減少促炎反應(yīng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本公開內(nèi)容涉及一種使用酪蛋白水解產(chǎn)物減少促炎反應(yīng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 促炎反應(yīng)，或炎癥，是身體對(duì)有害刺激例如病原體、損壞的細(xì)胞或刺激物的生物反 應(yīng)。
[0003] 急性炎癥的典型體征是疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅、腫脹和功能喪失。炎癥是生物體除去有 害刺激和啟動(dòng)愈合過(guò)程的一種保護(hù)性嘗試。炎癥不是感染的同義詞，即使在其中炎癥由感 染引起的情況下。雖然感染由微生物引起，但炎癥是生物體對(duì)病原體的反應(yīng)之一。雖然急性 炎癥對(duì)免疫反應(yīng)是重要的和防止組織的進(jìn)一步的破壞，但慢性不適當(dāng)?shù)难装Y可引起組織破 壞（神經(jīng)變性、心血管疾病、2型糖尿?。┖图膊≈T如枯草熱、牙周炎、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、自身免疫性疾病和甚至癌癥（例如，膽囊癌）。長(zhǎng)時(shí)間的炎癥，或慢 性炎癥，導(dǎo)致在炎癥部位存在的細(xì)胞類型的進(jìn)行性轉(zhuǎn)變并以組織從炎性過(guò)程的同時(shí)的破壞 和愈合為特征。促炎反應(yīng)是先天免疫反應(yīng)的一部分，并使用細(xì)胞和血漿-衍生的因素（路 徑）例如補(bǔ)體系統(tǒng)、干擾素（IFN)、細(xì)胞因子、淋巴因子、單核因子、前列腺素和白三烯、血小 板激活因子（PAF)、組胺和激肽（如與疼痛有關(guān)的緩激肽）。促炎細(xì)胞因子包括IL-I (白 介素-1 α和β )、IL-6、IL-8、TNF- α (腫瘤壞死因子-α )和TNF- β (淋巴毒素 α )，以 及IL20家族成員、IL33、LIF (白細(xì)胞抑制因子）、IFN-y (干擾素 y)、0SM (制瘤素 M)、 CNTF (睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子）、TGF-f3 (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-f3)、GM-CSF (粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞集落刺激因子）、IL11、IL12和IL18。
[0004] 自身免疫性疾病起因于身體對(duì)抗正常存在于身體內(nèi)的物質(zhì)和組織的不適當(dāng)?shù)拿?疫反應(yīng)。這可限于某些器官（如在自身免疫性甲狀腺炎中）或涉及不同部位的特定組織 (如可影響肺和腎二者的基底膜的Goodpasture's?。?。治療自身免疫性疾病通常使用降 低免疫反應(yīng)的免疫抑制藥物。
[0005] 糖尿病1型（1型糖尿病，T1DM，以前為胰島素依賴性或青少年糖尿?。┦且认俚?產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的自身免疫性破壞引起的糖尿病的一種形式。隨后的胰島素缺乏導(dǎo) 致增加的血糖和尿糖。典型的癥狀是多尿癥（尿頻）、多飲（增加的口渴）、多食癥（增加 的饑餓感）和體重?fù)p失。發(fā)病率在北歐和美國(guó)從8至17/100, 000變化，從斯堪的納維亞的 高約35/100, 000到日本和中國(guó)的低至1/100, 000。最終，1型糖尿病是致命的，除非用胰島 素治療。注射是給予胰島素的最普通的方法，雖然其它方法有胰島素栗和吸入胰島素。其 它備選方法有已經(jīng)使用的胰腺移植和還有胰島細(xì)胞移植。移植仍在實(shí)驗(yàn)性發(fā)展中。
[0006] 腹腔疾病是發(fā)生在遺傳上易感的從嬰兒中期開始的所有年齡人群的小腸的自身 免疫性病癥。癥狀包括消化道疼痛和不適、慢性便秘和腹瀉、未能茁壯成長(zhǎng)（在兒童中）和 衰弱，但這些可以是不存在的，并且描述了其它器官系統(tǒng)的癥狀。由于小腸從食物適當(dāng)吸 收營(yíng)養(yǎng)物的能力降低，維生素缺乏常常在患有腹腔疾病的人群中被注意到。由于增加篩選 的結(jié)果，越來(lái)越多的診斷是在無(wú)癥狀者中進(jìn)行的；在美國(guó)，該病癥被認(rèn)為影響介于1/1，750 和1/105之間的人群。腹腔疾病是由麥醇溶蛋白（一種在小麥中發(fā)現(xiàn)的谷醇溶蛋白（谷蛋 白））和存在于小麥族農(nóng)作物（其包括其它普通谷物例如大麥和黑麥）中的類似蛋白質(zhì)的 反應(yīng)引起的。在暴露于麥醇溶蛋白，且特別是暴露于谷醇溶蛋白中發(fā)現(xiàn)的3種肽時(shí)，酶組織 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾蛋白質(zhì)，和免疫系統(tǒng)與小腸組織發(fā)生交叉反應(yīng)，引起炎性反應(yīng)。這導(dǎo)致截 短的小腸絨毛襯里（稱為絨毛萎縮）。這干擾了營(yíng)養(yǎng)物的吸收，因?yàn)槟c絨毛負(fù)責(zé)吸收。唯一 已知的有效治療是終身無(wú)谷蛋白的飲食。雖然該疾病是由對(duì)小麥蛋白的反應(yīng)引起的，但它 與小麥過(guò)敏不同。
[0007] HLA-DQ2 (DQ2)是HLA-DQ (DQ)血清分型系統(tǒng)中的一組血清型。該血清型通過(guò)DQ β-鏈的β 2亞型的抗體識(shí)別來(lái)確定。DQ2代表腹腔疾病的第二高風(fēng)險(xiǎn)因子，最高的風(fēng)險(xiǎn) 是患有疾病的密切家族成員。由于它與腹腔疾病的聯(lián)系，DQ2具有任何HLA血清型與自身 免疫性疾病的最高聯(lián)系，接近于95%的所有腹腔具有DQ2,其30%具有2個(gè)拷貝的DQ2。吃 小麥的DQ2純合子人群中，腹腔疾病的終身風(fēng)險(xiǎn)介于20和40%之間。青少年糖尿?。═lD) 與DQ2. 5具有高的相關(guān)性且在GSE和男性TlD的早期發(fā)病之間似乎有關(guān)聯(lián)。在三分之一的 TlD患者中發(fā)現(xiàn)抗-tTG抗體升高，并且有一些指示，即小麥可能參與，但谷蛋白是一種類型 的球蛋白（Glbl)。最近的研究表明，DQ2. 5和DQ8的組合（兩種酸性肽的供應(yīng)者）大大地 增加成人發(fā)作型1型糖尿病和不確定的I/II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。HLA-DR3在自身免疫性糖尿 病中起主要作用。然而，DQ2與DR3的存在降低發(fā)病的年齡和自身免疫性病癥的嚴(yán)重性。
[0008] HLA-DQ8 (DQ8)是在HLA-DQ (DQ)血清型組中的一種人白細(xì)胞抗原血清型。DQ8 是DQ3廣泛抗原的拆分抗原。DQ8通過(guò)β 8的抗體識(shí)別確定，這一般檢測(cè)DQB1*0302的基因 產(chǎn)品。DQ8通常與人群的自身免疫性疾病關(guān)聯(lián)。DQ8是與腹腔疾病關(guān)聯(lián)的第二個(gè)最主要的 同工型和DQ大多與青少年糖尿病有關(guān)聯(lián)。DQ8增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)并與RA的主要 風(fēng)險(xiǎn)基因座HLA-DR4有關(guān)。DR4也在青少年糖尿病中起著重要的作用。雖然DQ8. 1單倍型 與疾病有關(guān)，但DQB1*0305、DQ8. 4或DQ8. 5單倍型與自身免疫性疾病沒有已知的聯(lián)系；然 而，這可能是缺乏攜帶這些和極低頻率的人口研究的結(jié)果。在歐洲，DQ8與青少年糖尿病和 腹腔疾病有關(guān)。對(duì)于1型糖尿病的最高風(fēng)險(xiǎn)因素是HLA DQ8/DQ2. 5表型。在東部斯堪的納 維亞的部分中，DQ2. 5和DQ8二者的遲發(fā)性1型和不確定的I/II型糖尿病的頻率有高的增 加。DQ8也發(fā)現(xiàn)于亞洲的許多本土人群中，其在阿拉伯Bedoin人群中被早期檢測(cè)出來(lái)，其中 DQ2. 5經(jīng)常缺乏，且在這些情況下DQ8是腹腔疾病中唯一有關(guān)的HLA。
[0009] 克羅恩氏病（Crohn's disease)，也稱為克羅恩綜合征和局限性腸炎，是一種可影 響從口腔至肛門的胃腸道任何部分的炎性腸病類型，引起廣泛種類的癥狀。它主要地引起 腹部疼痛、腹瀉（如果炎癥處于最嚴(yán)重時(shí)，其可以是帶血的）、嘔吐（可以是持續(xù)的）或體重 損失，但也可引起胃腸道外的并發(fā)癥，例如皮疹、關(guān)節(jié)炎、眼炎、疲勞和注意力缺乏?？肆_恩 氏病由遺傳上易感個(gè)體的環(huán)境、免疫學(xué)和細(xì)菌因素之間的相互作用引起。這導(dǎo)致慢性炎性 病癥，其中身體的免疫系統(tǒng)攻擊胃腸道（可能針對(duì)微生物抗原）。存在著與克羅恩氏病，主 要是與N0D2基因及其蛋白質(zhì)（其感覺細(xì)菌細(xì)胞壁）的變異的遺傳相關(guān)性。受影響的個(gè)體 的兄弟姐妹都處于較高的風(fēng)險(xiǎn)中。男性和女性同樣受影響。吸煙者發(fā)生克羅恩氏病的可能 性為不吸煙者的兩倍。在北美，克羅恩氏病影響介于400, 000和600, 000之間的人口。北 歐的流行率估計(jì)范圍在從27-48/100, 000。克羅恩氏病往往最初存在于十多歲和二十來(lái)歲 的人中，另一個(gè)峰發(fā)病率在五十來(lái)歲至七十來(lái)歲，盡管該疾病可發(fā)生在任何年齡。對(duì)于克羅 恩氏病沒有已知的藥物或手術(shù)治療。治療選項(xiàng)限制為控制癥狀，維持緩解和預(yù)防復(fù)發(fā)。
[0010] 潰瘍性結(jié)腸炎（UC)是炎性腸病（IBD)的一種形式。潰瘍性結(jié)腸炎是一種結(jié)腸炎 (一種結(jié)腸（大腸）疾病）的形式，其包括特征性潰瘍或瘡口?；顒?dòng)性疾病的主要癥狀通常 是逐漸發(fā)病的混有血液的經(jīng)常性腹瀉。IBD常常與腸易激惹綜合征（IBS)，一種麻煩的但不 很嚴(yán)重的病癥混淆。潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩氏?。硪环N形式的IBD)具有相似性。潰瘍性 結(jié)腸炎是一種間歇性疾病，有加重癥狀的時(shí)期，和相對(duì)無(wú)癥狀的時(shí)期。雖然潰瘍性結(jié)腸炎的 癥狀有時(shí)可自我減輕，但疾病通常需要治療來(lái)緩解。潰瘍性結(jié)腸炎具有1-20病例/100, 000 個(gè)體/年的發(fā)病率，和8-246/100, 000個(gè)體/年的流行率。該疾病在世界的北方國(guó)家，以及 在個(gè)別國(guó)家的北方區(qū)域或其它地區(qū)更多流行。較富裕國(guó)家的發(fā)病率往往是較高的，這可能 表明流行率增加是由于診斷率增加所致。雖然潰瘍性結(jié)腸炎未有已知的原因，但存在對(duì)易 感性的假定的遺傳成分。疾病可以由環(huán)境因素在易感人中引起。雖然膳食改變可減少患有 該疾病的人的不適，并不認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎由膳食因素引起。潰瘍性結(jié)腸炎作為自身免疫 性疾病治療。用抗炎藥、免疫抑制劑和靶向免疫反應(yīng)的特定組分的生物療法治療。如果疾 病是嚴(yán)重的，對(duì)治療沒有反應(yīng)，或者如果發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥的話，結(jié)腸切除術(shù)（通過(guò)手術(shù)部 分或全部切除大腸）有時(shí)是必要的。全結(jié)腸直腸切除術(shù)（對(duì)大腸的整體去除）可能是有療 效的，但它可以與并發(fā)癥有關(guān)。
[0011] 代謝綜合征是一種醫(yī)學(xué)疾病的組合，當(dāng)一起存在時(shí)，增加發(fā)生心血管疾病和糖尿 病的風(fēng)險(xiǎn)。一些研究已經(jīng)表明，在USA中的流行率估計(jì)是人口的25%，且流行率隨著年齡 而增加。代謝綜合征也稱為代謝綜合征X、心臟代謝綜合征、綜合征X、胰島素抵抗綜合征、 Reaven' s綜合征（以Gerald Reaven名字命名）和CHAOS (在澳大利亞）。代謝綜合征的 復(fù)雜途徑的準(zhǔn)確機(jī)理尚未完全已知。病理生理學(xué)是極其復(fù)雜的且僅有部分被闡明。大多數(shù) 患者為老年人、肥胖者、久坐不動(dòng)，并有一定程度的胰島素抵抗。應(yīng)激也可以是一個(gè)促進(jìn)因 素。最重要的因素是體重、遺傳、內(nèi)分泌紊亂（例如生殖年齡婦女的多囊卵巢綜合征）、衰老 和久坐不動(dòng)的生活方式（即，低體力活動(dòng)和過(guò)量的熱量攝入）。有關(guān)于肥胖或胰島素抵抗 是否是代謝綜合征的原因或它們是否是達(dá)到更深遠(yuǎn)的代謝紊亂的后果的爭(zhēng)論。許多全身炎 癥的標(biāo)記物，包括C-反應(yīng)性蛋白，常常是增加的，纖維蛋白原、白介素6、腫瘤壞死因子-α (TNFa)和其它也是如此。有些人指出了各種原因，包括由膳食果糖引起的尿酸水平增加。 中心性肥胖是該綜合征的一個(gè)重要特征，反映了這樣一個(gè)事實(shí)，即該綜合征的流行率受腰 圍和不斷增加的肥胖之間的強(qiáng)烈關(guān)系驅(qū)動(dòng)。然而，盡管肥胖的重要性，具有正常體重的患者 也可能是胰島素-抵抗的并患有該綜合征。估計(jì)75%的患有2型糖尿病或葡萄糖耐量受損 (IGT)的英國(guó)患者具有代謝綜合征。這些人群中代謝綜合征的存在與CVD的更高流行率有 關(guān)，這樣的流行率高于患有2型糖尿病或IGT而無(wú)綜合征的患者中發(fā)現(xiàn)的。
[0012] 低脂連蛋白血癥已表明增加胰島素抵抗，并被認(rèn)為是發(fā)生代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)因 素。冠心病（CHD)患者中代謝綜合征的近似流行率為50%，早發(fā)冠狀動(dòng)脈疾病（45歲）患 者，特別是女性的流行率為37%。采用適宜的心臟康復(fù)和生活方式（例如，營(yíng)養(yǎng)物、體力活 動(dòng)、體重減少和在一些情況下，藥物）的改變，該綜合征的流行率可降低。脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙的 疾病一般與代謝綜合征相關(guān)。脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙的遺傳的（例如，Berardinelli-Seip先天性 脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙、Dunnigan家族性局部脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙）和后天獲得的（例如，在用高活性抗 逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療的患者中的HIV-相關(guān)的脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙）兩種形式可產(chǎn)生嚴(yán)重的胰島 素抵抗和許多代謝綜合征的組分。
[0013] 對(duì)于許多這些炎性疾病目前仍未治愈。如果促炎反應(yīng)在這些炎性疾病中受到抑 制，或治療或減輕炎性疾病的癥狀，這將是有益的。
[0014] 已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，選自酪蛋白水解產(chǎn)物的肽抑制促炎反應(yīng)。
[0015] 本發(fā)明的公開內(nèi)容 在第一方面，本公開內(nèi)容涉及一種通過(guò)給予包含酪蛋白水解產(chǎn)物的組合物，抑制促炎 反應(yīng)的方法。
[0016] 在第二方面，本公開內(nèi)容涉及通過(guò)給予包含酪蛋白水解產(chǎn)物的組合物，治療炎性 疾病的方法。
[0017] 在又一方面，本公開內(nèi)容涉及通過(guò)給予包含酪蛋白水解產(chǎn)物的組合物，減少促炎 細(xì)胞因子的水平的方法。
[0018] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，炎性疾病選自1型糖尿病、 克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、代謝綜合征、HLA-DQ8相關(guān)疾病、HLA-DQ2相關(guān)疾病和腹腔疾 病。
[0019] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子選自IL-1、 IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β、IL20 家族的成員、IL33、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、TGF-β、 GM-CSF、IL11、IL12 和 IL18。
[0020] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含酪蛋白水解產(chǎn)物的組 合物是營(yíng)養(yǎng)組合物。
[0021] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，酪蛋白水解產(chǎn)物是牛乳水 解產(chǎn)物。
[0022] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物是含有廣泛水解 的牛乳肽的水解產(chǎn)物。
[0023] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物，其中含有廣泛 水解的牛乳肽的水解產(chǎn)物是含有廣泛水解的牛酪蛋白的水解產(chǎn)物。
[0024] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物由分子量超過(guò) 500 Da的肽組成。
[0025] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物包含至少一種選 自SEQ ID NO: 1-68的肽，優(yōu)選地至少2種肽，優(yōu)選地至少3種肽，優(yōu)選地至少4種肽，優(yōu)選 地至少5種肽。
[0026] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物包含至少一種選 自SEQ ID NO: 1-24的肽，優(yōu)選地至少2種肽，優(yōu)選地至少3種肽，優(yōu)選地至少4種肽，優(yōu)選 地至少5種肽。
[0027] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物包含至少一種選 自SEQ ID NO: 1-15的肽，優(yōu)選地至少2種肽，優(yōu)選地至少3種肽，優(yōu)選地至少4種肽，優(yōu)選 地至少5種肽。
[0028] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物包含至少一種選 自SEQ ID NO: 1-12的肽，優(yōu)選地至少2種肽，優(yōu)選地至少3種肽，優(yōu)選地至少4種肽，優(yōu)選 地至少5種肽。
[0029] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物以包含脂質(zhì)或脂 肪相和蛋白質(zhì)源的營(yíng)養(yǎng)組合物給予。
[0030] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)組合物包含約0. 1-約 I g/100 kcal的益生元組分，其中益生元組分包含至少20%的寡糖。
[0031] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)組合物還包含約5-約 100 mg/100 kcal的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸源，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸源包含二十二碳六 烯酸。
[0032] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)組合物還包含花生四 烯酸。
[0033] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物被給予人，優(yōu)選 兒童或青少年。
[0034] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解產(chǎn)物被給予成人。
[0035] 在本公開內(nèi)容和/或其實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，人具有牛乳過(guò)敏。
[0036] 附圖簡(jiǎn)述 圖1 :??Μ-1模型的示意圖：A.胃室;B.幽門括約??；C.十二指腸室；D.蠕動(dòng)閥；E. 空腸室；F.蠕動(dòng)閥；G.回腸室；H.回盲括約肌；1.胃分泌；J.十二指腸分泌；K.空腸/ 回腸分泌；L.預(yù)過(guò)濾器；M.半滲透膜；N.水吸收；p pH電極；e.水平傳感器；R.溫度傳 感器；S.壓力傳感器。
[0037] 圖2 :模擬嬰兒胃消化后經(jīng)LC-MS (mlz 230-2000)觀察到的本公開內(nèi)容的酪蛋白 水解產(chǎn)物的肽分布的比較。在消化前、消化后（TlM)、以及消化和進(jìn)一步透析后描述肽分布。
[0038] 圖3.在T=18下，在暴露于本公開內(nèi)容的含有消化的酪蛋白水解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)組合 物（因此>500Da)(以低濃度（9. 5 mg/ml)或高濃度（19 mg/ml)加入并用454焦磷酸測(cè) 序測(cè)定）后，本公開內(nèi)容的含有酪蛋白水解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)糞便發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的微生物群 落中擬桿菌屬水平的影響。y-軸描述序列數(shù)目的IO-Iog值，其與豐度正相關(guān)。
[0039] 圖4.在T=18下，在暴露于本公開內(nèi)容的含有消化的酪蛋白水解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)組合 物（因此>500Da)(以低濃度加入并用454焦磷酸測(cè)序測(cè)定）后，糞便發(fā)酵實(shí)