無顯著差異，整個實驗期間體重示出增加趨勢。糖尿病對照組中的飼料和水?dāng)z入量 比正常對照組的高，且陽性對照組MET300的飼料和水?dāng)z入量顯著低于其它組的飼料和水 攝入量。
[0133] 3-2-2.器官重量
[0134] 測量了實驗動物的肝、腎、脾、腎脂肪和腹部脂肪的重量，測量結(jié)果示于下表4中。
[0135] 表 4
[0137] 肝重量在糖尿病誘導(dǎo)組中顯示快速增加的趨勢，且在樣品施用組中顯示顯著降低 的趨勢。這些結(jié)果與一旦引起糖尿病肝中脂肪就積累導(dǎo)致肝體積增加的報道一致。對于腎， 已知腎體積隨糖尿病發(fā)展初期腎小球濾過率增加而增加。在該研究中，腎重量也顯示增加 趨勢，但這種增加并不顯著。另外，這些組中的脾重量沒有顯著差異。腎脂肪重量在糖尿病 誘導(dǎo)組中快速增加，但通過施用EPS和撕裂蠟孔菌粉末而顯著降低。另外，這些組中的腹部 脂肪重量沒有顯著差異。
[0138] 3-2-3.對血糖水平奪化的影響
[0139] 圖16示出測量12小時禁食后血糖水平變化的結(jié)果。這些組中初期血糖水平相似 (約150mg/dL)，但從樣品施用一周后起開始略微降低。3周后，血糖水平快速增加，以致糖 尿病對照組的血糖水平為約400mg/dL，而二甲雙胍組的血糖水平?jīng)]有增加。其后，血糖水平 繼續(xù)增加，但施用EPS和撕裂蠟孔菌粉末的組的血糖水平相較于糖尿病對照組顯著降低。
[0140] 3-2-4. 口服葡萄糖耐量
[0141] 在樣品施用6周時測量EPS和撕裂蠟孔菌粉末的口服葡萄糖耐量，并在圖17中示 出測量結(jié)果。糖尿病對照組顯示血糖水平為600mg/dL，即血糖測定儀可測量的最高值，整個 葡萄糖耐量試驗中其維持高血糖水平。另一方面，施用EPS和撕裂蠟孔菌粉末的組顯示初 期空腹血糖水平為500mg/dL，這顯著低于糖尿病對照組的。然而，施用EPS和撕裂蠟孔菌粉 末的組的血糖水平隨時間的推移逐漸增加，30分鐘后為600mg/dL(血糖測定儀可測量的最 高值）。其后，血糖水平逐漸降低，且在180分鐘后，血糖水平恢復(fù)到近似于最初血糖水平的 520mg/dL。
[0142] 3-2-5.血糖水平
[0143] 測量口服施用EPS 6周后處死的動物的血糖水平。結(jié)果示出DM組的血糖水平增 加至約900mg/dL，而樣品施用組的血糖水平以依賴樣品濃度的方式降低。具體而言，EPS300 組的血糖水平降低至約700mg/dL，這表明EPS在降低血糖水平中起到積極作用。
[0144] 3-2-6.對血清脂質(zhì)水平的影響
[0145] 測量口服施用EPS 6周后處死的動物的血清脂質(zhì)水平。結(jié)果顯示總膽固醇和甘油 三酯水平在DM組中比NC組中的高約2倍，但在施用EPS的組中顯著較低。另外，施用EPS 的組顯示HDL膽固醇顯著增加和LDL-膽固醇水平顯著降低，這表明EPS是在不改變體重的 情況下降低2型糖尿病模型中血清脂質(zhì)水平的物質(zhì)。
[0146] 3-2-7.對腠島素、C肽和痺素水平的影響
[0147] 測量口服施用EPS 6周后處死的動物的血清胰島素、C肽和瘦素水平。結(jié)果顯示這 些組中胰島素水平?jīng)]有顯著差異，C肽水平在樣品施用組中比DM組中的高，這表明EPS激 活了胰腺中的胰島素分泌。另外，樣品施用組中瘦素水平也增加，這表明EPS在胰島素抗性 中起到積極作用。
[0148] 4.朐外多糖對3T3-L1細(xì)朐中腠島素信號傳導(dǎo)的影響
[0149] 4-1.實驗方法
[0150] 4-1-1.細(xì)朐培養(yǎng)
[0151] 脂肪前體細(xì)胞3T3-L1成纖維細(xì)胞具有良好的生物性質(zhì)，且當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下培 養(yǎng)時分化為脂肪細(xì)胞。這些細(xì)胞用于關(guān)于脂肪細(xì)胞代謝過程中脂類分解抑制或脂肪生 成的研究。另外，為胰島素靶細(xì)胞的脂肪細(xì)胞常用于關(guān)于胰島素信號傳導(dǎo)的研究。實驗 中使用的3T3-L1成纖維細(xì)胞獲自韓國細(xì)胞系庫（Korean Cell Line Bank)，并于37°C 和10% CO2下在杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM，GibcoBRL)(含有 10%胎牛血清（FBS，GibcoBRL)、200mMglutaMAX〇iibcoBRL)、盤尼 西林（penicillin) (10000單位/mL, Sigma))中培養(yǎng)，同時每隔3天用高葡萄糖培養(yǎng)基替換 該培養(yǎng)基。當(dāng)3T3-L1成纖維細(xì)胞達(dá)到60-80 %的匯合（confluence)時，用杜爾貝科磷酸 鹽緩沖鹽水（Dulbecco, s phosphate buffered saline) (PBS, GibcoBRL)洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞。 在含500 μ L2. 5%的胰蛋白酶（GibcoBRL)的75cm2燒瓶中將這些細(xì)胞于37 °C繼代培養(yǎng)5分 鐘，之后從燒瓶分離細(xì)胞。將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)含補充有10% FBS的15mL高葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基的新燒瓶中。
[0152] 4-1-2.脂肪細(xì)朐內(nèi)的葡萄糖攝入量
[0153] 培養(yǎng)3T3-L1成纖維細(xì)胞，以與上述細(xì)胞培養(yǎng)相同的方式匯合。匯合2天后，在含分 化誘導(dǎo)物即0·5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX，Sigma)、25μM地塞米松（DEX，Sigma) 和胰島素（Sigma)的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞3天，每隔2天用新培養(yǎng)基替換 該培養(yǎng)基，由此細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞。在脂肪前體細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的10至15天 之間，進(jìn)行葡萄糖攝入試驗。在反映胰島素敏感性的葡萄糖攝入試驗中，用2. 5%的胰蛋 白酶處理已完全轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的3T3-L1細(xì)胞，然后按血細(xì)胞計數(shù)器計算的20X IO4細(xì) 胞/mL的濃度接種至24孔板中。用低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基，以使細(xì)胞挨餓。 用PBS洗滌孔板中的脂肪細(xì)胞，然后用含0. 1 %牛血清白蛋白（BSA，Roche)、各1 μ g/mL和 10 μ g/mL的撕裂蠟孔菌培養(yǎng)物提取物和胰島素的HEPES溶液于37°C培養(yǎng)1. 5小時。然 后，將lOCi/mL葡萄糖類似物即2-脫氧-D-[3H]葡萄糖（2-DG)加入細(xì)胞中，然后于37°C 培養(yǎng)細(xì)胞10分鐘。10分鐘后，用PBS洗滌細(xì)胞5次，用IN NaOH溶解細(xì)胞，并用IN HCl中 和。用β-計數(shù)器（Tri-Carb 2100TR，Packard Bioscince, IL)測量細(xì)胞中攝入的3H的 量5分鐘。為了消除非特異性的葡萄糖攝入，還測量了用抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)活 性的細(xì)胞松弛素 B(Sigma)培養(yǎng)的細(xì)胞。在檢查撕裂蠟孔菌培養(yǎng)物中是否含有胰島素敏感 組分的過程中，低濃度胰島素選擇為Ing/mL，高濃度胰島素選擇為25ng/mL，因為細(xì)胞中的 胰島素攝入量在胰島素濃度為50ng/mL時是最高的。該實驗中，將Ing/mL胰島素與子囊 菌（Cordycepsmilitaris)部分一起加入3T3-L1脂肪細(xì)胞中，然后將其培養(yǎng)1. 5小時。然 后，將細(xì)胞中的葡萄糖攝入水平與加入Ing/mL胰島素的相比較。所有實驗重復(fù)三次。為了 消除其中不考慮胰島素破壞細(xì)胞膜從而增加葡萄糖攝入的作用所分離的物質(zhì)作為清潔劑 (detergent)的情況，胰島素水平為Ong/mL時一起測量分離的物質(zhì)和分離的物質(zhì)的葡萄糖 攝入量，且當(dāng)測量值比基礎(chǔ)值高時，則認(rèn)為該物質(zhì)不是胰島素敏感組分，即使其增加了葡萄 糖攝入量。
[0154] 4-1-3.對參與腠島素信號傳涕體系的蛋白表汰的檢測
[0155] 對于該實驗，用2. 5%胰蛋白酶處理3T3-L1脂肪細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至24孔板。實驗前 24小時，通過用含10%胎牛血清的低葡萄糖杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM)替換培養(yǎng) 基而使細(xì)胞挨餓。然后，用PBS洗滌細(xì)胞，并用含有撕裂蠟孔菌培養(yǎng)物提取物和Ing/mL胰 島素的HEPES于37 °C培養(yǎng)1小時。然后，使用含50單位抑肽酶、ImM Na3VOjP ImM PMSF的 RIPA緩沖液將細(xì)胞從冰上的孔板分離。將分離的細(xì)胞于4°C以1000 Orpm離心20分鐘。離 心后，用Laemmli樣品緩沖液稀釋下層溶液，通過SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。 通過使用兔 GLUT4 抗體（Chemicon, Temecula, CA)、IR、PI3-激酶、Akt、MAPK、AMPK 抗體的 蛋白印跡（Western blot)分析該膜，然后由激光密度計確定光學(xué)密度。
[0156] 4-2.實驗結(jié)果
[0157] 4-2-1.腠島素敏感件
[0158] 胰島素是最常用于治療1型糖尿病和2型糖尿病的治療劑。胰島素是促進(jìn)脂肪細(xì) 胞分化的因子，且大量脂肪細(xì)胞通過胰島素作用而產(chǎn)生。示出了撕裂蠟孔菌培養(yǎng)物提取物 的EPS以濃度依賴型方式促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。發(fā)現(xiàn)EPS是可代替胰島素的天然材料。
[0159] 4-2-2.葡萄糖攝入量
[0160] 為脂肪前體細(xì)胞的3T3-L1成纖維細(xì)胞具有良好的生物特性，且當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件 下培養(yǎng)時分化為脂肪細(xì)胞。因此，這些細(xì)胞用于關(guān)于脂肪細(xì)胞代謝過程中脂類分解抑制或 脂肪生成的研究。在該實驗中，基于誘導(dǎo)物如胰島素快速增加酶活性以促進(jìn)分化的事實，檢 查了是否存在胰島素敏感性組分。具體而言，實驗中使用通過向其中加入分化誘導(dǎo)物如胰 島素、IBMX和地塞米松由3T3-L1成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的3T3-L1脂肪細(xì)胞。通過測量由葡萄糖 轉(zhuǎn)運體GLUT4轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中的葡萄糖類似物即2-脫氧-D- [3H]-葡萄糖的量來確定細(xì)胞中 的葡萄糖攝入量。對于葡萄糖攝入試驗，實驗前24小時用低葡萄糖DMEM使3T3-L1脂肪細(xì) 胞挨餓，并用HEPES和EPS處理。因此可觀察到細(xì)胞中通過EPS的葡萄糖攝入。發(fā)現(xiàn)EPS 作為胰島素敏感性組分，以濃度依賴型方式增加葡萄糖攝入量，且這種葡萄糖攝入量的增 加比對照基礎(chǔ)值的高。
[0161] 4-2-3.腠島素信號傳導(dǎo)涉及的蛋白表汰
[0162] 各種復(fù)雜過程中都涉及胰島素的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。在胰島素作用于靶細(xì)胞的機(jī)制 中，胰島素通過在質(zhì)