增強對腸病原體免疫應答的組合物和方法
【專利說明】增強對腸病原體免疫應答的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本專利申請要求2013年3月15日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/790, 301的優(yōu) 先權(quán)，該臨時專利申請的全部內(nèi)容在此通過引用并入此處。
[0003] 序列表
[0004] 本申請是電子提交的，并且包含電子提交的txt格式的序列表。該txt文件包含 題目為"2014-03-14_5658-00203_ST25. txt"的序列表，其創(chuàng)建于2014年3月14日，大小 是31093字節(jié)。這個txt文件中包含的序列表是說明書的一部分，因此通過引用其全部并 入此處。
[0005] 引言
[0006] 細菌感染仍然給人類以及農(nóng)業(yè)和家養(yǎng)動物造成顯著的健康危害。抗生素抗性的 增長提高了對在農(nóng)業(yè)中避免使用抗生素的需要，以及開發(fā)替代方法來控制細菌感染和人類 食品供應的細菌污染的需要。沙門氏菌屬（Salmonella)和大腸桿菌（E.coli)通常被報 道是世界范圍內(nèi)人類食物傳播的感染的細菌原因，流行病學證據(jù)表明包括家禽和家禽產(chǎn)品 在內(nèi)的肉制品是人類感染的主要來源。在美國，每年報告估計一百四十萬例的人類沙門氏 菌病。在這些病例中，雖然有一些其它血清變種也顯示在人類中導致腸炎，但最常分離的 是腸炎沙門氏菌血清變種（S.enterica serovars Enteritidis) (SE)和鼠傷寒沙門氏菌 (Typhimurium) (ST)。和重大感染率有關(guān)的其它革蘭氏陰性細菌包括志賀氏菌屬（Shigella spp)、弧菌屬（Vibrio spp)、歐文氏菌屬（Erwinia spp)、克雷伯菌屬（Kebsiella spp)、 枸橡酸桿菌屬（Citrobacter spp)、耶爾森氏菌屬（Yersinia spp)、普羅維登斯菌屬 (Providencia spp)及類似細菌。需要控制這些細菌感染的新方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 公開了一種疫苗載體，其包含編碼PAL多肽的第一多核苷酸序列。PAL多肽是疫苗 載體中異源的、非天然表達的重組多肽。PAL多肽選自：SEQ ID NO :1、和SEQ ID NO :1具有 90%同一性的序列，比如SEQ ID NO :6、或其至少6個氨基酸長的免疫原性片段。多肽可表 達在疫苗載體的表面上。SEQ ID NO :1的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4、SEQID NO :5、SEQ ID NO :36 或 SEQ ID NO :37。疫苗載體還可以包含編碼 免疫刺激多肽的第二多肽序列。免疫刺激多肽也可以表達在疫苗載體的表面上。免疫刺激 多肽可以是能夠與⑶40結(jié)合的⑶154多肽或HMGBl多肽。⑶154多肽包含少于50個氨基 酸，并且包含氨基酸140-149或其同源物。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以包含在載體內(nèi)，載體如病毒、酵母、細菌、或脂質(zhì)體。一方 面，所述疫苗包含多核苷酸，其編碼SEQ ID NO :42、44或46的多肽，或者和這些序列之一具 有90 %同一性的序列。藥物組合物可以由此處所述的疫苗載體和藥學上可接受的載體組 成。
[0009] 又一個方面，提供了通過向受試者施用此處所述的疫苗載體而增強受試者對革蘭 氏陰性細菌免疫應答的方法。增強的免疫應答可以是增強的抗體應答、增強的T細胞應答 或兩者皆有。
[0010] 又一個方面，提供了通過向受試者施用此處所述的疫苗載體而降低受試者和革蘭 氏陰性細菌感染相關(guān)的發(fā)病率或死亡率的方法。與對照相比，在施用疫苗載體的受試者中， 疫苗載體能夠降低與繼發(fā)革蘭氏陰性細菌感染相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。
【附圖說明】
[0011] 圖1的圖顯示，以IO8Cfu/雞通過鹽水、或芽孢桿菌屬骨架（BS BB)或PAL-載體 化BS疫苗（BS PAL)候選物的口服灌胃所進行的接種后第17天，用合成PAL-BSA作為包 被抗原，通過ELISA確定PAL序列特異性血清IgG抗體水平。結(jié)果表示為S/P比的平均值 土SEM(n = 10)。使用AN0VA，不同大寫字母的組顯著不同（P〈0. 05)。
[0012] 圖2的圖顯示，以IO8Cfu/雞通過鹽水、或芽孢桿菌屬骨架（BS BB)或PAL-載體 化BS疫苗候選物（BSNNP)的口服灌胃所進行的接種后第17天，用合成PAL-BSA作為包被 抗原，通過ELISA確定PAL序列特異性回腸 SlgA抗體水平。結(jié)果表示為S/P比的平均值 土SEM(n = 10)。使用AN0VA，不同大寫字母的組顯著不同（P〈0. 05)。
[0013] 圖3的圖中，在接受了 IO8Cfu/雞的鹽水、BSBB或PAL-BS構(gòu)建體載體化疫苗 (BSNNP)的雞中，在孵化后第17天和第21天使用常規(guī)微生物學鋪板計數(shù)法來計算鼠傷寒沙 門氏菌（Salmonella typhimurium)。所有組在孵化后的第11天接受IX 10scfu/ml ST挑 戰(zhàn)劑量。結(jié)果表示為盲腸含量的平均IogwCfu/克+SEM(η = 10)。通過AN0VA，不同大寫字 母的組顯著不同（Ρ〈〇. 05)。
[0014] 圖4的圖顯示，與對照（PBST)相比，兩個單克隆抗體（2Β5和1Β2)對指定的PAL 六肽的親和性。
[0015] 圖5的圖顯示，接種指定的疫苗株或?qū)φ罩?，?1日齡雛雞盲腸中分離的海德 堡沙門氏菌（Salmonella Heidelberg)的每克菌落形成單位（cfu)。通過AN0VA，不同大寫 字母的組顯著不同（P〈〇. 05)。
[0016] 圖6的圖顯示，接種指定的疫苗株或?qū)φ罩螅瑥?1日齡和33日齡雛雞盲腸中 分離的海德堡沙門氏菌的每克菌落形成單位（cfu)。通過AN0VA，帶星號的組顯著不同 (Ρ〈0· 05) 〇
[0017] 圖7的圖顯示，接種指定的疫苗株或?qū)φ罩?，來?8日齡雛雞盲腸中的海德堡 沙門氏菌的陽性回收百分比。通過AN0VA，不同大寫字母的組顯著不同（Ρ〈0. 05)。
[0018] 圖8的圖顯示，指定疫苗株的小鼠巨噬細胞的吞噬百分比。通過AN0VA，不同大寫 字母的組顯著不同（Ρ〈〇. 05)。
【具體實施方式】
[0019] 抗革蘭氏陰性細菌的常規(guī)疫苗通?；诨畹?減毒的細菌，其常常以受控數(shù)目通 過注射進行遞送。革蘭氏陰性細菌非常多樣，不同物種的細菌之間、甚至是相同物種內(nèi)的不 同株之間的抗原多樣性已經(jīng)使得針對一種以上的單株或血清變種的接種變得困難。已經(jīng)開 發(fā)了重組疫苗，但由于抗原的多樣性，重組疫苗一般只限于增強對單一物種或甚至細菌的 單一株的免疫應答。能夠保護免受多個血清變種以及確實免受一種以上革蘭氏陰性細菌物 種的疫苗將是最佳的。此外，可以口服的疫苗會使施用更便宜，更具順應性（compliance)。 提供了一種疫苗，其包含PAL的高度保守區(qū)域，PAL是一種廣泛發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陰性生物中的 肽聚糖相關(guān)脂蛋白。
[0020] 重組DNA技術(shù)使操作許多酵母、細菌和病毒物種變得相對容易。一些微生物是輕 度致病性的或非致病性的，但是能夠產(chǎn)生強烈的免疫應答。這些微生物成為有吸引力的疫 苗載體，用于激發(fā)對載體中所重組表達的抗原的免疫應答。以微生物作為載體的疫苗可以 模擬天然感染，有助于產(chǎn)生強且持久的粘膜免疫，而且生產(chǎn)和施用相對便宜。許多這些疫苗 載體可口服施用，降低了成本和對專業(yè)施用人員的需要，并降低了施用抗性。此外，這樣的 載體經(jīng)常攜帶一種以上的抗原，并具有提供保護以免受多重感染原（infectious agent)的 潛能。
[0021] -種疫苗，包含任何含有編碼抗原性多肽的多核苷酸的組合物，其中抗原性多肽 能夠激發(fā)對多肽的免疫應答。疫苗載體是可被工程改造成攜帶抗原和任選其它免疫刺激多 肽的組合物，并且還可以包含佐劑、或與佐劑一起施用以進一步提高對寄生蟲的免疫應答， 并提供更好的保護免受繼發(fā)感染相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。此處公開了載體如細菌、病毒或 酵母載體用于接種和產(chǎn)生對腸病原體的免疫應答的用途。腸病原體可以包括，但不限于大 腸桿菌（E. coli)、沙門氏菌屬（Salmonella)以及實施例表1中公開的其它腸微生物。施用 此處所述疫苗載體后的免疫應答不需要是完全保護性的，但可降低腸病原體繼發(fā)感染相關(guān) 的發(fā)病率或死亡率百分比（即，死亡的概率）。
[0022] -方面，提供了一種疫苗載體，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列 編碼SEQ ID NO: 1-6、32、36或37中的至少一個，或編碼這些序列中任何一個的至少6個氨 基酸長的免疫原性片段。提供了疫苗載體，其也可包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸編 碼免疫刺激多肽。適當?shù)?，PAL多肽或其免疫原性片段以及免疫刺激多肽表達在疫苗載體的 表面上。SEQ ID NO :1多肽的免疫原性片段可包含SEQ ID NO :2-5或36-40中的任意一個 或其組合、或者至少六個氨基酸的任何其它片段。例如，抗原性多肽可包含、基本上由以下 組成或由以下組成：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、或任意這些 SEQ ID NO 的 免疫原性片段或組合。
[0023] 抗原性多肽的免疫原性片段可以是至少6、8、10、12、14、16、18或20個氨基酸長， 并和此處所提供的SEQ ID NO具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%百分比同一性的序列。一種疫苗，包含任何含有編碼抗原性多肽的多核苷酸的組合 物，所述抗原性多肽能夠在施用該疫苗的受試者中激發(fā)對多肽的免疫應答。公開了載體如 細菌載體用于接種和產(chǎn)生對腸細菌的免疫應答的用途，腸細菌包括但不限于沙門氏菌屬 (Salmonella spp)、埃希氏菌屬（Escherichia spp)、志賀氏菌屬（Shigella spp)、弧菌屬 (Vibrio spp)、歐文氏菌屬（Erwinia spp)、克雷伯菌屬（Kebsiella spp)、枸橡酸桿菌屬 (Citrobacter spp)、耶爾森氏菌屬（Yersinia spp)、普羅維登斯菌屬（Providencia spp) 或類似細菌，比如表1中列出的那些。
[0024] 編碼此處提供的抗原性多肽或者編碼來自任何數(shù)目致病性生物的其它抗原的多 核苷酸可插入到載體中，并在載體中表達。在載體中表達這些多核苷酸將允許在免疫受試 者之后產(chǎn)生對抗原性多肽的免疫應答。多核苷酸可以插入到載體的染色體中或者編碼在質(zhì) ?；蚱渌旧w外DNA上。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在多種用于在載體（如沙門氏菌屬 或芽孢桿菌屬）中獲得多核苷酸表達的方法。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，多核苷酸 可以可操作地連接到啟動子（例如，組成型啟動子、誘導型啟動子等）。適當?shù)兀幋a抗原性 多肽的多核苷酸被插入到載體中，例如細菌載體，從而表達該