專利名稱：采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒快速抽提純化dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米材料的應(yīng)用領(lǐng)域和納米生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及到納米顆粒在分子生物學(xué)中對DNA的快速抽提純化的應(yīng)用開發(fā)。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，當(dāng)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等已深入到分子水平，對所利用的進(jìn)行高效分離、富集、提取、轉(zhuǎn)載的DNA生物大分子的需求也日益提高。然而目前常用的DNA提取純化方法都因存在自身缺陷而無法滿足人們進(jìn)行深入實(shí)驗(yàn)的要求。酚/氯仿抽提法曾經(jīng)是分子生物學(xué)中經(jīng)典的提取DNA方法，但由于酚/氯仿對人體的巨大毒害作用和對環(huán)境的強(qiáng)烈污染，在提倡綠色環(huán)保的今天將會大大局限其的應(yīng)用范圍?，F(xiàn)時市場上的DNA抽提試劑盒由于操作步驟比較復(fù)雜、原料需要預(yù)處理、且原料自身理化性能不強(qiáng)造成產(chǎn)率不高等而無法滿足人們的要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種采用價廉易制、在中性溶液中呈正值動電位、具理化穩(wěn)定性的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？焖俸啙嵆樘峒兓疍NA的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以帶正電荷的具有磁性的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒為載體，直接與組織裂解液或細(xì)胞裂解液相互作用，帶正電荷的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒與組織裂解液或細(xì)胞裂解液中帶負(fù)電荷的DNA通過靜電作用形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，在外磁場的作用下實(shí)現(xiàn)氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物與組織裂解液或細(xì)胞裂解液的分離，再通過解離液將結(jié)合在氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒表面的DNA解離下來，從而實(shí)現(xiàn)對DNA的快速純化，建立一種新的基于二氧化硅殼磁性納米顆粒的DNA快速提取純化方法。
該方法不需要采用酚/氯仿抽提法除去核酸溶液中的蛋白質(zhì)，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，縮短了時間、提高了效率，同時免去了酚/氯仿對環(huán)境的污染和對人體的毒害作用；與現(xiàn)時市場上的DNA抽提試劑盒抽提純化DNA相比，它不需要對氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒進(jìn)行預(yù)處理；與羥基磷灰石柱層析純化DNA相比，氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒具有巨大的比表面積，可提高純化DNA的效率。該方法的建立為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、突變檢測、基因診斷和基因治療等研究和應(yīng)用中DNA的純化提供了一種新的手段和快迅簡潔的抽提純化DNA方法。


現(xiàn)結(jié)合附圖對本發(fā)明做出說明。
圖1為本發(fā)明所用的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒的動電位ζ與Ph值的曲線圖。
圖中 二氧化硅納米顆粒 二氧化硅磁納米顆粒 四氧化三鐵膠體納米顆粒 氨基化二氧化硅磁納米顆粒該方法所采用的磁性納米顆粒的等電點(diǎn)都在9.6左右，在pH中性的常溫介質(zhì)中，納米顆粒表面的氨基質(zhì)子化可有效地產(chǎn)生凈正電，且電動電位高達(dá)35mv，可直接與組織或細(xì)胞裂解液相互作用，帶正電荷的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒與組織或細(xì)胞裂解液中帶負(fù)電荷的DNA通過靜電作用以離子對形式形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，通過利用內(nèi)核的磁性作用，在外磁場的作用下即可實(shí)現(xiàn)氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物與組織或細(xì)胞裂解液快迅、簡潔、高效地分離。
圖2為小鼠的肝組織DNA的凝膠電泳圖，是本發(fā)明的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒提取的DNA與常規(guī)法(酚/氯仿抽提法)提取DNA之間的比較。
圖中(1)用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒抽提的DNA(2)用二氧化硅納米顆粒提取DNA(由于不具有正電荷，因此不能提取出來)(3)用常規(guī)方法提取的DNA顯然，普通的二氧化硅納米顆粒在中性環(huán)境下不帶正電，不能提取DNA，而在中性環(huán)境下帶正電荷的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒法可成功地提取DNA，與常規(guī)方法提取DNA相比，簡化了抽提步驟，縮短了抽提時間、提高了抽提效率，同時免去了酚/氯仿對環(huán)境的污染和對人體的毒害作用。
具體實(shí)施例方式1.裂解組織或細(xì)胞取適量組織或細(xì)胞，加入適量抽提裂解液于冰上快速磨碎成組織液或細(xì)胞液后裂解3-5小時。
2.形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA的復(fù)合物利用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒在pH中性的常溫介質(zhì)中，其表面的氨基質(zhì)子化可有效地產(chǎn)生凈正電，且電動電位高達(dá)35mv這一特性，在裂解后的組織或細(xì)胞液中加入適量經(jīng)高溫滅菌的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒，振蕩混勻，于室溫(15-25℃)充分結(jié)合5-30分鐘，形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA的復(fù)合物。
3.分離收集氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物利用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒的內(nèi)核具有磁性的特點(diǎn)，在外加磁場作用下進(jìn)行分離，收集氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物。
4.解離氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物上的DNA在氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物中加入解離液(2-3mol/L的氯化納溶液或pH10-12的緩沖溶液)，室溫下放置5-30分鐘，讓DNA充分洗脫下來。在外磁場下靜置5-20分鐘，使氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒充分沉淀，DNA分布在上層澄清溶液中，收集上層澄清溶液，重復(fù)此步驟2-3次，確保氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒表面的DNA全部解離下來。
5.濃縮DNA產(chǎn)物利用DNA在異丙醇中能夠沉降析出的特性，往收集到的內(nèi)含DNA的上層澄清溶液中加入適量的異丙醇，讓其充分混合，于0℃到-20℃下放置10-15分鐘，然后于4℃下12000g-15000g離心15-30分鐘，使DNA從溶液中沉淀出來。
6.收集DNA倒掉上層澄清溶液，用乙醇洗滌DNA沉淀，再次離心，倒掉上層乙醇溶液，讓殘留的乙醇自然揮發(fā)干凈，加入50微升pH為8.0的TE緩沖液溶解DNA沉淀，得到適合濃度的DNA溶液，于4℃下保存。
實(shí)施例(以提取小白鼠的肝組織為例)采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒從小白鼠的肝組織中快速抽提純化DNA的方法1.取1.302克小白鼠肝組織，加入18ml抽提裂解液，于冰上快速磨碎成勻漿液后于60℃下裂解4個小時成組織裂解液。
2.取500ul組織裂解液，加入1毫升20mg/mL經(jīng)高溫滅菌的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒，振蕩，在室溫下充分結(jié)合10-15分鐘，形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物。
3.將氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物在外磁場下靜置5分鐘，使氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物充分沉淀，將上層澄清溶液倒掉，用超純水洗滌1次，再次將氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物在外磁場下靜置5分鐘，將上層澄清溶液倒掉，收集氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物。
4.往氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物中加入500uL 2mol/L的氯化納溶液重新懸浮氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，振蕩，于室溫下放置5分鐘，讓DNA充分洗脫下來。在外磁場下充分沉淀氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒，收集上層澄清溶液。重復(fù)此步驟3次，確保氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒表面的DNA全部解離下來。
5.收集到的上層澄清溶液中加入1mL的異丙醇，讓其充分混合，于0℃到-20℃下放置10分鐘，然后離心15分鐘，使DNA與溶液分層。
6.倒掉上層澄清溶液，得到DNA產(chǎn)物，用乙醇洗滌DNA沉淀，再次離心，倒掉上層乙醇溶液，讓殘留的乙醇自然揮發(fā)干凈，加入50微升pH為8.0的TE緩沖液溶解DNA沉淀，得到DNA溶液，于4℃下保存。
本發(fā)明中，所述氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？捎萌缦路椒ㄖ频玫谝徊绞紫戎苽浼{米四氧化三鐵膠體，即將20mL 1mol/L三氧化鐵水溶液(現(xiàn)配)與5mL 2mol/L的二氯化鐵溶液(用2mol/L鹽酸配制)混合，加入250mL0.7mol/L的氨水，室溫下攪拌半小時后，用磁鐵分離，倒掉上清液。所得沉淀用30mL1mol/L四甲基氫氧化銨(TMA)溶解，然后加入二次蒸餾水至250mL。用孔徑為40-80μm的砂芯漏斗過濾，除去聚集的大顆粒。
第二步，將環(huán)己烷(7.5ml)、表面活性劑曲拉通X-100(TritonX-100)(1.8ml)和正己醇(1.8ml)(體積比約為4.2/1/1)，混合均勻，加入適量的水(360μL)作為分散相，攪拌5min后形成油包水的微膠囊，加入200μL納米四氧化三鐵膠體，攪拌均勻。再將100μL正硅酸乙酯(TEOS)和100μL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS)混合均勻(1/1，體積比)后加入到微膠囊體系中，攪拌均勻后，加入100μL的氨水催化它們在微膠囊中的同步水解，整個反應(yīng)時間為24小時，反應(yīng)完備后用丙酮破乳，在外磁場下收集顆粒。即可制備氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)其一該方法所采用的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒的等電點(diǎn)在9.6左右，在pH中性的常溫介質(zhì)中，氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒表面的氨基質(zhì)子化可有效地產(chǎn)生凈正電，且電動電位高達(dá)35mv，不需要對氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒再進(jìn)行修飾。
其二氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒直接與組織裂解液或細(xì)胞裂解液相互作用，通過靜電作用以離子對形式形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，在外磁場的作用下即可實(shí)現(xiàn)氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物與組織或細(xì)胞裂解液快速、簡潔、高效地分離。
其三該方法縮短了抽提時間、提高了抽提效率，同時免去了酚/氯仿對環(huán)境的污染和對人體的毒害作用。
其四與基因組DNA抽提試劑盒抽提純化DNA法和羥基磷灰石柱層析純化DNA法相比，它不需要再對氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒進(jìn)行預(yù)處理，且氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒具有巨大的比表面積，可提高抽提產(chǎn)物的產(chǎn)率。該方法的建立為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、突變檢測、基因診斷和基因治療等研究和應(yīng)用中DNA的純化提供了一種新的手段和方法。
權(quán)利要求
1.一種采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？焖俪樘峒兓疍NA的方法，其特征在于以帶正電荷且具磁性的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒為載體，直接與組織裂解液或細(xì)胞裂解液相互作用，帶正電荷的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒與組織裂解液或細(xì)胞裂解液中帶負(fù)電荷的DNA通過靜電作用形成納米顆粒-DNA復(fù)合物，在外磁場的作用下實(shí)現(xiàn)納米顆粒-DNA復(fù)合物與組織裂解液或細(xì)胞裂解液的分離，再通過解離液將結(jié)合在納米顆粒表面的DNA解離下來，從而實(shí)現(xiàn)對DNA的快速抽提純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？焖俪樘峒兓疍NA的方法，其特征在于其具體步驟為(1)裂解組織或細(xì)胞取適量組織或細(xì)胞，加入適量抽提裂解液于冰上快速磨碎成組織液或細(xì)胞液后裂解3-5小時；(2)形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物利用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒在pH中性的常溫介質(zhì)中，其表面的氨基質(zhì)子化可有效地產(chǎn)生凈正電，且電動電位高達(dá)35mv這一特性，在裂解后的組織或細(xì)胞液中加入適量經(jīng)高溫滅菌的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒，振蕩混勻，于室溫(15-25℃)充分結(jié)合5-30分鐘，形成氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA的復(fù)合物；(3)收集氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物利用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒的內(nèi)核具有磁性的特點(diǎn)，在外加磁場作用下進(jìn)行分離，收集氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物；(4)解離氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物上的DNA在氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物中加入解離液(2-3mol/L的氯化納溶液或pH10-12的緩沖溶液)，室溫下放置5-30分鐘，讓DNA充分洗脫下來，在外磁場下靜置5-20分鐘，使氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒充分沉淀，DNA分布在上層澄清溶液中，收集上層澄清溶液，重復(fù)此步驟2-3次，確保氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒表面的DNA全部解離下來；(5)濃縮DNA產(chǎn)物利用DNA在異丙醇中能夠沉降析出的特性，往收集到的內(nèi)含DNA的上層澄清溶液中加入適量的異丙醇，讓其充分混合，于0℃到-20℃下放置10-15分鐘，然后于4℃下12000g-15000g離心15-30分鐘，使DNA從溶液中沉淀出來；(6)收集DNA倒掉上層澄清溶液，用乙醇洗滌DNA沉淀，再次離心，倒掉上層乙醇溶液，讓殘留的乙醇自然揮發(fā)干凈，加入50微升pH為8.0的TE緩沖液溶解DNA沉淀，得到適合濃度的DNA溶液，于4℃下保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？焖俪樘峒兓疍NA的方法，其特征在于所述氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？捎萌缦路椒ㄖ频玫谝徊绞紫戎苽浼{米四氧化三鐵膠體，即將20mL 1mol/L三氧化鐵水溶液(現(xiàn)配)與5mL 2mol/L的二氯化鐵溶液(用2mol/L鹽酸配制)混合，加入250mL0.7mol/L的氨水，室溫下攪拌半小時后，用磁鐵分離，倒掉上清液，所得沉淀用30mL1mol/L四甲基氫氧化銨(TMA)溶解，然后加入二次蒸餾水至250mL，用孔徑為40-80μm的砂芯漏斗過濾，除去聚集的大顆粒；第二步，將環(huán)己烷(7.5ml)、表面活性劑曲拉通X-100(TritonX-100)(1.8ml)和正己醇(1.8ml)(體積比約為4.2/1/1)，混合均勻，加入適量的水(360μL)作為分散相，攪拌5min后形成油包水的微膠囊，加入200μL納米四氧化三鐵膠體，攪拌均勻；再將100μL正硅酸乙酯(TEOS)和100μL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS)混合均勻(1/1，體積比)后加入到微膠囊體系中，攪拌均勻后，加入100μL的氨水催化它們在微膠囊中的同步水解，整個反應(yīng)時間為24小時，反應(yīng)完備后用丙酮破乳，在外磁場下收集顆粒，即可制備氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒。
全文摘要
采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒快速抽提純化DNA的方法，以帶正電荷且具磁性的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒為載體，直接與組織裂解液或細(xì)胞裂解液相互作用，帶正電荷的氨基化二氧化硅殼磁性納米顆粒與組織裂解液或細(xì)胞裂解液中帶負(fù)電荷的DNA通過靜電作用形成納米顆粒－DNA復(fù)合物，在外磁場作用下實(shí)現(xiàn)納米顆粒－DNA復(fù)合物與組織裂解液或細(xì)胞裂解液的分離，再通過解離液將結(jié)合在納米顆粒表面的DNA解離下來，從而實(shí)現(xiàn)DNA的快速抽提純化。該方法不需用酚/氯仿抽提法除去核酸溶液中的蛋白質(zhì)，簡化了步驟，提高了效率，同時免去酚/氯仿對環(huán)境的污染和對人體的毒害作用；該方法為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、突變檢測、基因診斷和治療等研究和應(yīng)用中DNA的純化提供了一種新手段。
文檔編號C07H1/06GK1421455SQ02139818
公開日2003年6月4日 申請日期2002年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月11日
發(fā)明者王柯敏, 何曉曉, 李杜, 譚蔚泓, 黃杉生, 林霞 申請人:湖南大學(xué)