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一種基于多肽模板合成二氧化錳納米片的方法及其應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):12774408閱讀:395來源:國知局
一種基于多肽模板合成二氧化錳納米片的方法及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及納米材料、催化及分析化學(xué)領(lǐng)域,具體包括一種基于多肽作生物模板合成二氧化錳納米片的制備方法及其在催化及分析化學(xué)方面的應(yīng)用。



背景技術(shù):

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1-100nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。在眾多納米材料當(dāng)中,二維納米片因?yàn)槠錁O高的比表面積、豐富的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的電子傳遞性能等特點(diǎn)受到廣泛的關(guān)注。其中,二氧化錳納米片憑借其獨(dú)特的光學(xué)、催化、電化學(xué)性能,在熒光傳感、超級(jí)電容器、仿酶等方面得到了廣泛應(yīng)用。例如,Mao等人在《Single-layer MnO2 nanosheets suppressed fluorescence of 7-hydroxycoumarin: mechanistic study and application for sensitive sensing of ascorbic acid in vivo》一文中利用水熱法合成MnO2納米片,并將其用于熒光傳感器及細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸的檢測(cè)(Analytical Chemistry 2014,86, 12206-12213)。Xu等人在《Ultrasensitive glutathione detection based on lucigenin cathodic electrochemiluminescence in the presence of MnO2 nanosheets》一文中利用水熱法合成MnO2納米片,并用于谷胱甘肽的超靈敏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(Analytical Chemistry 2016,88,7654-7659)。然而,二氧化錳納米片的合成方法通常需要加熱操作、強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)氧化劑或?qū)υO(shè)備和操作技能要求較高,這就限制了它們的應(yīng)用。因此,探索簡(jiǎn)單、溫和、綠色環(huán)保、可控的二氧化錳納米片合成方法是一項(xiàng)富有意義的工作。

生物模板納米材料是指以各種天然的生物材料為模板,模擬生物礦化過程而生成的具有納米結(jié)構(gòu)的材料。生物模板法是在無有機(jī)試劑、溫和的條件下合成的納米材料。自然界中蘊(yùn)藏了豐富的天然生物模板(如:蛋白質(zhì)、DNA、細(xì)胞、噬菌體)。其中,蛋白質(zhì)模板因其獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)及與金屬離子的相互作用而廣受關(guān)注。經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn),科研人員以蛋白質(zhì)作模板合成了各種納米材料。Komatsu等人在《Solid nanotubes comprising α-Fe2O3 nanoparticles prepared from ferritin protein》一文中以鐵蛋白(分子量為450 kDa)為模板合成了α-Fe2O3納米材料(Crystal Growth & Design 2012, 12,4130-4134)。Cui等人在《Hierarchically assembled Au microspheres and sea urchin-like architectures: formation mechanism and SERS study》一文中利用牛血清蛋白(BSA,分子量為68 kDa),通過蛋白質(zhì)法合成了Ag納米微球(Nanoscale 2012,4, 7766-7772)。Morse等人在《Silicatein and the translation of its molecular mechanism of biosilicification into low temperature nanomaterial synthesis》一文中利用硅蛋白(分子量為28 kDa)將其用作生物模板合成了多種無機(jī)材料(Chemical Reviews 2008, 108, 4915-4934)。Chen等人在《Facile synthesis of red-emitng lysozyme-stabilized Ag nanoclusters》一文中用溶菌酶(分子量為14.307 kDa)作模板合成了Ag納米簇(Nanoscale 2012,4, 5312-5315)。目前,尚無以更小分子量的衣殼蛋白作模板的合成報(bào)道。另外,蛋白模板合成的納米結(jié)構(gòu)多為納米球或納米簇,鮮有納米片。

納米酶是一種具有類似生物酶活性的納米材料,故又叫作仿酶納米材料。因其成本低、制備簡(jiǎn)單、催化活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),而在生物傳感、食品檢測(cè)和環(huán)境保護(hù)等方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。多種類型的納米材料已被證明具有仿酶活性,包括金屬氧化物(Co3O4、CeO2、V2O5、CuO、MnO2)、金屬硫化物(CuS、FeS)、貴金屬(Au、Pt、Pd、AgM、Pd@Pt、Pd@Ir)和碳材料(富勒烯、石墨烯)等。這些仿酶類型有過氧化物酶、氧化酶、超氧化物歧化酶等。其中,過氧化物酶廣泛應(yīng)用于H2O2顯色檢測(cè)及其衍生領(lǐng)域(如葡萄糖顯色檢測(cè)、免疫分析等)。目前,尚無關(guān)于具有過氧化物酶活性的MnO2納米片的報(bào)道。

綜上所述,一種以多肽作模板制備二氧化錳納米片的方法具有有顯著的新穎性,利用其仿酶實(shí)現(xiàn)H2O2顯色檢測(cè)具有明顯的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。迄今為止,以多肽為模板合成二氧化錳納米片及其應(yīng)用尚未見報(bào)道。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種以多肽模板合成二氧化錳納米片的方法及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:

一種以多肽模板合成二氧化錳納米片的方法,其特征在于,該方法包括如下步驟:

(1) 將多肽與含有二價(jià)錳離子的水溶液混合均勻,靜置一段時(shí)間;

(2) 向上述混合溶液中加入一定量的堿液并混勻,振蕩反應(yīng)一段時(shí)間后生成黃褐色懸濁液;

(3) 將上述反應(yīng)液離心,去除含有未反應(yīng)成分的上清液,收集沉淀,4 °C保存以備用;也可通過透析或過濾的方法收集純化二氧化錳納米片。

優(yōu)選是,所述多肽為絲狀噬菌體M13或fd的主要衣殼蛋白pVIII;所述含有二價(jià)錳離子的水溶液可由醋酸錳、氯化錳、硫酸錳、硝酸錳等配制而成;所述堿液可由氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水等配制而成。

上述的二氧化錳納米片的應(yīng)用,其特征在于:所述二氧化錳納米片具有仿過氧化物酶的催化活性,可作為分析檢測(cè)的催化劑。

優(yōu)選是,所述二氧化錳納米片可作為催化劑用于H2O2的檢測(cè)。

進(jìn)一步的優(yōu)選是,所述檢測(cè)H2O2時(shí)加入有機(jī)顯色劑;所述有機(jī)顯色劑為2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)或3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。

本發(fā)明的效果是:

1. 本發(fā)明利用生物模板法及一步法合成了二氧化錳納米片,合成方法簡(jiǎn)單、溫和、環(huán)保,解決了傳統(tǒng)方法合成二氧化錳納米片的過程復(fù)雜、能耗大、納米片形貌難以控制等缺點(diǎn)。

2. 本發(fā)明中基于多肽模板的二氧化錳納米片具有仿過氧化物酶的催化活性,因此該二氧化錳納米片可作為催化劑用于H2O2的顯色檢測(cè)。

3.本發(fā)明所采用的生物模板為絲狀噬菌體的多肽,對(duì)人體無毒無害,是一種綠色環(huán)保的生物模板,并且通過生物模板法合成的二氧化錳納米片具有良好的生物相容性,在生物標(biāo)記、免疫分析、生物傳感等生化分析領(lǐng)域?qū)⒕哂辛己玫膽?yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的二氧化錳納米片的透射電鏡照片;

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的二氧化錳納米片的以ABTS為底物的仿酶活性效果圖;

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的二氧化錳納米片的以TMB為底物的仿酶活性效果圖;

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的二氧化錳納米片的pH優(yōu)化效果圖;

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的二氧化錳納米片仿酶活性的溫度穩(wěn)定性效果圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的顯色法定量檢測(cè)H2O2的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

具體實(shí)施方式

為了深入地說明本發(fā)明的內(nèi)容,下面將進(jìn)一步列舉一些實(shí)施例,但本發(fā)明不局限于所列舉的實(shí)施例。下列實(shí)施例中具體實(shí)驗(yàn)條件或方法如未注明,均按本領(lǐng)域的常規(guī)條件或方法進(jìn)行。

實(shí)施例 1

M13噬菌體的制備及提純:

取1 μL噬菌粒PC89溶液,轉(zhuǎn)化對(duì)大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞,平板培養(yǎng)后挑單菌落接種于2 mL Amp抗性的SOC培養(yǎng)液中,37 °C振蕩培養(yǎng)2 h,轉(zhuǎn)移至400 mL Amp抗性的SOC培養(yǎng)液中,37 °C振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液在600 nm的吸光度約為0.4時(shí),加入約1×1012 個(gè)輔助噬菌體M13KO7,振蕩培養(yǎng)1 h,再加入終濃度為25 μg/mL的卡那霉素以及終濃度為1 mM的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷,37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)液置于70 °C水浴20 min,然后分裝于50 mL離心管,離心15 min(轉(zhuǎn)速5000 rpm),收集上清;加入PEG8000至40 g/L,NaCl至30 g/L,冰浴1 h,于4 °C離心5 min(轉(zhuǎn)速12000 rpm),棄上清;沉淀用5 mL的PBS溶解,于4 °C離心5 min(轉(zhuǎn)速12000 rpm),棄去不溶物。按以上方法重復(fù)1次,收集上清,4 °C保存。上清中M13噬菌體的濃度由常見的涂平板數(shù)噬菌斑的方法確定。

實(shí)施例2

M13噬菌體衣殼蛋白pVIII的分離純化:

將飽和苯酚溶液(Tris-HCl,pH 8.0)加入等體積的M13噬菌體溶液中。將混合液劇烈攪拌10分鐘使其混勻,然后3000 rpm下離心10分鐘。離心后,由于溶解度不同,噬菌體DNA與疏水的衣殼蛋白分別溶于上層的水相和下層的苯酚相。移除上層的水相,用等體積的Tris-HCl(pH 8.0)反萃取苯酚相3次。隨后,將含有衣殼蛋白的苯酚相用兩倍體積的甲醇稀釋,依次分別用甲醇和10mM Tris-HCl(1:1)的混合液、甲醇與10mM Tris-HCl(1:3)混合液、10mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)、水透析12 h。最后,將純化的衣殼蛋白冷凍干燥成粉末并在-20℃下保存。樣品中蛋白質(zhì)的濃度用分光光度法測(cè)定。

實(shí)施例3

基于多肽模板的二氧化錳納米片的制備:

(1) 將多肽(終濃度0.1 mg/mL)與醋酸錳的水溶液(終濃度1 mM)混合均勻,靜置1 h;

(2) 向上述混合溶液中加入NaOH的水溶液并混勻,振蕩反應(yīng)24 h后生成深褐色懸濁液;

(3) 將上述反應(yīng)液離心,去除含有未反應(yīng)成分的上清液,收集沉淀,4°C保存以備用;也可通過透析或過濾的方法收集純化二氧化錳納米片。

實(shí)施例4

二氧化錳納米片的形貌分析:

將二氧化錳納米片的懸浮液滴于銅網(wǎng)上,室溫晾干后利用透射電子顯微鏡分析其形貌。

如圖1所示,得到的二氧化錳納米片形貌均一,平均尺寸大小約50 nm,部分納米片垂直于銅網(wǎng),可知納米片厚度約10 nm。

實(shí)施例5

二氧化錳納米片的仿酶活性:

實(shí)驗(yàn)體系a:催化反應(yīng)體系為包含H2O2(1 mM)、上述實(shí)施例獲得的二氧化錳納米片(4 μg/mL)、有機(jī)顯色劑ABTS(0.6 mM)的醋酸緩沖液(pH 3.5)。在室溫(25 °C)下反應(yīng)10分鐘后,利用酶標(biāo)儀記錄其在波長(zhǎng)為375?500 nm范圍內(nèi)的光譜圖。

另做三個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn):對(duì)照實(shí)驗(yàn)b,無二氧化錳納米片,在與上述實(shí)驗(yàn)體系同樣條件下靜置10分鐘后記錄光譜圖;對(duì)照實(shí)驗(yàn)c,以等量的多肽代替二氧化錳納米片,在與上述實(shí)驗(yàn)體系同樣條件下靜置10分鐘后記錄光譜圖。

如圖2所示,實(shí)驗(yàn)體系a在416 nm附近顯示出明顯的峰,比實(shí)驗(yàn)體系b高出很多,說明二氧化錳納米片具有明顯的仿過氧化物酶的活性;對(duì)照實(shí)驗(yàn)c的響應(yīng)曲線與對(duì)照實(shí)驗(yàn)b相似,說明多肽本身沒有催化活性。綜上所述,實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明制備的二氧化錳納米片具有良好的催化活性。

為進(jìn)一步證明二氧化錳納米片的仿酶活性,以另一種有機(jī)顯色劑TMB做底物來代替ABTS,分別以二氧化錳納米片(實(shí)驗(yàn)體系a)、水(實(shí)驗(yàn)體系b)、多肽(實(shí)驗(yàn)體系c)作催化劑,其他實(shí)驗(yàn)條件與上述實(shí)驗(yàn)一致,光譜掃描范圍范圍300?750 nm。

如圖3所示,實(shí)驗(yàn)體系a在650 nm附近顯示出明顯的峰,而實(shí)驗(yàn)體系b、c在650 nm附近無明顯的峰,說明二氧化錳納米片具有明顯的仿過氧化物酶的活性而多肽本身對(duì)TMB無催化活性。

實(shí)施例6

二氧化錳納米片仿酶活性的pH優(yōu)化:

催化反應(yīng)體系為包含H2O2(5 mM)、二氧化錳納米片(4 μg/mL)、有機(jī)顯色劑TMB(3 mM)的不同pH的緩沖液(pH 2.0,甘氨酸-鹽酸緩沖液;pH 3.0?6.0,醋酸-醋酸鈉緩沖液;pH 7.0?8.0,磷酸鹽緩沖液;pH 9.0?10.0,Tris-鹽酸緩沖液)。在室溫(25 °C)下反應(yīng)10分鐘后,利用分光光度計(jì)檢測(cè)其650nm內(nèi)的吸光值。如圖4所示,二氧化錳納米片在pH 3.5處表現(xiàn)出最佳的過氧化物酶活性。

實(shí)施例7

二氧化錳納米片仿酶活性的溫度穩(wěn)定性:

二氧化錳納米片的水溶液在不同溫度(4?90 °C)下孵育2小時(shí)。隨后,將二氧化錳納米片加到催化反應(yīng)體系中,檢測(cè)其在416 nm處的吸光值,如圖5所示,45 °C以下孵育的二氧化錳納米片幾乎保留全部活力,而80 °C下孵育的二氧化錳納米片也保留了大約70%的活力。

實(shí)施例8

H2O2的顯色法定量檢測(cè):

催化反應(yīng)體系為包含不同濃度的H2O2(0?1 mM)、二氧化錳納米片(4 μg/mL)、有機(jī)顯色劑TMB(0.6 mM)的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.5)。在室溫(25 °C)下反應(yīng)8分鐘后,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)其652 nm處的吸光值,并由此繪制出H2O2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。如圖6所示,線性范圍100?900 μM。

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