和最后新生組織產(chǎn)生的形式將高密度的修復(fù)勝任細(xì)胞(或當(dāng)受局部環(huán)境影響時(shí)可變得能勝任的細(xì)胞)遞送到缺陷部位。本發(fā)明的組合物特別用于減輕或治療個(gè)體中肺組織缺陷的方法。有利地，發(fā)明的組合物提供改進(jìn)的肺組織再生。具體地，由于發(fā)明的組合物，更迅速地實(shí)現(xiàn)組織再生。
[0153]有利地，發(fā)明的組合物和方法代表對(duì)現(xiàn)有技術(shù)方法的改進(jìn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于治療肺組織缺陷的組合物包括干細(xì)胞，優(yōu)選iPS細(xì)胞，其接種在支架上并體外培養(yǎng)以產(chǎn)生3維培養(yǎng)物，如本文別處所描述的。
[0154]用于藥物發(fā)現(xiàn)的模型
[0155]本發(fā)明提供適合允許測(cè)試化合物關(guān)于肺部疾病或病癥治療活性評(píng)價(jià)的體外方法。優(yōu)選，所述方法包括工程化三維肺組織的應(yīng)用。
[0156]發(fā)明基于用于大型哺乳動(dòng)物肺組織培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)。在一些實(shí)例中，肺組織自去細(xì)胞化的肺支架產(chǎn)生，其可用合適的細(xì)胞接種。在一些實(shí)例中，含有上皮、間質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的混合iPS細(xì)胞群體用于產(chǎn)生三維工程化肺組織。例如，將iPS細(xì)胞置于三維去細(xì)胞化肺組織內(nèi)。因此，模型并入了 iPS細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)和與鄰近細(xì)胞的細(xì)胞間通信的影響。三維肺組織模擬天然的肺組織，例如工程化肺組織顯示天然肺組織例證的分枝形態(tài)發(fā)生。因此，在某些實(shí)施方式中，發(fā)明的生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的工程化肺組織充當(dāng)用于評(píng)價(jià)各種組合物性質(zhì)的模型。
[0157]該模型用于關(guān)于肺組織病理學(xué)測(cè)試藥物。此外，該模型可用于檢查治療劑的特定遞送載體對(duì)肺組織病理學(xué)的影響，例如以比較通過(guò)不同遞送系統(tǒng)施用的相同藥劑的影響，或只是評(píng)價(jià)是否遞送載體自身(例如病毒載體)能影響肺病理學(xué)。
[0158]在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明提供針對(duì)測(cè)試藥劑調(diào)節(jié)肺組織健康的能力篩選測(cè)試藥劑的體外方法。該方法包括使測(cè)試藥劑與工程化三維肺組織模型接觸和測(cè)量測(cè)試藥劑具有的對(duì)肺組織模型的影響。在存在測(cè)試藥劑的情況下對(duì)模型的任何改變是測(cè)試藥劑能調(diào)節(jié)肺組織健康的指示。
[0159]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供觀察測(cè)試藥劑具有的對(duì)肺組織的影響的體外方法，包括以下步驟:
[0160]a)提供至少一個(gè)三維肺組織模型，其中模型意欲模仿正常肺組織；
[0161]b)使測(cè)試藥劑與肺組織模型接觸；和
[0162]c)觀察測(cè)試藥劑具有的對(duì)肺組織模型的影響。
[0163]組織模型是這樣的構(gòu)建物，其包括支架例如膠原基質(zhì)上三維排列的細(xì)胞和至少一種測(cè)試細(xì)胞。該方法包括觀察測(cè)試藥劑對(duì)肺組織病理學(xué)的影響。然而該方法可進(jìn)一步包括觀察測(cè)試藥劑對(duì)肺組織的個(gè)別細(xì)胞類(lèi)型的影響的步驟。
[0164]測(cè)試藥劑可以是任何藥劑，包括化學(xué)藥劑(如毒素)、藥物、肽、蛋白質(zhì)(如抗體、細(xì)胞因子、酶等)和核酸一一包括基因藥物和導(dǎo)入的基因，其可編碼治療劑如蛋白質(zhì)、反義藥劑(即包括與靶細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的靶RNA互補(bǔ)的序列的核酸，如RNAi或siRNA)、核酶等。另外或可選地，測(cè)試藥劑可以是物理劑如輻照(例如電離輻照、紫外線或熱)；這些可單獨(dú)或與化學(xué)和其它藥劑組合測(cè)試。
[0165]該模型還可用于測(cè)試遞送載體。這些可以具有任何形式，從常規(guī)的藥物制劑到基因遞送載體。例如，該模型可用于比較對(duì)通過(guò)兩種或多種不同遞送系統(tǒng)(例如貯存庫(kù)制劑(depot formulat1n)和控制釋放制劑)施用的相同藥劑的治療效果的影響。它還可用于研究是否特定的載體可具有它自己對(duì)組織的影響。隨著基于基因的治療法增加，與多種可能的遞送系統(tǒng)相關(guān)的安全性問(wèn)題變得日益重要。因此本發(fā)明的模型可用于研究用于核酸治療法的遞送系統(tǒng)的性質(zhì)，如裸露DNA或RNA病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體)、月旨質(zhì)體等。因此測(cè)試藥劑可以是具有或沒(méi)有任何相關(guān)治療劑的任何適當(dāng)類(lèi)型的遞送載體。
[0166]測(cè)試藥劑可利用任何合適的手段加入將被測(cè)試的模型。例如，測(cè)試藥劑可滴加到模型表面上和允許擴(kuò)散進(jìn)或另外進(jìn)入模型，或它可加入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和允許通過(guò)器官灌注。該模型還適合測(cè)試物理劑如電離輻照、紫外線或熱單獨(dú)或與化學(xué)藥劑組合(例如，在光動(dòng)力學(xué)療法中)的效果。
[0167]觀察測(cè)試藥劑具有的對(duì)模型的影響可利用許多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，特定的藥劑可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡。細(xì)胞中可檢測(cè)的變化可包括細(xì)胞面積、體積、形狀、形態(tài)學(xué)、標(biāo)志表達(dá)(例如細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá))或其它合適的特征，如染色體片段化的變化。細(xì)胞數(shù)目也可被監(jiān)測(cè)以便觀察測(cè)試藥劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響；這可直接例如通過(guò)計(jì)數(shù)存在的特定細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)目，或間接例如通過(guò)測(cè)量特定細(xì)胞群的大小進(jìn)行分析。這些可利用例如合適的熒光細(xì)胞染色在未受損的模型上直接或間接進(jìn)行觀察。這可通過(guò)用活體染料或遺傳上導(dǎo)入的熒光標(biāo)記(例如綠色熒光蛋白)預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，用于活體模型的連續(xù)分析，或通過(guò)固定和用熒光物質(zhì)如碘化丙啶或熒光標(biāo)記的抗體后標(biāo)記?？蛇x地，模型可通過(guò)正常的組織學(xué)方法，如利用針對(duì)合適的細(xì)胞靶標(biāo)的抗體的免疫組織化學(xué)，或原位雜交處理以檢測(cè)特定mRNA種類(lèi)的表達(dá)。而且，這可以以自動(dòng)/機(jī)器人或半自動(dòng)方式利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件實(shí)施以在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)使細(xì)胞成像和檢測(cè)例如細(xì)胞密度、位置和/或形態(tài)學(xué)的任何變化。共聚焦激光掃描顯微鏡檢查特別地允許未損傷模型的三維分析。因此它可能直接應(yīng)用于未損傷的三維肺組織模型、細(xì)胞行為的定量分析一一其正常僅對(duì)常規(guī)的二維培養(yǎng)中的細(xì)胞是可能的。通過(guò)該手段，細(xì)胞增殖、凋亡、壞死、迀移和基質(zhì)侵入等的定量的連續(xù)分析在三維肺組織模型中獲得，該三維肺組織模型架起常規(guī)的二維細(xì)胞培養(yǎng)和活體動(dòng)物模型之間間隔的橋梁。
[0168]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例
[0169]發(fā)明通過(guò)參考以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例而被進(jìn)一步詳細(xì)地描述。提供這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明的目的，而不是意欲被限制，除非另外說(shuō)明。因此，發(fā)明應(yīng)決不被解釋為受限于以下實(shí)施例，而應(yīng)被解釋為包括由于本文提供的教導(dǎo)而變得明顯的任何和全部變化。
[0170]無(wú)需進(jìn)一步的描述，據(jù)認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用先前的描述和以下說(shuō)明性的實(shí)施例，制備和利用本發(fā)明的化合物和實(shí)施要求保護(hù)的方法。因此以下操作實(shí)施例具體地指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而不被解釋為以任何方式限制公開(kāi)的剩余部分。
[0171]實(shí)施例1:牛物反應(yīng)器
[0172]設(shè)計(jì)和構(gòu)建本發(fā)明的生物反應(yīng)器，目標(biāo)是工程化人或大型哺乳動(dòng)物肺構(gòu)建物的去細(xì)胞化、再接種和生長(zhǎng)。示例性生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0173].在去細(xì)胞化和培養(yǎng)的所有階段期間為構(gòu)建物提供無(wú)菌環(huán)境。
[0174].允許反應(yīng)器內(nèi)工程化肺容易的套管插入和安裝，以及當(dāng)肺被安裝在反應(yīng)器中時(shí)外科套管插入術(shù)的容易觀察。
[0175].提供反應(yīng)器內(nèi)可靠地定位和定向肺的方式
[0176].允許無(wú)菌環(huán)境外部反應(yīng)器的拆卸和臺(tái)式維修而沒(méi)有損害肺自身的無(wú)菌度
[0177].減少全部肺培養(yǎng)需要的培養(yǎng)基體積。這是重要的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)榇篌w積(10-30升)的細(xì)胞特定的培養(yǎng)基在應(yīng)用如這個(gè)中一周花費(fèi)數(shù)萬(wàn)美元。
[0178].提供方法以與體內(nèi)器官經(jīng)歷的高度相似的速度和體積使器官負(fù)壓呼吸(同時(shí)如需要，仍然允許正壓呼吸)，允許可變的呼吸體積、壓力和速度。這必須以絕不損害無(wú)菌度的方式進(jìn)行。
[0179].提供方法以與體內(nèi)器官經(jīng)歷的高度相似的搏動(dòng)方式通過(guò)器官的脈管系統(tǒng)來(lái)灌注流體，允許可變的每搏輸出量、壓力和速度。這必須以絕不損害無(wú)菌度的方式進(jìn)行。
[0180].允許第三方監(jiān)測(cè)/傳感設(shè)備或技術(shù)的容易整合
[0181].設(shè)計(jì)容易使用、緊湊、自含式和針對(duì)工作站之間輸送容易移動(dòng)的系統(tǒng)。
[0182]本發(fā)明的生物反應(yīng)器的非限制的實(shí)例在圖1-10中描繪。
[0183]本文引用的每個(gè)和每一個(gè)專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物的公開(kāi)內(nèi)容在此以它們的全部通過(guò)引用被并入本文。
[0184]雖然該發(fā)明已參考【具體實(shí)施方式】被公開(kāi)，但是明顯的是該發(fā)明的其它實(shí)施方式和變化可由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)而不背離發(fā)明的真正精神和范圍。所附權(quán)利要求意欲被解釋包括所有這樣的實(shí)施方式和等同的變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于大型哺乳動(dòng)物肺組織的生物反應(yīng)器，包括具有容納至少一個(gè)大型哺乳動(dòng)物肺的尺寸的室、將流體遞送到肺脈管系統(tǒng)的血管環(huán)路和將流體遞送到肺氣道的氣管環(huán)路。2.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述室包括支撐支架以對(duì)所述肺提供支持。3.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述室包括包圍所述肺的胸膜袋和與所述肺的套管連接的套管入口，其中所述胸膜袋和套管入口提供包圍所述肺的隔離無(wú)菌流體室。4.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述室包括液壓儲(chǔ)存器，其通過(guò)隔離橫板與所述室的其余部分分尚。5.權(quán)利要求4所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器進(jìn)一步包括液壓驅(qū)動(dòng)裝置，其將流體栗進(jìn)和栗出所述液壓儲(chǔ)存器，從而引起所述肺的膨脹和收縮。6.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行液壓驅(qū)動(dòng)的負(fù)壓通氣。7.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行正壓通氣。8.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行液壓驅(qū)動(dòng)的負(fù)壓灌注。9.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行正壓通氣。10.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行搏動(dòng)性灌注。11.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠?qū)⒘黧w的前進(jìn)、倒退、循環(huán)和振蕩流動(dòng)施用給所述肺的所述氣道和脈管系統(tǒng)。12.權(quán)利要求11所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠通過(guò)液壓驅(qū)動(dòng)的負(fù)壓通氣和正壓通氣將流體遞送給所述脈管系統(tǒng)，并進(jìn)一步能夠通過(guò)液壓驅(qū)動(dòng)的負(fù)壓通氣和正壓通氣將流體遞送給所述氣道。13.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠?qū)⒘黧w同時(shí)遞送到所述肺脈管系統(tǒng)的所述動(dòng)脈側(cè)和靜脈側(cè)，然后通過(guò)所述肺的負(fù)壓收縮排出所述流體。14.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述血管環(huán)路包括波紋管驅(qū)動(dòng)裝置。15.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述血管環(huán)路將去細(xì)胞化溶液遞送到所述肺以使所述肺去細(xì)胞化。16.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述氣管環(huán)路將去細(xì)胞化溶液遞送到所述肺以使所述肺去細(xì)胞化。17.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述血管環(huán)路將包括細(xì)胞的溶液遞送到所述肺。18.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述氣管環(huán)路將包括細(xì)胞的溶液遞送到所述肺。19.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠使大型哺乳動(dòng)物肺去細(xì)胞化。20.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠使大型哺乳動(dòng)物肺再細(xì)胞化。21.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠支持肺部細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。22.權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中將所述肺用細(xì)胞群體接種。23.權(quán)利要求17所述的生物反應(yīng)器，其中所述細(xì)胞群體包括干細(xì)胞。24.組合物，其包括權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工程化大型哺乳動(dòng)物肺。25.體外模型，其包括權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工程化大型哺乳動(dòng)物肺。26.針對(duì)調(diào)節(jié)肺組織健康的能力篩選測(cè)試藥劑的方法，所述方法包括使所述測(cè)試藥劑與權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工程化大型哺乳動(dòng)物肺接觸和測(cè)量所述測(cè)試藥劑對(duì)所述肺功能的影響，其中所述肺功能的任何改變是所述測(cè)試藥劑能夠調(diào)節(jié)所述肺組織健康的指不。27.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述測(cè)試藥劑通過(guò)所述生物反應(yīng)器的血管環(huán)路或氣管環(huán)路施用給所述工程化肺。28.減輕或治療大型哺乳動(dòng)物中肺缺陷的方法，所述方法包括給所述大型哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的工程化大型哺乳動(dòng)物肺。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供用于大型哺乳動(dòng)物肺組織的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行液壓驅(qū)動(dòng)的負(fù)壓和正壓灌注和通氣。灌注和通氣以生理學(xué)速度遞送并容易可控。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器包括支撐大型哺乳動(dòng)物肺組織大小的支撐支架。在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器包括胸膜袋，其提供包圍工程化肺的小隔離流體室，從而最小化需要的培養(yǎng)基的量。本發(fā)明還提供檢查測(cè)試藥劑功能的體外模型和減輕大型哺乳動(dòng)物中肺缺陷的組合物和方法。
【IPC分類(lèi)】A01N1/00, A61K35/42, A01N63/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105142652
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480004326
【發(fā)明人】M·S·B·拉雷登, T·拉雷登, L·尼克拉森
【申請(qǐng)人】耶魯大學(xué), 拉雷登資源公司
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2014年1月8日
【公告號(hào)】CA2896619A1, EP2943208A1, US20150289501, WO2014110135A1