由撕裂蠟孔菌培養(yǎng)基制備提取物的方法和由此制備的用于預(yù)防或治療糖尿病和糖尿病并 ...的制作方法
【專利說明】由撕裂蠟孔菌培養(yǎng)基制備提取物的方法和由此制備的用于 預(yù)防或治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的含有撕裂蠟孔菌培養(yǎng) 基提取物作為活性成分的藥物組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及由撕裂錯(cuò)孔菌（Ceriporia Iacerata)的菌絲培養(yǎng)基制備提取物的方 法，和由該制備方法制備的用于預(yù)防或治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物。
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)說明
[0003] 撕裂蠟孔菌是一種白腐真菌，其進(jìn)行共代謝即木質(zhì)素分解以在生態(tài)系統(tǒng)中使用碳 源如纖維素、半纖維素等。
[0004] 撕裂蠟孔菌的存在首次報(bào)道于2002年，因此關(guān)于撕裂蠟孔菌工業(yè)化的研究非常 少。已報(bào)道的只有關(guān)于撕裂蠟孔菌用于防止土壤污染和漂白的用途的兩種類型的研究。
[0005] 至于撕裂蠟孔菌用于食品和藥品的用途的研究，以本發(fā)明人的名字提交的名稱為 "制備用于預(yù)防和治療糖尿病的撕裂蠟孔菌培養(yǎng)物提取物的方法和由此制備的撕裂蠟孔菌 培養(yǎng)物提取物"的10-1031605號(hào)韓國專利是世界上僅有的研究。然而上述專利文獻(xiàn)僅提到 了提取物對(duì)1型糖尿病的效果。
[0006] 迄今研發(fā)的糖尿病治療劑包括降血糖劑和胰島素注射液，但這些藥劑僅僅延緩了 糖尿病的進(jìn)展，并不能起到預(yù)防和治療糖尿病的藥劑的作用。
[0007] 對(duì)于糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的治療，需要研發(fā)阻止疾病進(jìn)展的物質(zhì)。另外，需要研 發(fā)使調(diào)節(jié)胰島素分泌的胰腺β細(xì)胞再生或促進(jìn)胰腺β細(xì)胞再生的物質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)包含在撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物和其干物質(zhì)中的標(biāo)記物質(zhì)胞外多 糖是用于阻礙糖尿病進(jìn)展和促進(jìn)胰腺β細(xì)胞再生非常有效的物質(zhì)。因此，急需關(guān)于鑒定撕 裂蠟孔菌中胞外多糖的結(jié)構(gòu)和增加胞外多糖含量的最適培養(yǎng)方法的發(fā)現(xiàn)方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明要解決的問題
[0010] 因此，作出了本發(fā)明以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，且本發(fā)明的一個(gè)目的是 提供由撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基制備提取物的改善的方法，該方法可增加胞外多糖的含 量。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的藥物組合 物，該藥物組合物含有通過該制備方法由撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基制備的胞外多糖含量增 加的提取物作為活性成分。
[0012] 解決問題的手段
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種由撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基制備提取物的方 法，該方法包括以下步驟：在液體中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲，干燥培養(yǎng)物以形成粉末并由該粉 末制備溶劑提取物，其中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲的培養(yǎng)基包含l-2wt%的食糖、0. 2-lwt%的 葡萄糖、0· 2-lwt%的淀粉、0· 1-0. 5wt%的高梁粉、0· 1-0. 5wt%的大麥粉、0· 2-2wt%的大 豆粉、0· 05-0.1 wt % 的硫酸鎂（MgSO4)、0· 05-0.1 wt % 的磷酸二氫鉀（KH2PO4)、0· 05-0.1 wt % 的磷酸氫二鉀（K2HPO4)和92-98wt%的水，且pH為4· 5-6. 0。
[0014] 該培養(yǎng)優(yōu)選在藍(lán)LED光源下進(jìn)行。
[0015] 該培養(yǎng)優(yōu)選在1000-2000ppm的二氧化碳濃度下進(jìn)行。
[0016] 本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，該藥物組 合物含有通過該制備方法由撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基制備的胞外多糖含量增加的提取物 作為活性成分。
[0017] 該糖尿病可以是2型糖尿病。
[0018] 該糖尿病并發(fā)癥可選自高血糖、動(dòng)脈粥樣硬化、微血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病和腎 病。
[0019] 發(fā)明效果
[0020] 根據(jù)由撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基制備提取物的方法，與由本發(fā)明人根據(jù)現(xiàn)有技術(shù) 文獻(xiàn)中描述的方法制備的提取物相比，根據(jù)本發(fā)明方法制備的提取物具有相對(duì)高含量的胞 外多糖，因此其可用作用于糖尿病的藥物組合物或相關(guān)功能食品的活性成分。
[0021] 附圖簡要說明
[0022] 圖Ia和Ib示出了根據(jù)本發(fā)明的撕裂蠟孔菌菌株的ITS-5. 8S rDNA測(cè)序結(jié)果。
[0023] 圖2a是示出殘留糖含量隨撕裂蠟孔菌菌株培養(yǎng)物中pH和糖種類變化的圖，且圖 2b是示出培養(yǎng)產(chǎn)物的相片。
[0024] 圖3是示出菌絲生長和胞外多糖含量隨糖種類變化的圖。
[0025] 圖4是示出菌絲生長和胞外多糖含量隨葡萄糖濃度變化的圖。
[0026] 圖5是示出菌絲生長和胞外多糖含量隨氮源變化的圖。
[0027] 圖6是示出菌絲生長和胞外多糖含量隨氮源大豆粉的濃度變化的圖。
[0028] 圖7是示出菌絲生長和胞外多糖含量隨微量元素變化的圖。
[0029] 圖8是示出菌絲生長和胞外多糖含量隨微量元素 MgSO4變化的圖。
[0030] 圖9是示出5L培養(yǎng)基中菌絲生長和胞外多糖含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化的圖。
[0031] 圖10是示出測(cè)量純培養(yǎng)物中胞外多糖的分子量的結(jié)果的圖。
[0032] 圖11示意性示出了分析本發(fā)明的撕裂蠟孔菌菌絲培養(yǎng)基提取物抗糖尿病的活性 的實(shí)驗(yàn)過程。
[0033] 圖12示出了用撕裂蠟孔菌菌絲培養(yǎng)物提取物治療的2型糖尿病小鼠的食物攝入 量。
[0034] 圖13示出了用撕裂蠟孔菌菌絲培養(yǎng)物提取物治療的2型糖尿病小鼠的水?dāng)z入量。
[0035] 圖14示出了用撕裂蠟孔菌菌絲培養(yǎng)物提取物治療的2型糖尿病小鼠的體重增加 模式。
[0036] 圖15示出了正常小鼠、2型糖尿病小鼠和用撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物治療 的小鼠的肝狀況。
[0037] 圖16是示出血糖水平隨時(shí)間變化的圖。
[0038] 圖17是示出口服施用葡萄糖后血糖水平隨時(shí)間變化的圖。
[0039] 圖18是示出用撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物喂養(yǎng)6周的小鼠處死后的血糖水 平的圖。
[0040] 圖19a和19b是示出撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物以與胰島素相似的方式促進(jìn) 脂肪細(xì)胞分化的圖和顯微圖。
[0041] 圖20是示出撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物引起的脂肪細(xì)胞分化程度隨胰島素 的存在或不存在而變化的圖。
[0042] 圖21a和21b示出撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物引起的脂肪細(xì)胞中的胰島素信 號(hào)傳遞。
[0043] 圖22是示出撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物引起的脂肪細(xì)胞中的GLUT4表達(dá)水 平的圖。
[0044] 發(fā)明的最佳實(shí)施方式
[0045] 本發(fā)明提供了由撕裂蠟孔菌菌絲培養(yǎng)基制備提取物的方法，該方法包括以下步 驟：在液體中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲，干燥培養(yǎng)物以形成粉末并由該粉末制備溶劑提取物，其 中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲的培養(yǎng)基包含l_2wt%的食糖、0. 2-lwt%的葡萄糖、0. 2-lwt%的淀 粉、0· 1-0. 5wt%的高梁粉、0· 1-0. 5wt%的大麥粉、0· 2-2wt%的大豆粉、0· 05-0. lwt%的硫 酸鎂（MgSO4)、0· 05-0.1 wt % 的磷酸二氫鉀（KH2PO4)、0· 05-0.1 wt % 的磷酸氫二鉀（K2HPO4) 和 92-98wt % 的水，且 pH 為 4. 5-6. 0。
[0046] 發(fā)明詳述
[0047] 以下將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0048] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，具有阻礙糖尿病和糖尿病并發(fā)癥進(jìn)展和促進(jìn)β細(xì)胞再生的優(yōu) 異效果的標(biāo)記物質(zhì)是撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物提取物的胞外多糖，且本發(fā)明人已研發(fā)出由 撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基制備提取物的方法，其可增加胞外多糖含量，和用于預(yù)防或治療 糖尿病和糖尿病并發(fā)癥的含有撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基提取物的藥物組合物，從而完成了 本發(fā)明。
[0049] 因此，本發(fā)明提供了一種由撕裂蠟孔菌菌絲培養(yǎng)基制備提取物的方法，該方法包 括以下步驟：在液體中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲，干燥培養(yǎng)物以形成粉末并由該粉末制備溶 劑提取物，其中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲的培養(yǎng)基包含l_2wt%的食糖、0. 2-lwt %的葡萄糖、 0· 2-lwt%的淀粉、0· 1-0. 5wt%的高梁粉、0· 1-0. 5wt%的大麥粉、0· 2-2wt%的大豆粉、 0· 05-0.1 wt % 的硫酸鎂（MgSO4)、0· 05-0.1 wt % 的磷酸二氫鉀（KH2PO4)、0· 05-0.1 wt % 的磷 酸氫二鉀（K2HPO4)和 92-98wt % 的水，且 pH 為 4. 5-6. 0。
[0050] 該培養(yǎng)優(yōu)選在藍(lán)LED光源下進(jìn)行。
[0051] 該培養(yǎng)優(yōu)選在1000-2000ppm的二氧化碳濃度下進(jìn)行。
[0052] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)基的提取物可通過包括以 下步驟的方法制備：
[0053] (a)培養(yǎng)撕裂蠟孔菌菌絲以獲得撕裂蠟孔菌的菌絲培養(yǎng)物；
[0054] (b)真空干燥或凍干該培養(yǎng)物以形成粉末；以及
[0055] (C)用選自水、乙醇和甲醇中的一種或多種溶劑對(duì)該粉末進(jìn)行提取。
[0056] 步驟（a)中的撕裂蠟孔菌菌絲的液體培養(yǎng)是通過在液體中培養(yǎng)撕裂蠟孔菌 的菌絲以獲得胞外多糖而進(jìn)行的。用于液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物可包含l_2wt%的食 糖、0· 2-lwt %的葡萄糖、0· 2-lwt %的淀粉、0· 1-0. 5wt %的高梁粉、0· 1-0. 5wt %的大麥 粉、0· 2-2wt %的大豆粉、0· 05-0.1 wt %的硫酸鎂（MgSO4)、0· 05-0.1 wt %的磷酸二氫鉀 (KH2PO4)、0· 05-0. lwt% 的磷酸氫二鉀（K2HPO4)和 92-98wt% 的水。
[0057] 本文中，液體培養(yǎng)優(yōu)選在20-25 °C的溫度，4. 5-6. 0的pH，0.