專利名稱：锝、錸偶合三、四肽組合文庫、其活性肽化合物及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物化學(xué)與核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及锝、錸偶合三、四肽組合文庫及其活性肽化合物和建立方法。
背景技術(shù)：
組合多肽文庫技術(shù)源于Houghten RA和Lam KS在1991年的報道，此后有許多活性多肽通過該技術(shù)被發(fā)現(xiàn)。有報道，用锝或錸對已知的活性多肽尤其是小分子三肽和四肽進(jìn)行標(biāo)記，由于分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致多肽活性喪失，因而不能用于核醫(yī)學(xué)顯像或治療。到目前為止，建立锝或錸偶合三肽、四肽組合文庫的相關(guān)技術(shù)在國內(nèi)和國際上未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供锝、錸偶合三、四肽組合文庫、其活性肽化合物。本發(fā)明利用锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫，篩選活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物，用于臨床核醫(yī)學(xué)顯像診斷、放射性和非放射性疾病治療。
本發(fā)明的另一目的是提供上述組合文庫、其活性肽化合物的建立方法。
本發(fā)明首先標(biāo)記組合文庫，用锝或錸成功偶合三肽、四肽組合文庫，使三肽、四肽的自然結(jié)構(gòu)完全改變，從該文庫篩選出來的“活性肽”就是非天然結(jié)構(gòu)的活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物。本發(fā)明避免了以知技術(shù)的缺陷，而且本發(fā)明方法建立的組合文庫與HoughtenRA和Lam KS報道的多肽組合文庫有明顯的不同。
本發(fā)明的锝或錸偶合三肽、四肽組合文庫的結(jié)構(gòu)通式為，1)锝或錸偶合四肽組合文庫的分子結(jié)構(gòu)式
2)锝或錸偶合三肽組合文庫的分子結(jié)構(gòu)式 其中，氨基酸結(jié)構(gòu)N(H)-Ro-CO(OH)代表任意一種指定的L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸；N(H)-Rx-CO(OH)代表L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸的混合物；N(H)-Ro-CONH代表任意一種指定的L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸的羧基氨化氨基酸；N(H)-Rx-CONH代表L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸的羧基氨化氨基酸混合物。
根據(jù)用現(xiàn)有的20種L-氨基酸、20種D-氨基酸和20種非天然氨基酸組成锝或錸偶合三肽組合文庫，該文庫中不同結(jié)構(gòu)的锝或錸偶合三肽化合物的理論數(shù)值為216,000。用現(xiàn)有的20種L-氨基酸、20種D-氨基酸和20種非天然氨基酸組成锝或錸偶合四肽組合文庫，那么該文庫中不同結(jié)構(gòu)的锝或錸偶合四肽化合物的理論數(shù)值為12,960,000。本發(fā)明三肽文庫的氨基酸組合方法和形式為OXX、XOX、XXO；四肽文庫的氨基酸組合方法和形式為OXXX、XOXX、XXOX、XXXO，其中，O代表確定的在指定位置上的氨基酸，X代表在指定位置上的混合氨基酸。本發(fā)明锝或錸偶合三肽、四肽組合文庫中的自然三肽和四肽的結(jié)構(gòu)完全被改變，所述結(jié)構(gòu)是以三肽或四肽的四個氨基或三個氨基加一個羥基為配體對锝或錸金屬進(jìn)行偶合形成。
本發(fā)明利用不同的組織細(xì)胞或各種生物靶分子對龐大的锝或錸偶合三肽(含216,000不同結(jié)構(gòu)分子)和四肽(含12,960,000不同結(jié)構(gòu)分子)組合文庫進(jìn)行篩選，可獲得若干活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物。所述锝或錸偶合三肽、四肽組合文庫中的锝或錸為放射性同位素，本發(fā)明通過測定锝或錸的放射性，對偶合锝或錸金屬的三肽或四肽進(jìn)行篩選，結(jié)果證實，本發(fā)明建立的篩選放射性锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫的方法具有簡便快速、靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明對篩選所得活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物的結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步優(yōu)化，經(jīng)放射性藥物的藥理和毒理分析后，進(jìn)入臨床研究。本發(fā)明的活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物與目前臨床使用的顯像劑或核素治療藥物比較，具有特別的結(jié)構(gòu)和優(yōu)良特性，包括化合物制備簡便，標(biāo)記化合物有良好的物理特性，體內(nèi)外穩(wěn)定性好，體內(nèi)分布理想和圖像質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案通過下述方法和步驟實現(xiàn)，(一)建立锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫1.固相Fmoc法合成三肽和四肽組合文庫(1)合成四肽組合文庫。
合成策略為COOH-OXXX-NH3，COOH-XOXX-NH3，COOH-XXOX-NH3，COOH-XXXO-NH3。其中COOH-為四肽的羧基端；-NH3為四肽的氨基端；O為一個指定的氨基酸；X為混合氨基酸。使用的所有氨基酸的-NH3端被Fmoc保護(hù)。
在Wang樹脂微球上連接第一個O或X氨基酸，按照O確定的數(shù)目確定Wang樹脂份，例如用19種L-氨基酸(除半胱氨酸)則取19份Wang樹脂；如增加D-氨基酸和非天然氨基酸，則根據(jù)加入氨基酸的種類確定增加的Wang樹脂份。每份Wang樹脂的重量為25-50mg，分裝于中小號半透瓶中。4倍當(dāng)量O或X氨基酸分別加入到10ml具塞試管的底部，將對應(yīng)的含Wang樹脂半透瓶放入具塞試管中。每個試管分別加入0.3-0.5ml H-DMF，振蕩15分鐘，使Wang樹脂膨脹和氨基酸溶解，隨后滴加20μl吡啶和21μl的2，6-二氯苯甲酰氯，振蕩15-18小時。反應(yīng)結(jié)束后，DMF沖洗樹脂5次、甲醇沖洗樹脂2次和乙醚沖洗樹脂2次。待乙醚揮發(fā)干燥后，加入1ml羥基封閉液(吡啶∶苯甲酰氯∶1，2-二氯乙烷＝0.75∶0.75∶20體積)靜置反應(yīng)2小時。再沖洗同上。
氨基酸縮合反應(yīng)加入脫Fmoc溶液2.5-3.5ml(哌啶∶H-DMF＝1∶4體積)，振蕩15分鐘，再換脫Fmoc溶液振蕩1次，再沖洗同上。用H-DMF將4倍當(dāng)量的TBTU與4倍當(dāng)量的O或X氨基酸混合溶解，加入6.7μl的DIEA反應(yīng)3分鐘后，一并加入到Wang樹脂中，N2飽和，振蕩反應(yīng)1小時。沖洗樹脂同上。再重復(fù)縮合反應(yīng)一次。驗色反應(yīng)確定氨基酸縮合完全。
從Wang樹脂切下四肽組合文庫脫Fmoc和沖洗同上。加入1ml TFA混合液，其中，含2％苯酚，苯甲醚∶EDT∶TFA＝1∶1∶47體積，N2飽和，靜置反應(yīng)1.5小時，將含四肽組合文庫的TFA混合液抽入上嘴濾瓶中。重復(fù)上述切下四肽組合文庫。真空負(fù)壓抽干TFA。四肽組合文庫用乙醚沉淀和沖洗。
(2)合成三肽組合文庫。
合成方案一為COOH-OXX-NH3，COOH-XOX-NH3，COOH-XXO-NH3；二為CONH2-OXX-NH3，CONH2-XOX-NH3，CONH2-XXO-NH3。其中，COOH-為三肽的羧基端；CONH2-為三肽的羧氨基端；-NH3為三肽的氨基端；O為一個指定的氨基酸；X為混合氨基酸。使用的所有氨基酸的-NH3端被Fmoc保護(hù)。
合成步驟，其中第二策略采用Fmoc保護(hù)VAL-Rink Amide-MBHA羧基端氨化樹脂替代Wang樹脂，余與四肽組合文庫同。
2.建立锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫(1)取10-100μg三肽組合文庫(CONH2-OXX-NH3，CONH2-XOX-NH3，CONH2-XXO-NH3)或四肽組合文庫(COOH-OXXX-NH3，COOH-XOXX-NH3，COOH-XXOX-NH3，COOH-XXXO-NH3)，用0.1-1ml(最佳為0.2-0.3ml)的PBS將三肽組合文庫或四肽組合文庫溶解于反應(yīng)瓶中。PBS的PH值范圍在5.0-9.0之間，但最佳PH值為7.4。
(2)鹽酸溶解SnCl2.2H2O，用蒸留水或PBS稀釋至鹽酸濃度為0.05N。使用體積為5-50μl。
(3)蒸留水或PBS溶解酒石酸鈉鉀，使用體積為10-100μl。
(4)將至少0.1mg的酒石酸鈉鉀滴加入含肽文庫溶液的反應(yīng)瓶中，酒石酸鈉鉀的最佳用量是1-10mg。
(5)將SnCl2.2H2O溶解液加入反應(yīng)瓶中，用量為25-100μg。
(6)將放射性活度在37MBq(1mCi)左右新鮮的99mTcO4-或188ReO4-淋洗液加入反應(yīng)瓶，密封瓶口，避免激烈振蕩。
(7)上述反應(yīng)瓶在75℃-100℃下偶合標(biāo)記反應(yīng)5-20分鐘后，冷卻至室溫，待用。
(8)紙層析法快速測定放射化學(xué)純度，99mTc或188Re偶合三肽或四肽的放射化學(xué)純度≥90％可使用。放射化學(xué)純度測定方法Whatman或國產(chǎn)新華I號濾紙(14×1cm)，距離濾紙底部2cm處點(diǎn)樣，乙腈或丙酮上行爬紙，溶劑前延距離點(diǎn)樣原點(diǎn)10cm時停止爬紙。吹干濾紙上的有機(jī)溶劑后，再用生理鹽水上行爬紙，生理鹽水前延距離點(diǎn)樣原點(diǎn)5cm時停止爬紙。吹干鹽水后，濾紙倒置，生理鹽水上行爬紙接近濾紙中央。吹干濾紙，測定濾紙的放射性分布。點(diǎn)樣原點(diǎn)為還原膠體99mTc或188Re，99mTc或188Re偶合四肽化合物產(chǎn)品主要分布在Rf＝0.35-0.55之間，游離99mTcO4-或188ReO4-主要分布在Rf＝0.75處。
(9)硅膠TLC分析99mTc或188Re偶合三肽或四肽文庫。展開溶劑為乙腈∶甲醇∶水＝5∶3∶2體積。99mTc或188Re偶合三肽或四肽文庫放射性在硅膠板上呈散在分布。
(10)制備還原膠體99mTc或188Re，用于非特異性還原膠體99mTc或188Re的細(xì)胞攝取測定。方法同上，但不加入三肽和四肽組合文庫.(二)放射性測量法篩選锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫1、組織細(xì)胞篩選锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫利用組織細(xì)胞從锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫中篩選活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物，采用目前臨床使用的顯像劑如肝膽顯像劑、心肌顯像劑、腦灌注顯像劑和腫瘤顯像劑常規(guī)所用的特定組織臟器的細(xì)胞攝取為基礎(chǔ)，對上述锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選，獲得系列親組織細(xì)胞的锝或錸偶合三肽和四肽化合物。所獲化合物可用于體內(nèi)組織臟器的功能顯像。
采用目前常規(guī)使用特定腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選，獲得系列親腫瘤細(xì)胞的锝或錸偶合三肽和四肽化合物。所獲化合物對腫瘤細(xì)胞有較高的親合能力，但對正常組織細(xì)胞的親合力相對較低。
采用目前常規(guī)使用特定組織細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，在有氧(5％CO2+95％空氣)和乏氧(5％CO2+95％N2)狀態(tài)下培養(yǎng)，并對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選。比較在有氧和乏氧狀態(tài)下，特定組織細(xì)胞攝取和殘留組合文庫的差異大小，以在有氧狀態(tài)下攝取和殘留組合文庫最低，而在乏氧狀態(tài)下攝取和殘留組合文庫最高為參考標(biāo)準(zhǔn)，獲得系列親乏氧細(xì)胞的锝或錸偶合三肽和四肽化合物。
采用上述常規(guī)使用特定腫瘤細(xì)胞對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選，比較對照和異博定等P170糖蛋白拮抗劑對細(xì)胞攝取文庫的影響程度，篩選出對P170糖蛋白拮抗劑敏感的锝或錸偶合三肽和四肽化合物-多藥耐藥(MDR)示蹤化合物，用于腫瘤多藥耐藥示蹤和逆轉(zhuǎn)MDR。
采用特定腫瘤細(xì)胞對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選，培養(yǎng)后測定腫瘤細(xì)胞的存活率，篩選系列對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用的锝或錸偶合三肽和四肽化合物-腫瘤殺傷性化合物。
采用特定腫瘤細(xì)胞對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選，與常用化療藥物一同培養(yǎng)后測定腫瘤細(xì)胞的存活率，篩選系列對化療藥物有增敏作用的锝或錸偶合三肽和四肽化合物。
采用特定組織細(xì)胞對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫進(jìn)行篩選，分析锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫在特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線粒體、細(xì)胞核的分布特征，獲得亞細(xì)胞示蹤化合物。
按下述步驟進(jìn)行，1)細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)不同的篩選目的，選用不同的特定組織細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)。如腫瘤細(xì)胞，用10％DMEM培養(yǎng)液或其他適合的培養(yǎng)液(含抗生素)將腫瘤細(xì)胞稀釋(3.0×103/ml)，然后種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中(0.1ml/每孔)，在CO2培養(yǎng)箱中37℃(5％CO2+95％空氣)培養(yǎng)3天左右。
2)細(xì)胞攝取分析A.取兩組96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，除去陳舊的培養(yǎng)液，再加入0.1ml不含抗生素的新鮮培養(yǎng)液。
B.根據(jù)不同的實驗設(shè)計，加入對照PBS溶液和含各種不同濃度化合物或藥物的PBS溶液。
C.對應(yīng)加入锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫，每培養(yǎng)孔的總γ計數(shù)不少于50,000cpm/min，最佳的總γ計數(shù)在100,000-1,000,000cpm/min之間。剩余孔加入游離的锝或錸淋洗液和锝或錸還原膠體，作為校正參考。
D.加入锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫后，確定孵育時間和孵育條件。
E.孵育結(jié)束，除去培養(yǎng)孔中的溶液，用0.3ml冷PBS(4℃)沖洗培養(yǎng)孔3次。
F.在其中一組培養(yǎng)孔中加入胰蛋白酶溶解液，室溫消化10分鐘，加0.5％trypan藍(lán)，在光學(xué)顯微鏡下測定細(xì)胞存活率。細(xì)胞的存活率要求＞80％。
G.于另一組培養(yǎng)孔中加入細(xì)胞溶解液(2％Triton X-100 in 0.1NNaOH)或胰蛋白酶溶解液，室溫下溶解或消化解離培養(yǎng)細(xì)胞，3次，每次10分鐘。將細(xì)胞溶解液或解離的培養(yǎng)細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至γ測量試管中，待γ測定。
用γ計數(shù)儀測定細(xì)胞結(jié)合的锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫的γ計數(shù)?？瞻坠軠y量本底計數(shù)。其中細(xì)胞攝取還原膠體和游離99mTc或錸需校正。還原膠體99mTc或錸的制備同上述方法。
3)數(shù)據(jù)處理和分析％細(xì)胞攝?。?細(xì)胞攝取的γ計數(shù)-本底γ計數(shù)-還原膠體99mTc非特異性細(xì)胞結(jié)合γ計數(shù)-游離99mTc非特異性細(xì)胞結(jié)合γ計數(shù))/(總γ計數(shù)-本底γ計數(shù))。用％細(xì)胞攝取對相對應(yīng)的锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫中O確定的氨基酸作圖根據(jù)不同的實驗設(shè)計來確定每個O位置上的活性氨基酸。再根據(jù)每個O位置上的活性氨基酸來組合預(yù)測的活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物。
4)對預(yù)測的活性化合物鑒定和比較對預(yù)測的活性锝或錸偶合化合物重復(fù)進(jìn)行體外細(xì)胞結(jié)合實驗。證實合成的預(yù)測活性锝或錸偶合化合物的生物表現(xiàn)與實驗設(shè)計和篩選結(jié)果一致。比較所述化合物的體外和體內(nèi)特性等。
采用生物分子篩選锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫，基本程序與上述細(xì)胞篩選锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫相似，不同之處是用生物分子對文庫進(jìn)行篩選，所述生物分子指選定的蛋白質(zhì)和DNA。按常規(guī)方法篩選，如生物分子通過物理法、化學(xué)法或生物結(jié)合法固定在試管或?qū)又稀?br> 經(jīng)實驗證明，本發(fā)明可以研制開發(fā)核醫(yī)學(xué)顯像診斷試劑、放射性疾病治療藥物。其中的非放射性穩(wěn)定性锝或錸偶合三肽和四肽化合物，對開發(fā)非放射性疾病治療或輔助治療藥物將有重要意義本發(fā)明方法所得的診斷和治療藥物還具有選擇范圍廣、方法學(xué)簡單、研制成本低、開發(fā)周期短等優(yōu)點(diǎn)。所述藥物的研制開發(fā)具備巨大潛力，從目前市場所存原料預(yù)測，理論上能得到13,392,000結(jié)構(gòu)不同的锝或錸偶合三肽和四肽化合物。
具體實施例方式
實施例1交換法建立由19種L-氨基酸組成的99mTc偶合四肽組合文庫，并用人類肺腺癌細(xì)胞株H1299對該文庫進(jìn)行篩選。表1為預(yù)測能被人類肺腺癌細(xì)胞株H1299攝取的99mTc偶合四肽化合物的四個位置上的活性氨基酸。篩選發(fā)現(xiàn)，越接近四肽NH3末端的活性氨基酸對細(xì)胞細(xì)胞濃聚99mTc偶合四肽化合物越為重要，越接近COOH末端細(xì)胞攝取越低。在99mTc偶合四肽化合物位置上，位置1上的活性氨基酸M、Q、R、S和位置3上的活性氨基酸Q、V比其他位置上的活性氨基酸對于細(xì)胞攝取99mTc偶合四肽化合物更具有特異性。而COOH末端的氨基酸對于99mTc偶合四肽化合物的體內(nèi)分布特征具有明顯的作用。例如，下述實施例中的99mTc-SAQE和99mTc-SAQI，只在四肽的第4個位置上(COOH末端)的氨基酸存在差異，但兩者的體內(nèi)分布特征明顯不同，99mTc-SAQE主要通過尿液排泄，而99mTc-SAQI以通過肝膽排泄為主，通過尿液排泄為次要。
表1文庫99mTc-NH3-OXXX-COOH99mTc-NH3-XOXX-COOH99mTc-NH3-XXOX-COOH99mTc-NH3-XXXO-COOH位置 1 234氨基酸M、Q、R、S A、D、E、I、K、NQ、V E、F、L、T、W、Y％攝取6.27 4.32 2.32 1.95注文庫指99mTc偶合四肽組合文庫； 位置指活性氨基酸在99mTc偶合四肽組合文庫上的所在位置；氨基酸指99mTc偶合四肽組合文庫中的具有活性的氨基酸；％攝取指具有活性氨基酸的平均H1299胞攝取率。
實施例2
交換法建立锝偶合三肽和四肽組合文庫建立99mTc偶合四肽組合文庫取50μg四肽組合文庫溶解于0.2ml的PBS中，pH＝7.4，滴加加入3mg弱偶合化合物酒石酸鈉鉀后，加入50μg SnCl2.2H2O后即刻加入37MBq(1mCi)的99mTcO4-淋洗液，封閉真空瓶口，100℃水浴反應(yīng)10分鐘。采用人肺腺癌細(xì)胞株H1299篩選99mTc偶合四肽組合文庫的。篩選結(jié)果顯示細(xì)胞對99mTc偶合四肽組合文庫有非常顯著的攝取，證實交換法能構(gòu)建完整的99mTc偶合四肽組合文庫，所形成的99mTc偶合四肽化合物能被細(xì)胞攝取，因此能篩選出活性99mTc偶合四肽化合物。所述活性99mTc偶合四肽化合物進(jìn)行體外細(xì)胞實驗和大鼠或小鼠體內(nèi)分布試驗，表明預(yù)測的活性99mTc偶合四肽化合物體外能被細(xì)胞高度攝取，并具有良好的體內(nèi)分布特性，進(jìn)一步證實交換法能夠構(gòu)建完整的99mTc偶合四肽組合文庫。
四肽組合文庫和酒石酸鈉鉀比例對標(biāo)記文庫的影響實驗采用合成的GAGG、EQWY、RIVY和SAQE四種單肽，在PH7.4的條件下，99mTc偶合四肽形成(指標(biāo)記率達(dá)90％以上)所需的酒石酸鈉鉀/四肽比例分別為99mTc-GAGG為10、99mTc-EQWY為250、99mTc-SAQE為2500和99mTc-RIVY為5000。表明不同結(jié)構(gòu)的四肽對99mTc的偶合能力至少有500倍的差異，另外，交換法標(biāo)記組合文庫時，酒石酸鈉鉀/單個四肽的比例至少在5000以上。
PH值對標(biāo)記文庫的影響實驗測試PH值對99mTc-GAGG和99mTc-RIVY的影響。結(jié)果證實不同的PH值對四肽偶合99mTc能力的影響不同，偏酸容易形成99mTc-RIVY，而偏堿容易形成99mTc-GAGG。
SnCl2.2H2O的使用量合成單肽QQNQ，使用直接法進(jìn)行99mTc標(biāo)記，標(biāo)記具體方法同上。SnCl2.2H2O的使用量分別取25μg、50μg和75μg，標(biāo)記后游離99mTcO4-含量分別為10％、5％和3％，還原膠體99mTc含量分別為2％、2％和3％。結(jié)果證實SnCl2.2H2O的使用量在50μg-75μg為宜。
反應(yīng)溫度和時間對標(biāo)記四肽的影響合成單肽QQNQ，測試標(biāo)記反應(yīng)溫度和時間對99mTc-QQNQ標(biāo)記率的影響。直接法室溫下反應(yīng)10分鐘，99mTc-QQNQ的標(biāo)記率為50％；100℃反應(yīng)10分鐘，99mTc-QQNQ的標(biāo)記率為94％；100℃反應(yīng)20分鐘，99mTc-QQNQ的標(biāo)記率為97％。交換法室溫下反應(yīng)10分鐘，99mTc-QQNQ的標(biāo)記率為10％-20％；100℃交換反應(yīng)10分鐘，99mTc-QQNQ的標(biāo)記率為93％；100℃交換反應(yīng)20分鐘，99mTc-QQNQ的標(biāo)記率為95％。
實施例3測試99mTc偶合四肽混合物----99mTc-MX1X2Y、99mTc-QX1X2Y、99mTc-RX1X2Y、99mTc-SX1X2Y，確定第一個位置上的活性氨基酸(M、Q、R、S)所組成的99mTc偶合四肽的體內(nèi)分布特征，其中X1為第二個位置上的活性氨基酸混合物(A、D、E、I、K、N)，X2為第三個位置上的活性氨基酸混合物(Q、V)。
對四只荷H1299腫瘤裸鼠分別進(jìn)行99mTc-MX1X2Y、99mTc-QX1X2Y、99mTc-RX1X2Y、99mTc-SX1X2Y的體內(nèi)顯像研究，SPECT圖像采集，采集矩陣為256×256，Zoom為3.2，γ累積計數(shù)為≥150K。
以下實施例的圖像采集方法均一致。
顯像結(jié)果顯示腫瘤的攝取率99mTc-RX1X2Y≥99mTc-SX1X2Y＞99mTc-MX1X2Y＞99mTc-QX1X2Y；肝臟的攝取率99mTc-RX1X2Y≈99mTc-sX1X2Y≈99mTc-MX1X2Y≈99mTc-QX1X2Y；心臟的攝取率99mTc-RX1X2Y＞99mTc-sX1X2Y＞99mTc-MX1X2Y＞99mTc-QX1X2Y；腎臟的攝取率99mTc-QX1X2Y＞99mTc-sX1X2Y≈99mTc-MX1X2Y＞99mTc-RX1X2Y；膀胱的清除率99mTc-QX1X2Y＞99mTc-sX1X2Y≈99mTc-MX1X2Y＞99mTc-RX1X2Y。
結(jié)果表明，第一個位置上的活性氨基酸R和S對腫瘤和心臟攝取99mTc偶合四肽有重要作用；第一個位置上的活性氨基酸Q和S組成的99mTc偶合四肽比第一個位置上的活性氨基酸M和R組成的99mTc偶合四肽更容易被機(jī)體清除。
實施例4
測試99mTc偶合四肽混合物----99mTc-X1AX2Y、99mTc-X1DX2Y、99mTc-X1EX2Y、99mTc-X1IX2Y、99mTc-X1KX2Y、99mTc-X1NX2Y，確定第二個位置上的活性氨基酸(A、D、E、I、K、N)所組成的99mTc偶合四肽的體內(nèi)分布特征，其中X1為第一個位置上的活性氨基酸混合物(M、Q、R、S)，X2為第三個位置上的活性氨基酸混合物(Q、V)。
對六只荷H1299腫瘤裸鼠分別進(jìn)行99mTc-X1AX2Y、99mTc-X1DX2Y、99mTc-X1EX2Y、99mTc-X1IX2Y、99mTc-X1KX2Y、99mTc-X1NX2Y的體內(nèi)顯像研究。結(jié)果顯示腫瘤的攝取率99mTc-X1EX2Y＞99mTc-X1DX2Y＞99mTc-X1IX2Y≈99mTc-X1AX2Y＞99mTc-X1KX2Y ≈99mTc-X1NX2Y；心臟的攝取率99mTc-X1EX2Y＞99mTc-X1IX2Y＞99mTc-X1DX2Y≈99mTc-X1AX2Y≈99mTc-X1NX2Y≈99mTc-X1KX2Y；肝臟的攝取率99mTc-X1DX2Y＞999mTc-X1AX2Y＞99mTc-X1IX2Y＞99mTc-X1EX2Y＞99mTc-X1NX2Y＞99mTc-X1KX2Y；腎臟的攝取率99mTc-X1AX2Y＞99mTc-X1IX2Y＞99mTc-X1EX2Y≈99mTc-X1DX2Y≈99mTc-X1KX2Y≈99mTc-X1NX2Y；消化道排泄率99mTc-X1AX2Y＞99mTc-X1IX2Y＞99mTc-X1EX2Y≈99mTc-X1DX2Y≈99mTc-X1KX2Y≈99mTc-X1NX2Y；尿液排泄率99mTc-X1DX2Y＞99mTc-X1NX2Y＞99mTc-X1AX2Y≈99mTc-X1IX2Y≈99mTc-X1EX2Y＞99mTc-X1KX2Y；胃粘膜和甲狀腺攝取率99mTc-X1KX2Y＞99mTc-X1IX2Y＞99mTc-X1EX2Y＞99mTc-X1DX2Y＞99mTc-X1NX2Y＞99mTc-X1AX2Y。
結(jié)果表明，第二個位置上的活性氨基酸E、D、I、A對腫瘤和心臟攝取99mTc偶合四肽有重要作用；第二個位置上的活性氨基酸A和I組成的99mTc偶合四肽由肝膽系統(tǒng)清除；由第二個位置上的活性氨基酸K和E組成的99mTc偶合四肽在體內(nèi)不穩(wěn)定，容易解離出游離99mTc；由第二個位置上的活性氨基酸D、N和A組成的99mTc偶合四肽可由尿液排泄。
實施例5合成腫瘤顯像劑99mTc偶合四肽化合物-99mTc-SAQE根據(jù)體外人類肺腺癌細(xì)胞株H1299對99mTc偶合四肽組合文庫的篩選結(jié)果和體內(nèi)分布的篩選，按已知方法合成腫瘤顯像劑99mTc-SAQE。99mTc-MIBI顯像劑為對照，體外實驗結(jié)果表明，人類肺腺癌細(xì)胞株H1299對99mTc-SAQE的攝取率明顯高于99mTc-MIBI。
對荷H1299腫瘤裸鼠體內(nèi)分布實驗結(jié)果表明，99mTc-SAQE主要通過腎臟排泄，但與99mTc-GAGG比較，99mTc-SAQE的排泄速率明顯緩慢。尾靜脈注射后第10分鐘和第30分鐘，膀胱99mTc-GAGG的放射性分別為注射量的65％和82％，膀胱99mTc-SAQE的放射性分別為注射量的18％和25％。注射后第6小時，99mTc-SAQE的膀胱放射性接近注射量的50％。
對三只荷H1299腫瘤裸鼠進(jìn)行體內(nèi)99mTc-MIBI顯像和對兩只荷H1299腫瘤裸鼠進(jìn)行體內(nèi)99mTc-SAQE顯像，結(jié)果顯示腫瘤組織幾乎不攝取99mTc-MIBI，腫瘤組織不顯影，對99mTc-SAQE有較明顯的攝取，而且延遲顯像比早期顯像腫瘤顯示清晰，早期和延遲顯像時，腫瘤對99mTc-SAQE的攝取率分別為99mTc-MIBI的近2倍和5倍。
實施例699mTc偶合四肽化合物----99mTc-SAVY肝膽顯像劑對小鼠尾靜脈注射99mTc-SAVY后1分鐘開始顯像，可見大部分99mTc-SAVY放射性集中于肝臟，占注射量的70％-80％，沒有心血池影像和腎臟影像。注射99mTc-SAVY后30分鐘，大部分放射性進(jìn)入膽道和腸道。注射99mTc-SAVY后60分鐘，放射性基本進(jìn)入腸道。注射后5分鐘和60分鐘時，膀胱的放射性分別為注射量的1％和6％，低于常用的肝膽顯像劑99mTc標(biāo)記的乙酰替苯胺亞氨二醋酸(IDA)類化合物(99mTc-IDA)。
實施例799mTc偶合四肽化合物-99mTc-RIVY心肌顯像劑和腫瘤顯像劑本發(fā)明在兩只小鼠和一只SD大鼠的尾靜脈注射99mTc-RIVY后15分鐘、1.5小時、4小時和15小時，可見99mTc-RIVY的放射性主要分布在心臟和肝臟。注射后1小時內(nèi)，心臟的放射性強(qiáng)度與肝臟基本相同，隨時間延長心臟的放射性略有清除。注射99mTc-RIVY后4小時腸道和膀胱僅出現(xiàn)極少量的放射性。相比較，99mTc-MIBI在鼠心臟分布少，大部分放射性分布在肝臟、腎臟、腸道和膀胱，注射后15小時顯示肺和骨骼肌有明顯的放射性分布。臨床99mTc-MIBI和99mTc-Tetrofosmin常用的99mTc標(biāo)記心肌顯像劑的物理特性和圖像質(zhì)量均不理想。對兩只荷H1299腫瘤裸鼠體內(nèi)顯像結(jié)果顯示，99mTc-MIBI在腫瘤組織中幾乎不被攝取，而99mTc-RIVY在腫瘤組織中有較高的放射性分布。
實施例899mTc偶合四肽化合物-99mTc-SAQI肝膽顯像劑與上述腫瘤顯像劑99mTc-SAQE比較，99mTc-SAQ I在結(jié)構(gòu)上只在-COOH未端上的氨基酸I與E不同，經(jīng)荷H1299腫瘤裸鼠體內(nèi)顯像顯示，99mTc-SAQE在腫瘤組織中比99mTc-SAQI攝取顯著。
99mTc-SAQI與99mTc-SAQE在體內(nèi)分布和清除特征上完全不同。尾靜脈注射99mTc-SAQI后，近一半的放射性分布在小鼠的肝臟上(占注射量的40％-45％)，并隨時間從肝膽道緩慢清除，注射后1小時和3小時分別有約50％和約90％的肝臟放射性進(jìn)入腸道。15％-20％的注射量通過尿液排泄。99mTc-SAQI的顯像結(jié)果提示，-NH3末端的活性氨基酸對于細(xì)胞攝取99mTc偶合四肽化合物比-COOH末端的活性氨基酸重要，但-COOH末端的活性氨基酸對99mTc偶合四肽化合物的體內(nèi)分布有重要影響。
權(quán)利要求
1.锝、錸偶合三、四肽組合文庫，其特征是結(jié)構(gòu)通式為，1)锝或錸偶合四肽組合文庫的分子結(jié)構(gòu)式 2)锝或錸偶合三肽組合文庫的分子結(jié)構(gòu)式 其中，氨基酸結(jié)構(gòu)N(H)-Ro-CO(OH)代表任意一種指定的L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸；N(H)-Rx-CO(OH)代表L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸的混合物；N(H)-Ro-CONH代表任意一種指定的L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸的羧基氨化氨基酸；N(H)-Rx-CONH代表L-氨基酸、D-氨基酸和非天然氨基酸的羧基氨化氨基酸混合物。
2.按權(quán)利要求1所述的锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫，其特征是所述三肽文庫的氨基酸組合形式為OXX、XOX、XXO，所述四肽文庫的氨基酸組合形式為OXXX、XOXX、XXOX、XXXO，其中，O代表確定的在指定位置上的氨基酸，X代表在指定位置上的混合氨基酸。
3.按權(quán)利要求1所述的锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫，其特征是所述锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫中的自然三肽和四肽的結(jié)構(gòu)被改變，所述改變的結(jié)構(gòu)是以三肽或四肽的四個氨基或三個氨基加一個羥基為配體對锝或錸金屬進(jìn)行偶合形成。
4.按權(quán)利要求1所述的所述锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫，其特征是所述的锝或錸為放射性同位素。
5.锝、錸偶合三、四肽活性肽化合物，其特征是利用組織細(xì)胞或生物靶分子對锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫篩選獲得。
6.按權(quán)利要求1所述的锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫在篩選用于核醫(yī)學(xué)顯像的锝或錸偶合三肽和四肽化合物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫在篩選用于放射性疾病治療的锝或錸偶合三肽和四肽化合物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的锝、錸偶合三肽、四肽組合文庫在篩選用于非放射性疾病治療的锝或錸偶合三肽和四肽化合物中的應(yīng)用。
9.一種锝、錸偶合三肽和四肽組合文庫建立方法，包括下述步驟，1)固相Fmoc法合成三肽和四肽組合文庫2)建立锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫3)放射性測量法篩選锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫利用組織細(xì)胞從锝或錸偶合三肽和四肽組合文庫中篩選活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物。
10.按權(quán)利要求9的锝、錸偶合三肽和四肽組合文庫建立方法，其中所述四肽組合文庫合成策略為COOH-OXXX-NH3，COOH-XOXX-NH3，COOH-XXOX-NH3，COOH-XXXO-NH3，其中COOH-為四肽的羧基端；-NH3為四肽的氨基端；O為一個指定的氨基酸；X為混合氨基酸，所述三肽組合文庫合成方案為COOH-OXX-NH3，COOH-XOX-NH3，COOH-XXO-NH3；或為CONH2-OXX-NH3，CONH2-XOX-NH3，CONH2-XXO-NH3。其中，COOH-為三肽的羧基端；CONH2-為三肽的羧氨基端；-NH3為三肽的氨基端；O為一個指定的氨基酸；X為混合氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物化學(xué)與核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及锝、錸偶合三、四肽組合文庫及其活性肽化合物及其建立方法。本發(fā)明涉及1、建立锝或錸偶合三肽、四肽組合文庫技術(shù)；2、細(xì)胞或生物分子篩選锝或錸偶合三肽、四肽組合文庫；3、經(jīng)篩選獲得的活性锝或錸偶合三肽和四肽化合物。本發(fā)明可用于研制開發(fā)所有可能用于核醫(yī)學(xué)顯像、放射性和非放射性疾病治療的锝或錸偶合三肽和四肽化合物。
文檔編號C07K5/10GK1515587SQ03150540
公開日2004年7月28日 申請日期2003年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者曾駿, 曾 駿 申請人:上海市胸科醫(yī)院