低與感染相關(guān)的發(fā)病率或死亡率。免疫刺激多 肽可以用于增強(qiáng)受試者對(duì)除了抗原性PAL多肽以外的任何外源抗原或存在于疫苗載體上 的抗原性多肽的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，免疫刺激多肽可用于增強(qiáng)對(duì)存在于疫 苗載體的一個(gè)以上的抗原性多肽的免疫應(yīng)答。增強(qiáng)免疫應(yīng)答包括但不限于誘導(dǎo)由受試者的 免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的治療或預(yù)防效果。尤其是，增強(qiáng)免疫應(yīng)答可包括但不限于增強(qiáng)的抗體產(chǎn)生、 增強(qiáng)的抗體重鏈的類別轉(zhuǎn)換、抗原遞呈細(xì)胞的成熟、輔助性T細(xì)胞的刺激、刺激細(xì)胞毒性T 細(xì)胞或誘導(dǎo)T和B細(xì)胞記憶。
[0053] 適當(dāng)?shù)兀鲆呙巛d體包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包括HMGBl多肽（SEQ ID NO : 15)的氨基酸150-183和89-109或其同源物。在實(shí)施例中，使用HMGBl的190個(gè)氨 基酸的多肽。適當(dāng)?shù)兀嗪塑账峋幋a和受試者相同物種的HMGBl多肽。HMGBl多肽和受試者 (例如，人HMGBl多肽用于雞疫苗）的異源組合可用在本發(fā)明的方法中，這是因?yàn)镠MGBl在 各物種之間是高度保守的。HMGBl多肽可用于增強(qiáng)受試者對(duì)任何外源抗原、抗原性多肽或存 在于疫苗載體中或疫苗載體上的一個(gè)以上多肽的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，HMGBl 多肽可用于增強(qiáng)對(duì)存在于疫苗載體中一個(gè)以上的抗原性多肽的免疫應(yīng)答。來自HMGBl的 多肽至少部分地通過激活樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答，從而刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子如 IL-1、IL-6、IFN-γ和TNF-α。在實(shí)施例中，HMGBl的多肽表達(dá)在疫苗載體的表面上。
[0054] 適當(dāng)?shù)?，疫苗載體可以含有能夠結(jié)合⑶40并激活⑶40的⑶154多肽。以增強(qiáng)或 影響受試者對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的有效量，將包含編碼能夠結(jié)合CD40的CD154多肽的多核苷酸 的疫苗施用至受試者。適當(dāng)?shù)?，疫苗包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含人CD154多肽 (SEQ ID NO :25)的氨基酸140-149或其同源物。如上所述，源自一個(gè)物種的氨基酸140-149 的同源物可用于刺激不同物種中的免疫應(yīng)答。適當(dāng)?shù)兀嗪塑账峋幋a來自和受試者相同物 種的⑶154多肽。適當(dāng)?shù)?，編碼SEQ ID NO :26的多肽的多核苷酸用在人受試者中，編碼SEQ ID NO :27的多肽的多核苷酸用在雞中，編碼SEQ ID NO :28的多肽的多核苷酸用在鴨中，編 碼SEQ ID NO :29的多肽的多核苷酸用在小鼠中，以及編碼SEQ ID NO :30的多肽的多核苷 酸用在牛中。人CD154多肽（SEQ ID N0:26)已被用在雞疫苗中并被證明增強(qiáng)對(duì)外源抗原 的免疫應(yīng)答。從而，CD154多肽和受試者的其它異源組合可用于本發(fā)明的方法中。
[0055] 此外，公開了增強(qiáng)對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌免疫應(yīng)答的方法以及降低與革蘭氏陰性細(xì)菌 繼發(fā)感染相關(guān)的發(fā)病率的方法，其中革蘭氏陰性細(xì)菌選自沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏 菌屬、弧菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬、耶爾森氏菌屬、普羅維登斯菌屬和 類似的細(xì)菌。簡(jiǎn)單地說，方法包括以有效量向受試者施用疫苗載體，所述疫苗載體包含編 碼抗原性PAL多肽的第一多核苷酸序列和任選編碼免疫刺激多肽的第二多核苷酸。抗原 性PAL多肽可以包括SEQ ID NO :1-6。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式將抗原性 PAL多肽插入到載體中，包括但不限于通過引用全部并入此處的BMC Biotechnol. 2007九 月 17:7 (I):59Scarless and Site-directed Mutagenesis in Salmonella Enteritidis chromosome中所述的無痕（scarless)定點(diǎn)突變系統(tǒng)，以及如通過引用全部并入此處的 Nguyen和Schumann J Biotechnol 2006122:473-482中所述此處所用的方法。載體也可經(jīng) 工程化改造而表達(dá)抗原性PAL多肽以及來自其它病原體的其它抗原性多肽，所述其它病原 體包括病毒如流感M2e或細(xì)菌如沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬或大腸桿菌。特別是，能與CD40 結(jié)合的CD154或HMGBl的多肽可由載體表達(dá)，以增強(qiáng)受試者對(duì)抗原性PAL多肽的免疫應(yīng)答。
[0056] 也可以使用含抗原性多肽的組合物以降低與革蘭氏陰性細(xì)菌繼發(fā)感染相關(guān)的發(fā) 病率。組合物可以在施用有此處所述組合物或疫苗載體的受試者中防止細(xì)菌引起疾病或可 能會(huì)限制或降低任何相關(guān)的發(fā)病率。此處所述的組合物和疫苗載體，可以通過降低疾病的 時(shí)間長(zhǎng)短、體重減少、疾病癥狀的嚴(yán)重程度、降低疾病相關(guān)的發(fā)病率或死亡率或者降低感染 疾病的可能性，而降低繼發(fā)疾病的嚴(yán)重程度。組合物還可以通過抑制傳遞而減少病原體的 傳播。施用此處描述的疫苗載體后，和沒有給予疫苗載體的相似受試者相比，疾病相關(guān)的發(fā) 病率或死亡率可以降低25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%。
[0057] 為了施用至動(dòng)物或人，可以通過各種方式包括但不限于經(jīng)鼻、粘膜、通過噴霧、皮 內(nèi)、腸胃外、皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、口服、通過氣霧或肌內(nèi)施用組合物。另外適當(dāng)?shù)氖?滴眼施用、口服灌胃或此外飲水或進(jìn)食。對(duì)于禽，組合物可以卵內(nèi)施用。
[0058] 本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供增強(qiáng)受試者中免疫應(yīng)答的方法。適當(dāng)?shù)氖茉囌甙ǖ?不限于脊椎動(dòng)物，適當(dāng)?shù)夭溉閯?dòng)物，適當(dāng)?shù)厝?，以及鳥，適當(dāng)?shù)厍?，如雞或火雞。也可以使用 其它動(dòng)物如牛、貓、狗或豬。適當(dāng)?shù)?，受試者是非人，也可以是農(nóng)業(yè)動(dòng)物。
[0059] 待施用的疫苗的有用劑量將根據(jù)受試者年齡、體重和物種、施用方式和途徑以及 免疫應(yīng)答所針對(duì)的病原體類型的不同而不同?？砂凑兆阋砸鹈庖邞?yīng)答的任何劑量施用組 合物。可以設(shè)計(jì)，適當(dāng)?shù)氖莿┝糠秶鷱腎O3至101°載體拷貝（即，菌落形成單位或噬斑形成 單位），從IO4至10 9載體拷貝，或從10 5至10 7載體拷貝。
[0060] 組合物可以僅僅施用一次或可以施用兩次或更多次以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。例如，組合 物可以隔1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間施用兩次或更多次。 疫苗載體在施用之前可以包含活的微生物，但在一些實(shí)施方式中載體可在施用前滅活。在 一些實(shí)施方式中，載體能在受試者中復(fù)制，而在另一些實(shí)施方式中，載體不能在受試者中復(fù) 制，例如滅活的疫苗載體或脂質(zhì)體。失活用作載體的微生物的方法是技術(shù)人員已知的。例 如，可以使用福爾馬林、乙醇、熱暴露、或抗生素失活細(xì)菌疫苗載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可 以使用其它方法。
[0061] 可以涉及，來自相同或不同病原體的幾個(gè)表位或抗原可組合在單一疫苗中施用以 產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)抗原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。重組疫苗可以編碼來自多個(gè)致病性微生物、病毒或 腫瘤相關(guān)抗原的抗原。施用能夠表達(dá)多個(gè)抗原的疫苗具有同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)兩種或更多種疾病的 免疫的優(yōu)點(diǎn)。例如，活的減毒細(xì)菌提供適當(dāng)?shù)妮d體用于激發(fā)對(duì)來自單一病原體的多個(gè)抗原 (例如來自沙門氏菌屬的FliC和PAL)或針對(duì)來自不同病原體（例如，流感和沙門氏菌屬） 的多個(gè)抗原的免疫應(yīng)答。
[0062] 使用本領(lǐng)域公知的方法，可以使用編碼抗原的外源多核苷酸構(gòu)建疫苗載體，所述 抗原可插入疫苗載體的任何非必需位點(diǎn)，或者可攜帶在質(zhì)粒上或其它染色體外載體上（如 BAC或YAC)。一個(gè)適于多核苷酸插入的位點(diǎn)在跨膜蛋白外部部分內(nèi)，或者偶聯(lián)至靶向外源 多核苷酸的序列，以便分泌途徑和/或允許附著到細(xì)胞壁。一個(gè)適當(dāng)?shù)挠糜诓迦攵嗪塑账?的跨膜蛋白的示例是IamB基因。細(xì)胞壁附著的一種適當(dāng)方法在實(shí)施例中提供。
[0063] 外源多核苷酸包括但不限于編碼來自致病性微生物或病毒的抗原多核苷酸，并包 括以產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的方式而得以表達(dá)的多核苷酸。這種多核苷酸可源自致病性病毒， 如流感（例如，M2e、血凝素、或神經(jīng)氨酸苷酶）、皰疹病毒（例如，編碼皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白的 基因）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（例如，gpl60包膜蛋白）、腺病毒、副粘病毒、冠狀病毒等。外源多核苷 酸也可以獲自致病性細(xì)菌，例如編碼細(xì)菌蛋白（如毒素、外膜蛋白或其它高度保守蛋白）的 基因。此外，來自寄生蟲如頂復(fù)門寄生蟲的外源多核苷酸是用于載體疫苗的有吸引力的候 選者。
[0064] 本公開不限于此處所述的結(jié)構(gòu)、組分的安排、或方法步驟的具體細(xì)節(jié)。此處公開的 組合物和方法能夠以各種方式得以制造、操作、使用、實(shí)施和/或形成，根據(jù)以下的公開，這 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。此處所使用的措辭和術(shù)語僅是為了描述的目的，而 不應(yīng)被認(rèn)為是限制權(quán)利要求的范圍。在說明書和權(quán)利要求書中所用的順序指代如第一、第 二和第三，是指各種結(jié)構(gòu)或方法步驟，并不意圖解釋為表明任何特定的結(jié)構(gòu)或步驟，或這種 結(jié)構(gòu)或步驟的任何特定順序或構(gòu)造。除非此處另有指明或與上下文明顯矛盾，否則此處所 描述的所有方法可以按照任何適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行。除非另有聲明，否則此處所提供的任何和 所有示例或示例性語言（例如"如"）的使用，僅僅是為了便于公開，并不暗示著對(duì)公開范圍 的任何限制。說明書中的語言以及附圖中所示的結(jié)構(gòu)，不應(yīng)解釋為表示任何未要求的元素 對(duì)實(shí)施所公開的主題是必不可少的。此處術(shù)語"包括"、"包含"或"具有"及其變型的使用， 是指包括其后所列出的元素及其等同物，以及其它元素。記載為"包括"、"包含"或"具有" 某些元素的實(shí)施方式也被認(rèn)為是"基本上由這些特定元素組成"和"由這些特定元素組成"。 除非明確指明，否則術(shù)語"一"、"一個(gè)"和"該"可表示一個(gè)或一個(gè)以上。
[0065] 除非此處另有指明，否則此處對(duì)值的范圍的描述僅僅旨在作為一種速記方法，從 而單獨(dú)指代落在范圍之內(nèi)各獨(dú)立的值，并且各個(gè)獨(dú)立的值并入說明書，就好像它在此處單 獨(dú)列舉一樣。例如，如果濃度范圍表示為1 %至50%，這意味著，如2%至40%、10%至30%、 或1%至3%等值在本說明書中得以明確列舉。這些示例僅僅是所具體意圖的，之間所有可 能的數(shù)值組合并且包括所列舉的最低值和最高值被認(rèn)為在本公開中得以明確描述。用來 描述具體記載的量或量的范圍的字眼"約"，其意圖表示非常接近所記載的量的值包括在該 量的范圍內(nèi)，例如由于制造公差（manufacturing tolerance)、形成測(cè)量中儀器和人為的誤 差等，而可能地或天然地將考慮在內(nèi)的值。除非另有指明，否則所有百分?jǐn)?shù)是指按重量計(jì)的 量。
[0066] 以下實(shí)施例僅是說明性的，并且不意味著作為對(duì)本發(fā)明或所附權(quán)利要求的范圍的 限制。此處引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利公開和非專利文獻(xiàn)，通過引用其全部并入 此處。參考文獻(xiàn)中的陳述和此處所做的那些陳述之間的任何沖突，應(yīng)當(dāng)以有利于此處所含 陳述的方式來解決。
[0067] 實(shí)施例
[0068] 我們選擇來自大腸桿菌的Pal多肽作為高度保守的多肽，其包含在革蘭氏 陰性致病性細(xì)菌之間高度保守的并且免疫原性的多肽。我們通過從Pal的氨基酸 106-124 (P0A912)中選擇大腸桿菌序列來開始。使用針對(duì)見于EMBL和NCBI數(shù)據(jù)庫中所公 開序列的網(wǎng)絡(luò)蛋白序列分析（Network Protein Sequence Analysis)程序（Combet，C.，C. Blanchet, C. Geourjon 和 G. Deleage. 2000. NPSO:network protein sequence analysis. Trends Bioch