專利名稱：流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性t細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細(xì)胞的方法，屬于免疫學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)感染后，決定病情嚴(yán)重程度及病程轉(zhuǎn)歸的一個主要因素是機(jī)體的免疫反應(yīng)能力。其中患者體內(nèi)乙肝病毒特異性T細(xì)胞(cytotoxic Tlympho-cyte，CTL，下稱HBV特異性CTL)在清除病毒方面發(fā)揮重要的功能。T細(xì)胞中CD4+細(xì)胞在抗原刺激下可分化為特異性T輔助細(xì)胞(Th)，Th能促進(jìn)HBV特異性CTL產(chǎn)生，并對維持HBV特異性CTL活性、產(chǎn)生持續(xù)性細(xì)胞免疫起重要作用。T細(xì)胞中CD8+細(xì)胞在抗原刺激下可分化為HBV特異性CTL。研究表明HBV特異性CTL在控制HBV感染中起關(guān)鍵作用(1)在機(jī)體的防御體系中，CTL是清除細(xì)胞內(nèi)病原體的主要因素；(2)HBV持續(xù)感染均伴有HBV特異性CTL的缺乏，病毒感染的控制與HBV特異性CTL數(shù)量和活性呈正相關(guān)；(3)通過DNA疫苗免疫、DC疫苗治療等方法可以激活HBV特異性CTL，進(jìn)而清除病毒感染；(4)直接過繼免疫輸入HBV特異性CTL可以清除感染病毒。
研究表明急性HBV感染的患者中，HBV特異性CTL反應(yīng)是強(qiáng)有力的，但在臨床恢復(fù)及血清轉(zhuǎn)換發(fā)生后，很低水平的HBVDNA仍可持續(xù)存在幾十年。長期存在的微量HBV DNA與長期存在的HBV特異性CTL有關(guān)。與急性自限性HBV感染相比較，慢性乙肝患者，通過51Cr釋放法，外周血中很難檢測出HBV特異性CTL反應(yīng)。通過同樣的技術(shù)，病毒復(fù)制活躍、肝臟炎癥明顯的慢性HBV感染患者血液中HBV特異性CTL缺乏，肝組織中HBV特異性CTL頻度較低；而病毒復(fù)制不活躍、肝臟炎癥輕微的慢性HBV感染者，血液和肝組織中HBV特異性CTL頻度較高。國外研究還發(fā)現(xiàn)慢性乙肝在經(jīng)歷自發(fā)的或干擾素誘導(dǎo)的部分或完全恢復(fù)的患者，能形成在強(qiáng)度和特異性方面類似于急性乙肝患者具有的CTL對乙肝的反應(yīng)。在經(jīng)過拉米夫定治療的患者，通過51Cr釋放法和Te-tramer技術(shù)，發(fā)現(xiàn)HBV特異性CTL頻度明顯地升高，差異顯著。這個提高的HBV特異性CD8+細(xì)胞活性可以導(dǎo)致CD4+細(xì)胞的活性恢復(fù)，同時導(dǎo)致HBV病毒載量的下降。因此拉米夫定對慢性乙肝患者的治療，能夠使HBV特異性CTL功能恢復(fù)。在拉米夫定治療后，通過獲得多種抗原表位的特異性，使HBV特異性CTL功能得到恢復(fù)。以上結(jié)果提示，通過提高HBV特異性CTL反應(yīng)為乙肝的免疫治療提供了可能。
常用的CTL檢測法有同位素細(xì)胞毒性分析，如51Cr釋放法、125I-UdR釋放法及3H-UdR釋放法等；單細(xì)胞水平測定CTL活性，如細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、特異T細(xì)胞受體(TCR)的PCR、有限稀釋分析法(limiting dilution analysis，LDA)等。由于特異性CTL在外周血淋巴細(xì)胞中的比率很低，檢測這些低水平的特異性CTL需要有高度敏感的方法。傳統(tǒng)的51Cr釋放分析法和LDA法，間接檢測抗原特異性CTL，需要大量的CTLs作為效應(yīng)細(xì)胞，必須在體外先進(jìn)行擴(kuò)增，整個過程周期長、敏感性低、費時、費力，難以廣泛應(yīng)用。
近年發(fā)展起來的檢測γ干擾素(IFN-γ)等細(xì)胞因子分泌細(xì)胞數(shù)量的酶聯(lián)免疫斑點法(Enzyme-linked immunospot assay，Elispot)和檢測T細(xì)胞特異性抗原受體數(shù)量的四聚體檢測法(Te-tramer)因其具有很高的靈敏度，可以檢出(15～20)/106的低頻度特異性CTL，越來越受到重視和較廣泛的應(yīng)用。但在實際運用中還存在一些不足。ELISPOT檢測陽性細(xì)胞的條件更為嚴(yán)格，刺激時間長，需要不斷補(bǔ)充細(xì)胞生長物質(zhì)；Te-tramer檢測特異性，但是不作用于T細(xì)胞。
運用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法(cytokine flow cytometry，CFC)是指流式細(xì)胞儀細(xì)胞內(nèi)因子檢測法，此法的特點是利用流式細(xì)胞儀的多參數(shù)同時分析的功能，精確識別目標(biāo)細(xì)胞并檢測其內(nèi)因子的分泌情況。
未見運用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法檢測慢性乙肝(CHB)患者外周血和肝組織中HBV特異性CTL的應(yīng)答的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細(xì)胞的方法，是一種靈敏度高，檢測對象不受限制，成本低的用于HBV特異性CTL的檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案運用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法(cytokine flowcytometry，CFC)對全血進(jìn)行檢測。在有細(xì)胞因子封閉劑布雷菲德菌素A的環(huán)境下，在全血中加刺激抗原和協(xié)同刺激劑進(jìn)行抗原刺激。通常在刺激的六小時后洗滌，識別淋巴細(xì)胞并裂解紅細(xì)胞。隨后進(jìn)行洗滌和破膜。最后使用熒光標(biāo)記抗體對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行熒光標(biāo)記染色，完成后上流式細(xì)胞儀分析。
我們的檢測方案是基于使用協(xié)同刺激劑(CD28/CD49d)、多色試劑(CD8PerCP-Cy5.5)檢測及兩種細(xì)胞因子(INF-r與CD69)的檢測。
儀器Beckman coulter-3XL流式細(xì)胞儀，二氧化碳培養(yǎng)箱(HRCP-海爾公司)，離心機(jī)。
主要試劑①細(xì)胞因子封閉劑布雷菲德菌素A(Brefeldin A)，Sigma公司產(chǎn)品。
②協(xié)同刺激劑CD28/CD49d，Sigma公司產(chǎn)品。
③刺激抗原HBcAg特異性多肽18-27，(氨基酸序列FLPSDFFPSV)，上海森工生物技術(shù)有限公司合成，并向公眾出售。
④淋巴細(xì)胞CD8探針CD8PerCP-Cy5.5，(異硫氰酸-CY5.5復(fù)合熒光素標(biāo)記CD8抗體)，BD公司產(chǎn)品。
⑤溶血素Lysing Solution，BD公司產(chǎn)品。
⑥破膜劑permeabilizing solution，BD公司產(chǎn)品。
⑦r-干擾素抗體熒光標(biāo)記IFN-r FITC，BD公司產(chǎn)品。
⑧淋巴細(xì)胞CD69細(xì)胞活化探針CD69-PE，(PE標(biāo)記的CD69抗體)，BD公司產(chǎn)品。
⑨陰性對照劑IgG2a FITC/IgG1 PE，BD公司產(chǎn)品。
⑩磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)，自配。
檢測過程①抗原刺激在流式細(xì)胞測定管中加入全血100μl，布雷菲德菌素A10μl，CD28/CD49d 2.5μl和HBcAg特異性多肽1μl，將測定管置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，5％CO2、37℃條件下增殖6小時。
②洗滌用預(yù)冷的PBS液2ml洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液。去除剩余的布雷菲德菌素A、CD28/CD49d和HBcAg特異性多肽，留下淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞。
③淋巴細(xì)胞識別加CD8PerCP-Cy5.510μl、CD69 PE 10μl避光30分鐘，識別CD8陽性且已被抗原活化的淋巴細(xì)胞。
④裂解紅細(xì)胞加溶血素2ml，避光15分鐘。
⑤離心、洗滌離心1500rpm/分，棄上清液，用預(yù)冷的PBS液2ml重復(fù)洗滌2次，去除紅細(xì)胞。
⑥破膜加破膜劑0.5ml，避光10分鐘。對淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行打孔，使得細(xì)胞因子抗體能夠自由出入細(xì)胞，同時保證細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)并不外泄。
⑦洗滌用預(yù)冷的PBS液洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液。去除破膜劑。
⑧染色加IFN-r FITC 10μl，避光30分鐘，使胞漿內(nèi)的γ-干擾素被抗γ-干擾素?zé)晒饪贵w標(biāo)記染色。
⑨流式細(xì)胞儀測定。調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀前向(FS)、側(cè)向(SS)兩參數(shù)的電壓值，使絕大多數(shù)淋巴細(xì)胞顯示在FS/SS雙參數(shù)點圖中。構(gòu)建CD8PerCP-Cy5.5與CD69PE直方圖，在圖中識別出已被活化的CD8+/CD69+細(xì)胞。構(gòu)建IFN-rFITC單參數(shù)直方圖，并設(shè)定陰性區(qū)域后檢測陽性樣本，如出現(xiàn)陽性顆粒，便識別為對乙肝抗原肽有特異性反性的T細(xì)胞本發(fā)明的有益效果
CFC和ELISPOT比較CFC法是指流式細(xì)胞儀細(xì)胞內(nèi)因子檢測法，此法的特點是利用流式細(xì)胞儀的多參數(shù)同時分析的功能，精確識別目標(biāo)細(xì)胞并檢測其內(nèi)因子的分泌情況。CFC和ELISPOT檢測細(xì)胞因子都是基于單個細(xì)胞。兩者的區(qū)別是(1)信號輸出的技術(shù)(流式細(xì)胞儀為多參數(shù))；(2)刺激的時間長短和條件(通常在ELISPOT膜底部刺激PBMCs 24小時；CFC檢測用的聚丙烯管中刺激全血或PBMCs6小時)。(3)CFC檢測到的陽性細(xì)胞是ELISPOT的三到四倍。這可能部分因為ELISPOT檢測陽性細(xì)胞的條件要更為嚴(yán)格。
CFC和MHC-Ig四聚物(或二聚物)染色比較MHC-肽段四聚物和MHC-Ig二聚物是肉眼觀察抗原特異性T細(xì)胞的有力工具。四聚物和二聚物與CFC檢測觀察的區(qū)別是(1)四聚物和二聚物檢測T細(xì)胞特異性反應(yīng)只通過一個肽-MHC抗原決定簇，但是CFC能用于測量復(fù)雜抗原的反應(yīng)；(2)四聚物和二聚物檢測有特異性，但是不作用于T細(xì)胞，反之，CFC檢測抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
本發(fā)明建立新型免疫分析技術(shù)，用于HBV特異性CTL的檢測，明顯優(yōu)于51Cr測定法、有限稀釋法(LAD)、MHC-四聚體(二聚體)法，本發(fā)明方法不僅靈敏度高，檢測對象不受限制，成本低，還能直接檢測特異性CTL的功能性細(xì)胞因子的表達(dá)，可廣泛用于臨床檢測。
具體實施例方式
實施例1取正常對照者全血100μl，按說明書上述測定方法進(jìn)行檢測操作。測得HBV特異性CTL值為0.2％。
實施例2取急性乙型肝炎患者全血100μl，按說明書上述測定方法進(jìn)行檢測操作。測得HBV特異性CTL值為1.8％。
實施例3取慢性乙型肝炎患者全血100μl，按說明書上述測定方法進(jìn)行檢測操作。測得HBV特異性CTL值為0.8％。
權(quán)利要求
1.一種流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細(xì)胞的方法，其特征是運用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法對全血進(jìn)行檢測，在有細(xì)胞因子封閉劑布雷菲德菌素A的環(huán)境下，在全血中加刺激抗原和協(xié)同刺激劑進(jìn)行抗原刺激，刺激六小時后洗滌，識別淋巴細(xì)胞并裂解紅細(xì)胞，隨后進(jìn)行洗滌和破膜，最后使用熒光標(biāo)記抗體對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行熒光標(biāo)記染色，完成后上流式細(xì)胞儀分析；①抗原刺激在流式細(xì)胞測定管中加入全血100μl，布雷菲德菌素A10μl，CD28/CD49d 2.5μl和HBcAg特異性多肽1μl，將測定管置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，5％CO2、37℃條件下增殖6小時；②洗滌用預(yù)冷的PBS液2ml洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液，去除剩余的布雷菲德菌素A、CD28/CD49d和HBcAg特異性多肽，留下淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞；③淋巴細(xì)胞識別加CD8PerCP-Cy5.5 10μl，CD69 PE10μl避光30分鐘，識別CD8陽性且已被抗原活化的淋巴細(xì)胞；④裂解紅細(xì)胞加溶血素2ml，避光15分鐘；⑤離心、洗滌離心1500rpm/分，棄上清液，用預(yù)冷的PBS液2ml重復(fù)洗滌2次，去除紅細(xì)胞；⑥破膜加破膜劑0.5ml，避光10分鐘，對淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行打孔，使得細(xì)胞因子抗體能夠自由出入細(xì)胞，同時保證細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)并不外泄；⑦洗滌用預(yù)冷的PBS液洗滌1次，離心1500rpm/分，棄上清液，去除破膜劑；⑧染色加IFN-r FITC，避光30分鐘，使胞漿內(nèi)的γ-干擾素被抗γ-干擾素?zé)晒饪贵w標(biāo)記染色；⑨流式細(xì)胞儀測定調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀前向FS、側(cè)向SS兩參數(shù)的電壓值，使絕大多數(shù)淋巴細(xì)胞顯示在FS/SS雙參數(shù)點圖中，構(gòu)建CD8PerCP-Cy5.5與CD69PE直方圖，在圖中識別出已被活化的CD8+/CD69+細(xì)胞，構(gòu)建IFN-rFITC單參數(shù)直方圖，并設(shè)定陰性區(qū)域后檢測陽性樣本，如出現(xiàn)陽性顆粒，便識別為對乙肝抗原肽有特異性反性的T細(xì)胞。
全文摘要
流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法檢測乙肝病毒特異性T細(xì)胞的方法，屬于免疫學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明運用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測法對全血進(jìn)行檢測，在有細(xì)胞因子封閉劑布雷菲德菌素A的環(huán)境下，在全血中加刺激抗原和協(xié)同刺激劑進(jìn)行抗原刺激，刺激六小時后洗滌，識別淋巴細(xì)胞并裂解紅細(xì)胞。隨后進(jìn)行洗滌和破膜。最后使用熒光標(biāo)記抗體對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行熒光標(biāo)記染色，完成后上流式細(xì)胞儀分析。本發(fā)明建立新型免疫分析技術(shù)，用于HBV特異性CTL的檢測，明顯優(yōu)于51Cr測定法、有限稀釋法(LAD)、MHC－四聚體(二聚體)法，本發(fā)明方法不僅靈敏度高，檢測對象不受限制，成本低，還能直接檢測特異性CTL的功能性細(xì)胞因子的表達(dá)，可廣泛用于臨床檢測。
文檔編號G01N21/00GK1811452SQ20061003781
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者裴豪, 楊小娟, 錢金娟 申請人:無錫市傳染病醫(yī)院