和保存期。
將用本發(fā)明的法氏囊活性肽的制備工藝制得的法氏囊活性肽粉劑用6N HCL于120℃下真空水解24小時，除去過量鹽酸，在LC＝9A型高效液相色譜上進行分析，測得本發(fā)明的法氏囊活性肽粉劑含有的氨基酸種類有天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，賴氨酸，精氨酸。
具體實施例方式
實施例1取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入2升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.0，在30-50℃下靜置24小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入2公斤活性白土攪拌均勻，吸附2小時，然后加入12升預(yù)冷至10-15℃的丙酮，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入200ml葡萄糖，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實施例2取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入0.5升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0-4.0，在30-50℃下靜置18小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入1公斤活性碳攪拌均勻，吸附2小時，然后加入2升預(yù)冷至10-15℃的甲醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為50000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入2ml蔗糖，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實施例3取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入1升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0-3.0，在30-50℃下靜置30小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入1.5公斤氧化鋁攪拌均勻，吸附2小時，然后加入3升預(yù)冷至10-15℃的乙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入10ml明膠，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實施例4取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入1.5升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5-3.5，在30-50℃下靜置36小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入5公斤磷酸鈣攪拌均勻，吸附2小時，然后加入5升預(yù)冷至10-15℃的丙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為50000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入50ml聚乙烯吡咯烷酮，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實施例5取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入3升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0-4.0，在30-50℃下靜置12小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入3公斤羥基磷灰石攪拌均勻，吸附2小時，然后加入8升預(yù)冷至10-15℃的丙酮和甲醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入80ml硫代硫酸鈉，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實施例6取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入4升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5-3.5，在30-50℃下靜置20小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入3.5公斤活性白土和羥基磷灰石的混合物攪拌均勻，吸附2小時，然后加入10升預(yù)冷至10-15℃的甲醇和乙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為50000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入100ml苯甲酸鈉，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
實施例7取新鮮的法氏囊組織12公斤，剔除筋膜和脂肪組織后得10公斤，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗1-2次，澇干置于勻漿機中，再加入10升4-10℃的0.85％的生理鹽水，在0-10℃下高速勻漿，制備成勻漿液；然后向勻漿液中加入0.3升蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.5-4.0，在30-50℃下靜置30小時，制備成酶處理液；然后在酶處理液中加入2.5公斤活性白土和活性碳的混合物攪拌均勻，吸附2小時，然后加入6升預(yù)冷至10-15℃的乙醇和丙醇，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；然后將含法氏囊活性肽的原液用截流分子量為10000的超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；最后在濾液中加入150ml維生素C，混勻后進行真空冷凍干燥，得本發(fā)明的一種法氏囊活性肽粉劑。
權(quán)利要求
1.一種法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于，以法氏囊組織為原料，采用以下步驟制備步驟一、預(yù)處理將新鮮的法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，用預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水漂洗干凈；步驟二、制備勻漿液將步驟一漂洗干凈的法氏囊組織置于勻漿機中，加入預(yù)冷至4-10℃的0.85％的生理鹽水浸沒，并在0-10℃下進行高速勻漿，制備成勻漿液；步驟三、制備酶處理液在步驟二所得勻漿液中加入相當于勻漿液體積1-20％的蛋白溶解酶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0-4.0，在30-50℃下消化12-36小時，制備成酶處理液；步驟四、制備法氏囊活性肽原液在步驟三所得酶處理液中加入相當于酶處理液重量5-30％的吸附劑攪拌勻勻，吸附1-3小時，然后加入相當于酶處理液體積10-60％的預(yù)冷至4-20℃的有機溶劑，沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液為含法氏囊活性肽的原液；步驟五、過濾將步驟四所得法氏囊活性肽原液用超濾膜過濾，得含法氏囊活性肽的濾液；步驟六、干燥在步驟五所得濾液中加入相當于濾液體積0.01-2％的穩(wěn)定劑，混勻后進行真空冷凍干燥，得法氏囊活性肽粉劑。
2.如權(quán)利要求1所述的法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于步驟四中所述的吸附劑為活性白土、活性碳、氧化鋁、磷酸鈣或羥基磷灰石中的一種或幾種的混合物，所述的有機溶劑為丙酮、甲醇、乙醇或丙醇中的一種或幾種的混合物；步驟六中所述的穩(wěn)定劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸鈉、苯甲酸鈉、谷氨酸鈉或維生素C中的一種或幾種的混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為10000的超濾膜。
4.如權(quán)利要求1所述的法氏囊活性肽的制備工藝，其特征在于步驟五中所述的超濾膜采用截流分子量為50000的超濾膜。
全文摘要
一種法氏囊活性肽的制備工藝，以法氏囊組織為原料，包括預(yù)處理、制備勻漿液、制備酶處理液、制備法氏囊活性肽原液、過濾、干燥等步驟。在其中的過濾步驟中，可根據(jù)應(yīng)用目的分別選用截流分子量為10000或50000的超濾膜。本發(fā)明的法氏囊活性肽的制備工藝簡單、周期短，產(chǎn)品收率高、純度高、穩(wěn)定性好，其產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于動物保健和生物制品等領(lǐng)域。
文檔編號C07K14/47GK1563086SQ20041001751
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日
發(fā)明者繆德年, 樊生超, 姚惠娟, 周廣禮 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所