Csf1治療劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及物質(zhì)組合物以及在增強(qiáng)受損肝臟再生或恢復(fù)其功能中使用該物質(zhì)組 合物的方法。該物質(zhì)組合物適用于治療肝病，例如用于預(yù)防和/或治療急性或慢性肝臟疾 病或用作支持療法以改善在肝臟切除或肝臟移植之后的結(jié)果。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟疾病是世界范圍內(nèi)致病率和死亡率的主要原因，但盡管如此，目前不存在增 強(qiáng)患病或受損肝臟的再生的有效療法。增強(qiáng)肝臟再生的療法可以在一系列醫(yī)學(xué)和手術(shù)情 形內(nèi)應(yīng)用于包括急性、慢加急或慢性肝臟衰竭的適應(yīng)癥中。在醫(yī)學(xué)環(huán)境中，急性肝臟衰竭 可能起因于一系列病因，但最常歸因于感染（病毒性肝炎）、酒精攝取或毒素用藥過量（如 Paracetamol?用藥過量）。在急性肝臟衰竭中，可能發(fā)生分布廣泛的肝臟組織壞死，這可 以快速導(dǎo)致死亡。急性肝臟衰竭可能起因于慢性肝臟疾病背景（慢加急），其中預(yù)先存在的 肝臟疾?。w因于病毒性肝炎、酒精、非酒精性脂肪肝病以及其他原因）進(jìn)一步削弱肝臟的 再生能力。慢性肝臟衰竭可能起因于肝臟功能的逐步惡化（原因如上）直到肝臟不能維持 內(nèi)穩(wěn)態(tài)為止。在威脅生命的肝臟衰竭中，唯一的選擇是肝臟移植，然而在潛在供體與接受者 之間的差額意味著許多患者將在等待肝臟移植的過程中死亡。
[0003] 肝臟再生是涉及許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及細(xì)胞類型的復(fù)雜過程。肝臟巨噬細(xì) 胞起到一系列至關(guān)重要的內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用，并且對(duì)有效肝臟再生是關(guān)鍵的。巨噬細(xì)胞集落刺激 因子（M-CSF)也稱為集落刺激因子I(CSFl)可互換使用，其表達(dá)于肝臟中并且是負(fù)責(zé)產(chǎn)生 和維持單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞（包括肝臟巨噬細(xì)胞）的主要因子。巨噬細(xì)胞的耗盡 和CSFl的缺乏在部分肝切除之后導(dǎo)致肝臟再生被削弱。從現(xiàn)有技術(shù)中已知，在M-CSF缺失 小鼠模型中，在部分肝切除之后，M-CSF誘生的庫普弗細(xì)胞（Kupffer cell)在肝臟再生中 起關(guān)鍵作用（雨宮（Amemiya)等人，《外科研究雜志》（J. Surg. Res.) 165, 59-67, 2011)。然 而，CSFl補(bǔ)充以增強(qiáng)肝臟再生的潛能迄今未得到考慮。
[0004] 增強(qiáng)肝臟再生和/或恢復(fù)其功能的療法可以在一系列醫(yī)學(xué)和手術(shù)情形內(nèi)應(yīng)用于 包括急性、慢加急或慢性肝臟衰竭的適應(yīng)癥中，并且將立即向患者、臨床醫(yī)師以及類似的健 康服務(wù)提供益處。
[0005] 增強(qiáng)肝臟再生的療法可以按急救療法的形式應(yīng)用以在移植之后或在壓倒性衰竭 情形下促進(jìn)再生、或用于預(yù)防慢性肝臟疾病中的衰退，該療法將立即向患者、臨床醫(yī)師以及 類似的健康服務(wù)提供益處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種CSFl蛋白生物活性片段或其同系物或變體或 衍生物，用于增強(qiáng)肝臟再生和/或恢復(fù)肝臟功能和/或調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
[0007] 也包括編碼該CSFl蛋白生物活性片段或其同系物或變體或衍生物的核酸。
[0008] 諸位發(fā)明人已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，向具有正常CSF-I水平的受試者給予另外或額 外或補(bǔ)充的CSF-I增加健康動(dòng)物中肝臟的大小并且提升在由不同原因造成的功能損失之 后修復(fù)肝臟的能力。意外的發(fā)現(xiàn)是，向個(gè)體中已經(jīng)起作用的CSF-I補(bǔ)充CSF-I將改善肝再 生或功能。肝臟處于極嚴(yán)格的內(nèi)穩(wěn)態(tài)下，并且迄今為止尚未認(rèn)識(shí)到可以在臨床環(huán)境中成功 地調(diào)節(jié)肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)并且將肝臟大小增加到高于相對(duì)于總體重的正常值的藥劑。然而，本發(fā)明 提供在哺乳動(dòng)物物種中使用CSF-I作為適當(dāng)?shù)母螤I(yíng)養(yǎng)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)劑的證據(jù)。此外，本發(fā)明是 基于CSF-I可以恢復(fù)肝臟吞噬能力的觀察結(jié)果，并且因此使用CSF-I蛋白來恢復(fù)肝臟功能 的這個(gè)方面在本發(fā)明中尤其受關(guān)注。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含：
[0010] (i) CSF-I生物活性片段或其同系物或變體或衍生物；和 [0011] (ii)生物活性抗體片段。
[0012] 優(yōu)選地，出于人類療法的目的，CSF-I的生物活性片段是人類CSF-I的殘基 33-182 (SEQ ID NO: 5)或其生物活性部分、或來自任何哺乳動(dòng)物物種的CSF-I生物學(xué)等效片 段。
[0013] CSF-I的生物活性片段可以是天然的，或它可以是重組的。
[0014] 優(yōu)選地，抗體是選自下組的免疫球蛋白，該組包括IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，更 優(yōu)選地，該抗體是IgG。
[0015] 優(yōu)選地，抗體片段選自下組，該組包括F(ab'）2、Fab'、Fab、Fv、Fc以及rlgG，并且 更優(yōu)選地，該抗體片段是FC片段。
[0016] 優(yōu)選地，融合蛋白的CSF-I生物活性片段或其同系物或變體或衍生物與生物活性 抗體片段直接或經(jīng)由連接子部分共價(jià)連接。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種編碼該融合蛋白的核酸。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種包含本發(fā)明的經(jīng)分離核酸的載體。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種包含本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種制造本發(fā)明第一方面的融合蛋白的方法， 該方法包括：
[0021] (i)培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；并且
[0022] (ii)從所述培養(yǎng)物中收集該融合蛋白。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種組合物，該組合物包含：
[0024] (a)至少一種融合蛋白，該融合蛋白包含（i)CSF-l生物活性片段或其同系物或變 體或衍生物；和（ii)生物活性抗體片段；和
[0025] (b)藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0026] 在替代性實(shí)施例中，該組合物可以包含本發(fā)明的核酸或載體。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種融合蛋白的用途，該融合蛋白包含：
[0028] (i)CSF-I生物活性片段或其同系物或變體或衍生物；和
[0029] (ii)生物活性抗體片段
[0030] 用于增強(qiáng)肝臟再生和/或恢復(fù)肝臟功能和/或調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
[0031] 在手術(shù)環(huán)境中，手術(shù)去除肝臟中含有肝癌的區(qū)域是治愈性管理的主體。這可能產(chǎn) 生手術(shù)后肝臟衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，尤其在患者具有慢性肝臟疾病背景的情況下。在肝臟移植的情 形下，如果所移植的器官不足以滿足接受者的需求，那么肝臟衰竭可能繼續(xù)。用增強(qiáng)再生的 療法來治療可以在手術(shù)之前、期間或之后來進(jìn)行應(yīng)用。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供本發(fā)明的融合蛋白或核酸或載體的用途，用于制 造用于增強(qiáng)肝臟再生和/或恢復(fù)肝臟功能和/或調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)的藥劑。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種治療患有肝癌并且將進(jìn)行手術(shù)的個(gè)體的方 法，該方法包括在手術(shù)程序之前、期間或之后給予本發(fā)明的融合蛋白或核酸或載體。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種治療正進(jìn)行肝臟移植手術(shù)的個(gè)體的方法， 該方法包括在手術(shù)程序之前、期間或之后給予本發(fā)明的融合蛋白或核酸或載體。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的又另一個(gè)方面，提供一種試劑盒，該試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)具有藥 物劑量單元的容器，這些藥物劑量單元包含有效量的本發(fā)明的融合蛋白或核酸或載體，其 中該容器包裝有任選的用于使用它的說明書。
[0036] 本發(fā)明的不同方面提供在人類和其他哺乳動(dòng)物物種中增強(qiáng)受損肝臟再生或恢復(fù) 其功能的組合物和方法
[0037] 歸于本發(fā)明任何方面的特征在加以必要修正的情況下可適用于本發(fā)明的所有其 他方面。
【附圖說明】
[0038] 借助于非限制性實(shí)例、參考附圖進(jìn)一步在下文中描述本發(fā)明的實(shí)施例，在這些附 圖中：
[0039] 圖1顯示三個(gè)損傷模型中的卡普蘭-梅爾存活率（Kaplein Meir of survival)， 并且圖表顯示在干預(yù)和處理之后的重量變化百分比。***p〈〇. 001曼-惠特尼U(Mann Whitney U)。[實(shí)線=使用fc-CSFl處理；虛線=PBS對(duì)照]
[0040] 圖2是展示肝臟重量/體重比率（表示為百分比）和肝細(xì)胞增殖（表示為每個(gè)高 倍視野中的Ki67陽性肝細(xì)胞）的條形圖。*ρ〈(λ 05 ;#ρ〈(λ 01 001曼-惠特尼U。
[處理=fc-CSFl ;對(duì)照=PBS]
[0041] 圖3顯示如上文所描述給予的CSF-I對(duì)體重的作用。圖3A比較CSF-I (lmg/kg)與 Fc-CSF-I (lmg/kg)。未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)在這個(gè)劑量下沒有作用，而Fc-CSF-I明顯增加總體 重。圖3B顯示劑量響應(yīng)曲線，表明在0. lmg/kg Fc-CSF-I下的可檢測(cè)活性。圖3C顯示，在 更大實(shí)驗(yàn)系列中證實(shí)lmg/kg劑量的作用。在后續(xù)幻燈片中進(jìn)一步分析這個(gè)系列中的動(dòng)物。
[0042] 圖4A顯示CSF-I (lmg/kg)和Fc-CSF-I (lmg/kg)對(duì)小鼠脾臟重量的作用，圖4B顯 示CSF-I (lmg/kg)和Fc-CSF-I (lmg/kg)對(duì)小鼠肝臟重量的作用。
[0043] 圖5顯示Fc-CSF-I對(duì)脾臟中巨噬細(xì)胞數(shù)目（使用csf Ir-EGFP報(bào)告基因來檢測(cè)） 的作用，圖5A是對(duì)照并且圖5B顯示經(jīng)處理的樣本。
[0044] 圖6A顯示對(duì)圖5A和5B的劑量響應(yīng)曲線，圖6A顯示基于巨噬細(xì)胞特異性F4/80 抗原的免疫組織化學(xué)定位的劑量響應(yīng)曲線。
[0045] 圖7顯示對(duì)小鼠中巨噬細(xì)胞特異性F4/80抗原的免疫染色。圖7A顯示經(jīng)PBS處 理的對(duì)照肝臟；圖7B顯示用Fc-CSF-I處理的小鼠的肝臟，圖7C顯示經(jīng)PBS處理的對(duì)照脾 臟，圖7D顯示用Fc-CSF-I處理的小鼠的脾臟。
[0046] 圖8A顯示具有針對(duì)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA)免疫染色的經(jīng)PBS處理的對(duì)照小鼠肝 臟，圖8B顯示在用Fc-CSF-I處理之后的小鼠肝臟。
[0047] 圖9顯示向斷奶仔豬給予的CSF-I的藥物動(dòng)力學(xué)影響。圖9A顯示未經(jīng)修飾的 CSF-I的清除率，圖9B和9C顯示在分別靜脈內(nèi)和皮下給予時(shí)I. 2mg/kg的Fc-CSF-I的清除 率。
[0048] 圖10顯示在給予0. 5mg/KgX6的斷奶仔豬中的血液作用；圖IOA顯示總白細(xì)胞計(jì) 數(shù)，圖IOB顯示單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，圖IOC顯示淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且圖IOD顯示中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0049] 圖11顯示在給予0. 5mg/KgX6的斷奶仔豬中血液作用的劑量響應(yīng)曲線；圖IlA顯 示總白細(xì)胞計(jì)數(shù)，圖IlB顯示單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，圖IlC顯示淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且圖IlD顯示中 性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0050] 圖12顯示對(duì)給予0. 12mg/KgX3的斷奶仔豬中的器官重量的作用。圖12A顯示對(duì) 肝臟重量的作用，圖12B顯示對(duì)脾臟重量的作用，圖IlC顯示對(duì)肺重量的作用，并且圖IlD 顯示對(duì)腎臟重量的作用。
[0051] 圖13A顯示在患有撲熱息痛誘發(fā)的肝臟衰竭的存活或死亡/進(jìn)行肝臟移植的患者 中，在入院時(shí)的患者血清CSFl水平。圖13B顯示隨后死亡或存活的患者子集的血清水平。 圖13C顯示接受者操作特征曲線分析，該分析評(píng)估入院時(shí)CSFl充當(dāng)在撲熱息痛用藥過量之 后不進(jìn)行移植的情況下的存活率的生物標(biāo)記的潛能。
[0052] 圖14A顯示在撲熱息痛中毒之后的肝CSFl基因表達(dá)和血清CSFl水平。圖14B顯 示通過Ki67免疫組織化學(xué)在撲熱息痛中毒之后第3天評(píng)估的肝臟與體重比率和肝細(xì)胞增 殖。圖14C顯示在撲熱息痛中毒后第3天時(shí)比較對(duì)照和CSFl受體抑制的血清分析。
[0053] 圖15A顯示在撲熱息痛中毒之后比較CSFl-Fc(實(shí)線）或?qū)φ眨c(diǎn)線）給藥的小 鼠中平均肝臟重量與體重比率和肝細(xì)胞增殖（ki67免疫組織化學(xué)）。圖15B顯示撲熱息痛 中毒后的血清參數(shù)。（η = 8個(gè)/組）。
[0054] 圖16Α顯示在2/3部分肝切除之后的肝CSFl基因表達(dá)和血清CSFl水平。圖16Β 顯示通過Ki67免疫組織化學(xué)在2/3部分肝切除之后第2天評(píng)估的使用CSFl受體抑制 (GW2580)或?qū)φ盏母闻K與體重比率和肝細(xì)胞增殖。圖16C顯示在撲熱息痛中毒后第2天比 較對(duì)照和使用GW2580的CSFl受體抑制的血清分析。（η =每組8個(gè)）。
[0055] 圖17Α顯示在2/3部分肝切除之后比較CSFl-Fc (實(shí)線）或?qū)φ眨c(diǎn)線）給藥的 小鼠中平均肝臟重量與體重比率和肝細(xì)胞增殖（ki67免疫組織化學(xué)）。圖17Β顯示撲熱息 痛中毒后的血清參數(shù)。（η = 8個(gè)/組）。圖17C顯示再生前細(xì)胞因子116和抑瘤素 M(OSM) 以及生長(zhǎng)因子活化子尿激酶受體（UR)在阻斷CSFl受體（GW2580)和給予CSFl-Fc的情況 下對(duì)比對(duì)