一種魚類b細胞激活因子的免疫應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體的說是半滑舌鰨B細胞激活因子的免疫應用。
【背景技術(shù)】
[0002] B細胞活化因子（B cell activating factor，BAFF)，屬于腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF)家族，是一個典型的II型跨膜蛋白，分子量約為31kDa，由胞質(zhì)區(qū)、 跨膜區(qū)和胞外功能區(qū)組成。在哺乳動物中BAFF在體液免疫中發(fā)揮著重要作用，其能結(jié)合并 刺激B淋巴細胞，并分泌免疫球蛋白，且它對T細胞的功能亦有一定的調(diào)節(jié)作用。BAFF與其 三個受體BAFF-R、TACI和BCMA結(jié)合后可激活NF- κ B、mTOR、p38、JNK等信號通路，維持免 疫細胞生存、分化和成熟，并且具有抗凋亡的作用。BAFF對B細胞的發(fā)育過程具有關(guān)鍵的 調(diào)節(jié)作用，在BAFF基因完全缺失的小鼠中，B淋巴細胞的發(fā)育和抗體的產(chǎn)生受到嚴重影響。 因此，BAFF為一種與機體免疫調(diào)控密切相關(guān)的細胞因子。目前魚類BAFF研宄很少，其功能 幾乎完全未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種魚類B細胞激活因子的免疫應用。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種魚類B細胞激活因子的免疫應用，半滑舌鰨B細胞激活因子作為疫苗增強因 子的應用。
[0006] 進一步的說，半滑舌鰨B細胞激活因子作為DNA疫苗增強因子的應用。
[0007] 所述半滑舌鰨B細胞激活因子（BAFF)的表達質(zhì)粒的稀釋液與DNA疫苗質(zhì)粒的稀 釋液按體積比為1:1比例混合。
[0008] 所述半滑舌鰨B細胞激活因子（BAFF)的表達質(zhì)粒與DNA疫苗質(zhì)粒采用PBS緩沖 液稀釋至400ug/ml。
[0009] 所述BAFF表達質(zhì)粒是以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增， PCR產(chǎn)物與載體pBS-T連接，獲得質(zhì)粒pBSBAFF ;用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切pBSBAFF后回 收0. 5kb片段，與質(zhì)粒pCN3連接，得BAFF表達質(zhì)粒pBAFF ;
[0010] 所述 Fl 為 5? -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3? ；R1 為 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。
[0011] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：本發(fā)明的半滑舌鰨B細胞激活因子BAFF能夠顯著提高DNA 疫苗的免疫保護效應。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明實施例提供的BAFF增強疫苗誘導的血清抗體水平圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
[0014] 在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法：
[0015] 1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相應試劑盒。
[0016] 2.大腸桿菌用 Hanahan 方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)〇
[0017] 3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京。
[0018] 實施例1
[0019] BAFF的表達質(zhì)粒pBAFF的構(gòu)建：
[0020] 本發(fā)明的 BAFF 的序列已公開（GenBank accession No. XM_008328682)。BAFF 由 261個氨基酸組成，有一個保守的TNF(tissue necrosis factor)結(jié)構(gòu)域。以半滑舌鰨 cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為：94°C 60s預變性模板DNA，然后 94°〇4〇8,51°〇6〇8,72°〇6〇8,5個循環(huán)后改為94°〇4〇8,58°〇6〇8,72°〇6〇8,30個循環(huán)。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T (購自于"天根生化科 技有限公司"，北京）于室溫連接2 - 4小時，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有 100 μ g/ml安卡青霉素（Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲噪-β-D-乳糖苷（x-gal)和 24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時，挑出 白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBSBAFF。將質(zhì)粒pCN3 (構(gòu)建過程參見Jiao XD，Zhang M, Hu YH, Sun L Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine 2009;27:5195 - 202.)用 EcoRV 酶切，回收 5. 4kb 片段，同時將 pBSBAFF用EcoRV酶切回收0. 5kb片段。將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接 2 - 4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18 - 24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pBAFF。通過DNA測序分析證明了 pBAFF為含 有TNF結(jié)構(gòu)域的BAFF序列的表達質(zhì)粒，其中pBAFF質(zhì)粒中的BAFF序列與GenBank access ion公開的No. XM_008328682中記載的一致。
[0021] 所述LB組成成分按重量百分比計：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化 鈉，97. 5 % 蒸餾水。所述 Fl 為 5' -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3' ；R1 為 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。
[0022] 實施例2
[0023] BAFF表達質(zhì)粒pBAFF的免疫應用
[0024] 步驟1)免疫半滑舌鰨
[0025] 將遲緩愛德華氏菌DNA疫苗質(zhì)粒pCEsal(其構(gòu)建過程見Sun Y，Liu C，Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15_like surface antigen. Fish Shellfish Tmmunol. 2011 ； 30:273 - 9.)和上述實施例1的pBAFF分別在PBS中稀釋至400ug/ml，將二者等體積混合， 即為pCEsal+pBAFF混合液。將pCEsal和pBAFF分別在PBS中稀釋至200ug/ml，即為pCEsal 稀釋液和pBAFF稀釋液。將140條半滑舌鰨（重約14. 5g)隨機分為4組，每組35條。將 這4組分別命名為A、B、C和D。將A組的每條魚肌肉注射0.1 ml pCEsal稀釋液，將B組的 每條魚肌肉注射0.1 ml pBAFF稀釋液，將C組的每條魚肌肉注射0.1 ml pCEsal+pBAFF混合 液，將D組（對照組）的每條魚肌肉注射0· Iml PBS。
[0026] 所述PBS組成成分按重量百分比計：0. 8 % NaCl, 0. 02 % KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0· 024% NaH2PO4,余量為水。
[0027] 步驟2)細菌懸液制備
[0028] 將遲緩愛德華氏菌TXl在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_為0.8,然后離心（5000g， 4°C ) lOmin。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為2xl06cfu/ml。
[0029] 所述菌株TXl保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保 藏編號為：CGMCC No. 2330,分類命名為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda)，保藏日期 為2008年1月9日，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研宄所。
[0030] 步驟3)抗體效價檢測
[0031] 在上述步驟1)免疫后第30天，自每組魚中取5條魚，用酶聯(lián)免疫吸附劑測定 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測血清中疫苗特異抗體水平（具體 方法參考文獻 Sun Y, Liu C, Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15_like surface antigen. Fish Shellfish Immunol. 2011;30:273 - 9.)。結(jié)果表明，與對照魚相比，免疫 pCEsal 和 pCEsal+pBAFF組魚皆能產(chǎn)生疫苗特異性抗體，且后者的抗體水平顯著高于前者（參見圖 1)。免疫PBAFF組魚無疫苗特異性抗體產(chǎn)生。
[0032] 步驟4)攻毒感染和免疫保護效應檢測
[0033] 在上述步驟1)免疫后第30天，將4組的每條魚腹腔注射IOOul上述步驟2)的細 菌懸液。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總 死亡數(shù)目：A組，10條；B組，22條；C組，5條；D組，26條。利用下列公式計算相對免疫保護 效率（RPS):
[0034] RPS = IOOx(1 -免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比）
[0035] 由此得出免疫pCEsal、pBAFF和pCEsal+pBAFF組魚的RPS分別為 66. 7% ,26. 7% ,83. 3%，其中免疫pCEsal+pBAFF組魚的RPS顯著（P〈0. 01)高于其它組。
[0036] 綜上所述，pBAFF是一種高效的疫苗增強因子，能顯著提高疫苗誘導的抗體水平 和免疫保護效應。
【主權(quán)項】
1. 一種魚類B細胞激活因子的免疫應用，其特征在于：半滑舌鰨B細胞激活因子作為 疫苗增強因子的應用。
2. 按權(quán)利要求1所述的魚類B細胞激活因子的免疫應用，其特征在于：半滑舌鰨B細 胞激活因子作為DNA疫苗增強因子的應用。
3. 按權(quán)利要求1或2所述的魚類B細胞激活因子的免疫應用，其特征在于：所述半滑 舌鰨B細胞激活因子（BAFF)的表達質(zhì)粒的稀釋液與DNA疫苗質(zhì)粒的稀釋液按體積比為1:1 比例混合。
4. 按權(quán)利要求3所述的魚類B細胞激活因子的免疫應用，其特征在于：所述半滑舌鰨B 細胞激活因子（BAFF)的表達質(zhì)粒與DNA疫苗質(zhì)粒采用PBS緩沖液稀釋至400ug/ml。
5. 按權(quán)利要求3所述的魚類B細胞激活因子的免疫應用，其特征在于：所述BAFF表達 質(zhì)粒是以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體pBS-T連 接，獲得質(zhì)粒pBSBAFF;用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切pBSBAFF后回收0. 5kb片段，與質(zhì)粒pCN3 連接，得BAFF表達質(zhì)粒pBAFF; 所述Fl為 5? -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3? ；R1 為 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體的說是半滑舌鰨B細胞激活因子的免疫應用。半滑舌鰨B細胞激活因子作為疫苗增強因子的應用。本發(fā)明的BAFF表達質(zhì)粒能顯著增強DNA疫苗的免疫保護效應。CGMCC No.233020080109
【IPC分類】A61K38-17, A61P37-04, C12N15-28, A61K48-00, C12N15-85
【公開號】CN104784678
【申請?zhí)枴緾N201510096091
【發(fā)明人】孫黎, 孫云, 遲恒
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年3月4日