人和大型哺乳動物肺生物反應器的制造方法
【專利說明】人和大型晡乳動物肺生物反應器
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]該申請要求2013年I月8日提交的美國臨時申請?zhí)?1/750，088的權益，其全部內容通過引用被并入本文。
[0003]關于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
[0004]該發(fā)明按照由國立衛(wèi)生研究院(NIH)授予的授權號HL111016在政府支持下作出。政府在發(fā)明中具有一定的權利。
[0005]發(fā)明背景
[0006]組織工程化是一個正在成長的領域，其尋求組合細胞、分子、工藝和醫(yī)學進展以產生適合移植和實驗室研究的替換組織。有希望的工作已對許多種組織，包括血管、膀胱、心臟辦膜和心臟組織進行(Nichols et al,.2008, Proc Am Thor Soc 5:723 - 30 ；Satchell等，2004，J Am Soc Nephrol 15:566 - 74 ;Atala 等，2006，Lancet 367:1241 - 6 ；0rfanos等，2004, Intensive Care Med 30:1702 - 14)。然而，肺是在實驗室中難以工程化的組織。肺需要復雜的基質，其可經得起呼吸的機械壓迫，其可支撐內皮、上皮和間充質細胞的生長，并且其提供用于兩個非常不同但親密并置的區(qū)室之間的氣體交換的手段。進一步，大型哺乳動物肺一一包括人肺一一的工程化受到器官的大尺寸的阻礙。人規(guī)模的肺的有效培養(yǎng)中的困難包括提供充分的無菌環(huán)境和提供大且笨重的器官的結構支撐。進一步，可以防止給這樣的大組織提供培養(yǎng)基的成本。
[0007]因此，本領域存在用于大型哺乳動物肺組織培養(yǎng)的生物反應器系統(tǒng)開發(fā)的需要。本發(fā)明滿足本領域中的該需要。
[0008]附圖簡述
[0009]為了說明發(fā)明的目的，附圖中描述發(fā)明的某些實施方式。然而，發(fā)明不限于附圖中描述的實施方式的精確排列和機構。
[0010]圖1是發(fā)明的示例性生物反應器系統(tǒng)的示意圖。
[0011]圖2是發(fā)明的生物反應器的一個實施方式的示例性室的示意圖。
[0012]圖3是發(fā)明的生物反應器的一個實施方式的示例性液壓驅動裝置的示意圖。
[0013]圖4是發(fā)明的生物反應器的一個實施方式的示例性血管驅動裝置和血管環(huán)路的示意圖。
[0014]圖5是發(fā)明的生物反應器的一個實施方式的示例性氣管環(huán)路的示意圖。
[0015]圖6是描述發(fā)明的生物反應器的一個實施方式的示例性室和工程化肺的示意圖。
[0016]圖7是描述肺與示例性套管入口的連接的圖。
[0017]圖8是描述發(fā)明的生物反應器的一個實施方式的示例性室和胸膜袋的圖。
[0018]圖9是描述發(fā)明的一個實施方式的示例性室、液壓驅動裝置和血管驅動裝置的圖。
[0019]圖10是描述發(fā)明的一個實施方式的示例性血管驅動裝置的圖。
[0020]發(fā)明詳述
[0021]本發(fā)明包括用于大型哺乳動物肺組織培養(yǎng)的生物反應器系統(tǒng)。在一個實施方式中，生物反應器系統(tǒng)為工程化人肺的去細胞化、再細胞化和培養(yǎng)提供無菌環(huán)境。在一個實施方式中，生物反應器系統(tǒng)提供工程化肺高度可控的灌注和通氣。在一個實施方式中，生物反應器能通過液壓驅動的負壓，用多種流體和氣體使肺通氣和灌注肺，以及以生理速度和壓力提供血管灌注和通氣。生物反應器能夠使流體通過脈管系統(tǒng)灌注、使流體或空氣移動進和出氣道，以及使肺通過負(和正)壓通氣等等。
[0022]在一個實施方式中，本發(fā)明包括在本發(fā)明的生物反應器系統(tǒng)中培養(yǎng)的工程化大型哺乳動物肺。相應地，發(fā)明包括作為再生醫(yī)學形式的血管化肺組織的產生的方法和組合物。在一個實施方式中，工程化肺組織來自去細胞化的天然肺組織。去細胞化的組織基本上沒有細胞和DNA。優(yōu)選，去細胞化的組織也沒有免疫原性分子。更優(yōu)選，去細胞化的組織保留對細胞附著和增殖重要的幾種關鍵的細胞外基質分子。
[0023]在一個實施方式中，工程化大型哺乳動物肺包括體外三維模型，其例如用于研究肺發(fā)育生物學。此外，該模型用于藥物發(fā)現(xiàn)、毒性試驗、疾病病理學等等。在一個實施方式中，體外模型概括了表明(reminiscent of)由與宿主循環(huán)緊密連接的導管上皮組成的肺泡形成單元的結構形成。
[0024]發(fā)明還包括減輕或治療哺乳動物，優(yōu)選人中肺缺陷的方法。該方法包括給需要其的哺乳動物施用治療有效量的包括發(fā)明的三維構建物的組合物，從而減輕或治療哺乳動物中的肺缺陷。
[0025]定義
[0026]除非另外限定，本文使用的所有的技術和科學術語通常具有與該發(fā)明所屬領域技術人員通常理解的相同的意思。通常，本文使用的命名法和細胞培養(yǎng)中的實驗室操作、分子遺傳學、有機化學和核酸化學和雜交都是在本領域眾所周知和通常使用的那些。
[0027]本文使用冠詞“一(a)”和“一(an)”來指一個或超過一個(S卩，至少一個)的冠詞的語法對象。通過實例，“一要素”指一個要素或超過一個要素。
[0028]如本文所用，“約”當提到可測量的值如量、短暫的持續(xù)時間等時，意為包括與指定值± 20 %或± 10 %、更優(yōu)選± 5 %、甚至更優(yōu)選土 I %和更優(yōu)選± 0.1 %的變化，因為這樣的變化適合進行公開的方法。
[0029]術語“前體細胞”、“祖細胞”和“干細胞”在本領域中可互換地使用，并且如本文所用指多能性或譜系未定型(lineage-committed)的祖細胞，其潛在地能夠進行無限數(shù)目的有絲分裂以更新自身或產生將分化成期望的細胞類型的后代細胞。與多能性干細胞相比，譜系未定型的祖細胞通常被認為不能產生很多表現(xiàn)型上彼此不同的細胞類型。而是，祖細胞產生一種或可能地兩種譜系未定型的細胞類型。
[0030]如本文所用，“人多能性干細胞”(hPS)指這樣的細胞，其可來自任何來源，并且其能在適當?shù)臈l件下產生是所有3個生發(fā)層(內胚層、中胚層和外胚層)的衍生物的不同細胞類型的人后代。hPS細胞可具有在8-12周齡的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在組織培養(yǎng)中形成所有三個胚層的可識別細胞的能力。人多能性干細胞的定義中包括多種類型的胚胎細胞，包括文獻中人胚泡來源的干(hBS)細胞一一常常稱作人胚胎干(hES)細胞，(參見，例如，Thomson等(1998), Heins et.al.(2004)，以及誘導的多能性干細胞(參見，例如 Yu 等，(2007) Science 318:5858) ;Takahashi 等，(2007)Cell 131 (5):861)。本文描述的各種方法和其它實施方式可需要或利用許多種來源的hPS細胞。例如，適合使用的hPS細胞可獲自發(fā)育的胚胎。另外或可選地，合適的hPS細胞可獲自建立的細胞系和/或人誘導的多能性干(hiPS)細胞。
[0031]如本文所用“hiPS細胞”指人誘導的多能性干細胞。
[0032]如本文所用，術語“支架”和“組織支架”指這樣的結構，其包括提供適合細胞粘附和增殖的表面的生物相容性材料。支架可進一步提供機械穩(wěn)定性和支撐。支架可以是特定形狀或形式以影響或劃界增殖細胞群體呈現(xiàn)的三維形狀或形式。這樣的形狀或形式包括，但不限于，膜(例如具有基本上大于第三維的二維的形式)、帶、索、片、平碟、圓柱、球、3-維無定形的形狀等。
[0033]如本文所用，“支撐支架”指較大的、肉眼可見的系統(tǒng)以機械地定位和錨定組織支架。
[0034]如本文所用，“生物相容性”指當植入哺乳動物時不在哺乳動物中引起不利反應的任何材料。當引入個體時，生物相容性材料對該個體無毒或無害，也不在哺乳動物中引起材料的免疫排斥。
[0035]如本文所用，“自體”指來自同一個體的生物材料，該材料隨后將再導入到該個體中。
[0036]如本文所用，“同種異體”指來自相同物種的遺傳上不同的個體的生物材料，該材料隨后將再導入到該個體中。
[0037]如本文所用，“移植物”指植入個體或結構，通常替換、糾正或另外克服缺陷的細胞、組織或器官。移植物可進一步包括支架。組織或器官可由源于同一個體的細胞組成；該移植物在本文由以下可互換的術語引用:“自身移植物(autograft) ”、“自體移植(autologous transplant) ”、“ 自體植入物(autologous implant) ” 和“自體移植物(autologous graft)”。包括來自相同物種的遺傳上不同個體的細胞的移植物在本文由以下可互換的術語引用:“同種異身移植物(allograft) ”、“同種異體移植(allogeneictransplant) ”、“同種異體植入物(allogeneic implant) ”和“同種異體移植物(allogeneicgraft)”。從個體至他的同卵雙生的移植物在本文稱作“同種移植物(isograft) ”、“同基因移植(syngeneic transplant) ”、“ 同基因植入物(syngeneic implant) ” 或“同基因移植物(syngeneic graft)”。“異種移植物(xenograft) ”、“異基因移植(xenogeneictransplant) ”或“異基因植入物(xenogeneic implant) ”指從不同物種的一個個體至另一個的移植物。
[0038]如本文所用，術語“組織移植”和“組織重建”均指將移植物植入個體以治療或減輕組織缺陷，如肺缺陷或軟組織缺陷。
[0039]如本文所用，“減輕”疾病、缺陷、病癥或狀況指減小疾病、缺陷、病癥或狀況的一個或多個癥狀的嚴重性。
[0040]如本文所用，“治療”指減少患者經歷的疾病、缺陷、病癥或不利狀況等的癥狀的頻率
[0041 ] 如本文所用，“治療有效量”是足以給組合物施用的個體提供有益作用的發(fā)明的組合物的量。
[0042]如本文所用，術語“生長培養(yǎng)基”意欲指促進細胞生長的培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基將通常含有動物血清。在一些實例中，生長培養(yǎng)基可不含有動物血清。在一些實例中，生長培養(yǎng)基將促進細胞增殖。
[0043]“分化培養(yǎng)基”在本文用于指這樣的細胞生長培養(yǎng)基，其包括添加物或缺少添加物以至于干細胞、胎兒肺細胞或沒有完全分化的其它這樣的祖細胞當在培養(yǎng)基中溫育時發(fā)育成具有分化細胞特性中的一些或全部的細胞。
[0044]如本文所用，術語“生長因子”指對細胞具有生長、增殖、分化或營養(yǎng)作用的蛋白質、肽、促分裂原或其它分子。生長因子包括，但不限于，成纖維細胞生長因子(FGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子-1 (IGF-T)、胰島素樣生長因子-1I (IGF-1I)、血小板衍生的生長因子(TOGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、激活素-A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、胰島素、生長激素、紅細胞生成素、血小板生成素、白細胞介素3 (IL-3)、白細胞介素6 (IL-6)、白細胞介素7 (IL-7)、巨噬細胞集落刺激因子、c-kit配體/干細胞因子、骨保護素配體、胰島素、神經生長因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、細胞因子、趨化因子、形態(tài)發(fā)生素、中和抗體、其它蛋白和小分子。優(yōu)選，F(xiàn)GF選自FGF2、FGF7、FGFlO和其任何組合。
[0045]“分離的細胞”指已與組織或哺乳動物中天然伴隨的其它組分和/或細胞分離的細胞。
[0046]如本文所用，“胎兒肺細胞”(FPCs)指從胚胎的肺組織分離的細胞?；旌系腇PCs群體可包括，但不限于，上皮、間質和內皮細胞。
[0047]如本文所用，“上皮細胞”指形成身體外表面和用作器官、腔和粘膜表面襯里的細胞。
[0048]如本文所用，“內皮細胞”指用作血液和淋巴管和多種其它體腔襯里的細胞。
[0049]如本文所用，“基本上純化的”細胞是基本上沒有其它細胞類型的細胞。因此，基本上純化的細胞指已從以其天然存在的狀態(tài)與其正常結合的其它細胞類型純化的細胞。
[0050]“可擴張性”在本文用于指細胞增殖，例如，以在數(shù)目上擴張或，在細胞群體的情況下，經歷群體倍增的能力。
[0051]“增殖”在本文用于指相似的形式，特別是細胞的生殖或繁殖。即，增殖包括更大數(shù)目的細胞的產生，并可通過簡單地計數(shù)細胞數(shù)目、測量3H-胸苷摻入細胞等等來測