一種從松木層孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種從松木層孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，所述方法包括：取松木層孔菌子實(shí)體，剪碎后用超臨界萃取儀進(jìn)行CO2超臨界萃取脫脂，取萃余物40～50℃熱風(fēng)干燥2～3h后粉碎，加入質(zhì)量為萃余物質(zhì)量15～30倍的70～95%（v/v）甲醇或乙醇水溶液，微波沸騰提取20～40min，過(guò)濾或離心去渣，取上清液真空濃縮，冷凍或真空干燥，即得所述α-葡萄糖苷酶抑制劑。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：松木層孔菌作為民間藥用真菌已有較長(zhǎng)的應(yīng)用歷史，毒副作用較小、安全性高；本發(fā)明方法不涉及有毒有害溶劑，安全性高，制得α-糖苷酶抑制劑活性高，十分有利于后續(xù)醫(yī)藥保健食品的開(kāi)發(fā)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種從松木層孔菌中提取Cl -葡萄糖苷酶抑制劑的方法(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從松木層孔菌中提取α -葡萄糖苷酶抑制劑的方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]藥用真菌是一類(lèi)具有較高藥用價(jià)值的高等真菌，普遍具有抗腫瘤、降血糖、降血月旨、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等幾種或多種功效。
[0003]糖尿病是一種慢性、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌紊亂疾病，與癌癥、心血管疾病一起被視為世界性三大疾病。糖尿病患者長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可引起微血管和大血管以及神經(jīng)損害，導(dǎo)致眼、腎、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等功能障礙，產(chǎn)生多種并發(fā)癥。最近幾十年隨著人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、工作壓力過(guò)大，以及人口老齡化等因素不斷加劇，糖尿病發(fā)生率快速攀升。根據(jù)世界著名醫(yī)學(xué)雜志Lancet統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病人數(shù)目前有近4億！這還不包括數(shù)量更多的糖耐量減低癥潛在人群。而我國(guó)的糖尿病患者人數(shù)近I億，居世界首位，已經(jīng)跨入糖尿病高患病率國(guó)家行列，糖尿病年治療費(fèi)用達(dá)1700多億元人民幣！在臨床上根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同，糖尿病主要分為I型(胰島素依賴(lài)型)和II型糖尿病(非胰島素依賴(lài)型)，其中后者占總數(shù)的90%左右。
[0004]α -葡萄糖苷酶抑制劑(alpha-glucosidase inhibitors),如德國(guó)拜耳研發(fā)的阿卡波糖(Acarbose，商品名:拜糖蘋(píng))、米格列醇(Miglitol，商品名:奧恬蘋(píng))和日本武田制藥的伏格列波糖(Voglibose,商品名:倍欣)是目前使用最普遍的抗II型糖尿病臨床口服藥，目標(biāo)是控制血糖在合理的水平，并預(yù)防和治療并發(fā)癥。在生產(chǎn)上，除阿卡波糖為生物發(fā)酵法合成外，米格列醇和伏格列波糖普遍采用化學(xué)修飾或化學(xué)合成法。
[0005]上述用于治療II型 糖尿病的α -葡萄糖苷酶抑制藥物雖然控制血糖作用肯定，但需長(zhǎng)期服藥，且出現(xiàn)較多不良反應(yīng)，如導(dǎo)致低血糖、乳酸性中毒、胃腸道反應(yīng)和耐藥性等，在使用具有一定的局限性。而且國(guó)內(nèi)應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要是進(jìn)口或?qū)＠谒帲瑑r(jià)格相對(duì)較貴，對(duì)多數(shù)長(zhǎng)期服藥的糖尿病患者經(jīng)濟(jì)壓力較大。
[0006]我國(guó)是最早認(rèn)識(shí)和利用食藥真菌的國(guó)家之一，目前已臨床藥用的有靈芝、茯苓、豬苓、猴頭、雷丸和冬蟲(chóng)夏草等二十余種，真菌代謝產(chǎn)物具有多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型和多種生理活性，是尋找新的天然藥物的重要來(lái)源。但是目前對(duì)食藥用菌的大量藥理研究主要集中在其水溶性多糖(尤其是β_葡聚糖)的增強(qiáng)免疫和抗腫瘤方面，對(duì)其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)也大多集中于此。而對(duì)其中的醇提物(三萜、皂甙和酚類(lèi)等小分子物質(zhì))的深入研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)要少的多。
[0007]目前已有在食藥用菌抗糖尿病、降血糖和α-糖苷酶抑制方面主要集中于樺褐孔菌(Inonotus obiiquus)多糖方面。如1999年日本的Mizuno T等人研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌的菌絲和菌核中的多糖有降低血糖的作用，水溶性和非水溶性多糖對(duì)糖尿病小鼠都有降血糖作用，活性成分主要是β-葡聚糖、雜多糖和蛋白復(fù)合物。2005年，韓國(guó)的Yang B.K.等人研究發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組，糖尿病小鼠口服樺褐孔菌菌絲體可減少23.1%的血糖濃度。2006年，韓國(guó)的Cha, Jae-Young等人發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌發(fā)酵物可降低糖尿病小鼠的血糖水平。Mizuno T等從樺褐孔菌菌核和菌絲體中提取和部分純化得到含蛋白的多糖。實(shí)驗(yàn)表明可溶和不可溶性多糖均有降血糖的作用。其有效成分為葡聚糖、雜多糖及它們的蛋白質(zhì)復(fù)合物。在我國(guó)，延邊大學(xué)的張香花等人在2008年的研究表明樺褐孔菌提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的胰島、肝和腎組織損傷病變有一定的保護(hù)和修復(fù)作用。2008年，江南大學(xué)的孫軍恩研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌發(fā)酵菌粉及其多糖提取物具有良好的降血糖、降血脂和抗氧化能力。而且樺褐孔菌發(fā)酵菌粉及其多糖組分可能降糖機(jī)理包括修復(fù)糖尿病小鼠受損胰島β細(xì)胞、促進(jìn)胰島素分泌、增加肝糖原含量和提高糖尿病小鼠抗氧化能力。
[0008]而小分子的酚類(lèi)物質(zhì)是指在苯環(huán)上具有一個(gè)或多個(gè)羥基的化合物，主要包括黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)等單體和鞣酸、單寧類(lèi)等多聚物。酚類(lèi)化合物具有抗氧化、抗癌、抗過(guò)敏、消炎、降血脂、抑制動(dòng)脈硬化和抗衰老等多種功效，是近幾十年來(lái)活性物質(zhì)研究的熱點(diǎn)之一，但其對(duì)α-糖苷酶的抑制作用和降血糖功能在近十余年才逐漸有報(bào)道。
[0009]在醇提物的酚類(lèi)抗糖尿病方面，目前的研究報(bào)道還很少，如2009年，天津大學(xué)的盧雪明等人采用乙醇回流提取、梯度萃取得樺褐孔菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，對(duì)其進(jìn)行黃酮和多酚類(lèi)化合物的含量測(cè)定，并測(cè)定了總還原力、清除DPPH自由基、抑制肝脂質(zhì)過(guò)氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性四種體外模型對(duì)不同提取物活性的影響，結(jié)果顯示乙酸乙酯和正丁醇提取物所含的黃酮和多酚類(lèi)化合物較多且抗氧化和α-糖苷酶活性較好。2012年，陜西師范大學(xué)的張化朋研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的乙醇粗提物萃取組分對(duì)α-淀粉酶有抑制活性，而粗多糖對(duì)α -葡萄糖苷酶有抑制作用。
[0010]松木層孔菌(Phellinus pini)又名松針層孔菌、松白腐菌，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)、傘菌綱，鎊革孔菌目(Hymenochaetales),鎊革孔菌科(Hymenochaetaceae),木層孔菌屬(Phellinus)。松木層孔菌是一種能引起樹(shù)材腐朽的白腐真菌,主要寄生于云杉、落葉松等針葉樹(shù)活立木上，易引起木質(zhì)部形成白色腐朽，對(duì)樹(shù)木危害較大。已有研究表明松木層孔菌子實(shí)體多糖具有一定 的抗病毒和抗氧化活性，其菌絲體多糖對(duì)小鼠離體淋巴細(xì)胞也有較顯著的促增殖作用。
[0011]發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)松木層孔菌水提多糖具有一定抑制α -葡萄糖苷酶活性，半抑制濃度(IC50)為 2.17mg/mL。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明目的是提供一種從松木層孔菌中提取α -葡萄糖苷酶抑制劑的方法，按照該方法，提取的α -葡萄糖苷酶抑制劑中總酚含量為12~20%，對(duì)α -葡萄糖苷酶的平均半抑制濃度(IC50)僅為0.081mg/mL，活性大為提高，是水提多糖活性的26.8倍。
[0013]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0014]一種從松木層孔菌中提取α -葡萄糖苷酶抑制劑的方法，所述方法包括:取松木層孔菌子實(shí)體，剪碎(至0.3~0.6cm3的小塊為宜)，用超臨界萃取儀進(jìn)行CO2超臨界萃取脫月旨，超臨界萃取條件:壓強(qiáng)20~30MPa，溫度30~50°C，靜態(tài)萃取I~2h，動(dòng)態(tài)放料0.3~
0.6h ;取萃余物40~50°C熱風(fēng)干燥2~3h后粉碎，加入質(zhì)量為萃余物質(zhì)量15~30倍的70~95% (v/v)甲醇或乙醇水溶液，微波沸騰提取20~40min，過(guò)濾或離心去渣，取上清液真空濃縮(≤45°C,0.08MPa以下)，冷凍或真空干燥(真空干燥為≤45°C,0.08MPa以下)，即得所述α-葡萄糖苷酶抑制劑。
[0015]優(yōu)選的，所述微波提取時(shí)微波功率為500~600W。
[0016]發(fā)明人在十幾種食藥用菌子實(shí)體多種提取工藝探索比較和α-糖苷酶抑制活性篩選前提下，通過(guò)超臨界脫脂，微波輔助甲醇浸提，真空濃縮、冷凍干燥或真空干燥等技術(shù)方法，建立了如上說(shuō)的一種安全性高、活性強(qiáng)的松木層孔菌α -糖苷酶抑制劑的提取方法和工藝。本發(fā)明在脫脂時(shí)采用超臨界CO2脫脂，可以起到部分除雜的目的，相比常規(guī)的石油醚等有機(jī)溶劑浸提脫脂方法，具有無(wú)毒、提取條件適中、環(huán)境友好等特點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:松木層孔菌作為民間藥用真菌已有較長(zhǎng)的應(yīng)用歷史，毒副作用較小、安全性高；本發(fā)明方法不涉及有毒有害溶劑，安全性高，制得α-糖苷酶抑制劑活性高，十分有利于后續(xù)醫(yī)藥保健食品的開(kāi)發(fā)。
(四)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明松木層孔菌子實(shí)體提取物的α -葡萄糖苷酶抑制活性；
[0019]圖2為阿卡波糖對(duì)α -葡萄糖苷酶抑制活性。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0021]實(shí)施例中松木層孔菌為野生來(lái)自東北林區(qū)，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所吳學(xué)謙研究員鑒定。
[0022]糖苷酶抑制 活性實(shí)驗(yàn):在試管中依次加入1.2mL磷酸鉀緩沖液(0.067mol/L磷酸鉀緩沖液，pH=6.8),50 μ L谷胱甘肽(lmg/mL)，2 μ L α -葡萄糖苷酶(0.lU/mL)和一定體積的藥用真菌α -糖苷酶抑制劑溶液，37°C保溫1min。加入50 μ L PNPG,再于37°C保溫1min后,加入1mL碳酸鈉終止液,在400mn處測(cè)定吸光值。以不加抑制劑作為空白對(duì)照，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。
[0023]α -葡萄糖苷酶活力單位定義:ρΗ6.8，37°C條件下，每分鐘釋放I μ moIPNP為一個(gè)活力單位。抑制劑活力單位定義:ΡΗ6.8，37°C條件下，使一個(gè)酶活力單位失活為一個(gè)抑制劑活力單位。樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的計(jì)算公式為:抑制率％=(酶活力-抑制劑活力)/酶活力X 100%。
[0024]總酚含量測(cè)定:采用福林酚法(Folin-C1calteu)，取適量提取物用80%甲醇溶解，提取液加入200 μ 10.1N的福林酚試劑和2000 μ I超純水，振蕩后放置3min，再加入1000 μ I碳酸鈉(20%, w/v)溶液,振蕩后室溫避光放置lh, 765nm下測(cè)定吸光值,設(shè)蒸懼水為空白對(duì)照。結(jié)果以沒(méi)食子酸的相當(dāng)量計(jì)算。
[0025]實(shí)施例1:
[0026]松木層孔菌子實(shí)體一剪碎至0.4cm3左右的小塊一稱(chēng)取50g — CO2超臨界脫脂(超臨界萃取儀:美國(guó)Applied Separat1n公司，SFE-Prime),壓力20MPa,溫度40°C,靜態(tài)萃取lh，動(dòng)態(tài)放料0.5h —萃余物50°C熱風(fēng)干燥2h后粉碎一加入原料重量20倍的80%乙醇水溶液一微波沸騰提取20min (微波提取儀:上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，MAS-1I，功率600W)—離心去渣一上清液真空濃縮(45°C, 0.05MPa)至干一加10mL蒸餾水,此處加蒸餾水的目的一是為了洗滌轉(zhuǎn)移上述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥物(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥物會(huì)粘壁，而且也不可能干燥的很徹底，需要二次干燥)，二是為了冰箱貯藏預(yù)冷凍，以方便后續(xù)凍干。一40°C、
0.06MPa下真空干燥一松木層孔菌α -糖苷酶抑制劑(含總酚12.3%) - α-葡萄糖苷酶半抑制活性 IC50=0.075mg/mL。
[0027]采用上述方法，對(duì)所得的松木層孔菌子實(shí)體提取物的α -葡萄糖苷酶抑制活性與阿卡波糖的活性進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果如圖1和圖2。
[0028]α -糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)表明，松木層孔菌提取物隨濃度增高均呈量效關(guān)系。平均半抑制濃度IC5tl為0.081mg/mL,是目前普遍使用的陽(yáng)性對(duì)照品阿卡波糖(IC5(I=4.2mg/mL)效果的51.9倍。
[0029]實(shí)施例2:
[0030]松木層孔菌子實(shí)體一剪碎至0.3cm3左右的小塊一稱(chēng)取50g — CO2超臨界脫脂(超臨界萃取儀:美國(guó)Applied Separat1n公司，SFE-Prime),壓力30MPa,溫度45°C,靜態(tài)萃取1.5h，動(dòng)態(tài)放料0.5h —萃余物45°C熱風(fēng)干燥3h后粉碎一加入原料重量30倍的95%乙醇水溶液一微波沸騰提取40min (微波提取儀:上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，MAS-1I,功率600W)—離心去洛一上清液真空濃縮(40°C,0.05MPa)至干一加80mL蒸懼水一40°C>
0.06MPa下真空干燥一松木層孔菌α -糖苷酶抑制劑(含總酚18.5%) - α-葡萄糖苷酶半抑制活性 IC5tl=0.057mg/mL。
[0031]實(shí)施例3:
[0032]松木層孔菌子實(shí)體一剪碎至0.4cm3左右的小塊一稱(chēng)取50g — CO2超臨界脫脂(超臨界萃取儀:美國(guó)Applied Separat1n公司，SFE-Prime),壓力20MPa,溫度40°C,靜態(tài)萃取Ih,動(dòng)態(tài)放料0.5h —萃余物50°C熱風(fēng)干燥2h后粉碎一加入原料重量20倍的70%甲醇水溶液一微波沸騰提取20min (微波提取儀:上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，MAS-1I，功率600W)—離心去渣一上清液真空濃縮(45°C，0.05MPa)至干一加90mL蒸餾水一冷凍一松木層孔菌α -糖苷酶抑制劑(含總酚13%) — α -葡萄糖苷酶半抑制活性IC5tl=0.081mg/mL。
[0033]實(shí)施例4:
[0034]松木層孔菌子實(shí)體一剪碎至0.3cm3左右的小塊一稱(chēng)取50g — CO2超臨界脫脂(超臨界萃取儀:美國(guó)Applied Separat1n公司，SFE-Prime),壓力30MPa,溫度45°C,靜態(tài)萃取
1.5h，動(dòng)態(tài)放料0.5h —萃余物50°C熱風(fēng)干燥2h后粉碎一加入原料重量20倍的80%甲醇水溶液一微波沸騰提取40min (微波提取儀:上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，MAS-1I，功率600W) —離心去渣一上清液真空濃縮(40°C，0.05MPa)至干一加10mL蒸餾水一冷凍一松木層孔菌α -糖苷酶抑制劑(含總酚16.0%) — α -葡萄糖苷酶半抑制活性IC5tl=0.069mg/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種從松木層孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，所述方法包括:取松木層孔菌子實(shí)體，剪碎，CO2超臨界萃取脫脂預(yù)處理，超臨界萃取條件:壓強(qiáng)20~30MPa，溫度30~50°C，靜態(tài)萃取I~2h，動(dòng)態(tài)放料0.3~0.6h ;取萃余物40~50°C熱風(fēng)干燥2~3h后粉碎，加入萃余物質(zhì)量15~30倍的70~95%甲醇或乙醇水溶液，微波沸騰提取20~40min,過(guò)濾或離心去渣，取上清液真空濃縮，冷凍或真空干燥，即得所述α -葡萄糖苷酶抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所 述的方法，其特征在于所述微波提取功率為500~600W。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK104027363SQ201410047728
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】楊開(kāi), 邢辰, 金月忠, 孫培龍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 余姚市浙工大技術(shù)轉(zhuǎn)移中心