@MIL-101。
[0039]實施例3 PEG@MIL-101 以及 AuNPs@PEG@MIL_101 的制備
[0040]將20mg MIL-101 (實施例1中制備得到)溶解在2mL 5mg/mL PEG- 二胺(分子量為2000)水溶液中，37°C攪拌3h。離心，蒸餾水洗滌3遍，干燥得到PEG麵IL-101。
[0041 ] 將0.5mg/mL的AuNPs (實施例1中制備得到)水溶液加入到5mg/mL的PEGiMIL-101水溶液中，其中AuNPs和PEG麵IL-101的質(zhì)量比為3:1，并攪拌lh，離心，蒸餾水洗滌 3 遍，干燥得到 AuNPs@PEG@MIL-101。
[0042]實施例4 PEG@MIL-101與AuNPs@PEG@MIL_101對A β 40多肽聚集及其形態(tài)的影響
[0043]A β 4(|多肽聚集成纖維的程度通過ThT染料檢測，在JASCO FP6500熒光分光光度計上檢測ThT的熒光強(qiáng)度，ThT的激發(fā)波長為440nm，發(fā)射波長為490nm。實驗重復(fù)三次并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。Αβ4(ι溶液(30 μ Μ)同 10、15、20 及 25yg/mL PEG@MIL_101 與 AuNPsOPEGOMIL-101 (實施例1制備得到)在37°C中孵育O到5天。實驗結(jié)果如圖2A所示，隨著PEGOMIL-101濃度的增加，ThT的熒光隨之下降，Aβ4(ι多肽聚集遲滯期也隨之延長，說明PEGOMIL-101是一個有效的Αβ4(ι多肽聚集的抑制劑而且可以在聚集的早期就開始抑制多肽的聚集。當(dāng)濃度達(dá)到20 μ g/mL及25 μ g/mL時，兩組ThT的熒光值基本一致，說明20 μ g/mLPEG@MIL-101對30μM A β 4(|多肽聚集已到達(dá)完全抑制。AuNPs@PEG@MIL_101對A β 4(|多肽聚集的抑制作用也是隨著濃度的增加而增加，相同濃度的情況下，AuNPsOPEG麵IL-101對多肽聚集的抑制作用優(yōu)于PEG@MIL-101 (圖2B)，說明AuNPs促進(jìn)PEG@MIL_101對多肽聚集的抑制作用。同樣，AuNPsiPEGiMIL-1Ol在20 μ g/mL完全抑制A β 4(|多肽聚集。因此，PEGiMIL-101 以及AuNPs(gPEG麵IL-101可以作為Aβ聚集抑制劑，用于治療阿爾茲海默癥。
[0044]為了進(jìn)一步檢測納米粒子是否對已聚集的Αβ4(ι纖維有破壞作用，首先將Αβ 4(|多肽孵育3天后形成A β 4(|纖維，隨后加入20 μ g/mL的納米粒子并孵育5天并檢測ThT熒光的變化。實驗結(jié)果如圖2C所示，PEG麵IL-101對聚集的A β 4(|纖維結(jié)構(gòu)有一定的破壞，在第5天ThT熒光下降到78%，而AuNPs促進(jìn)PEG麵IL-101對聚集的A β 4(|纖維有顯著的破壞作用，第5天ThT熒光只有原來的13%。
[0045]實施例5 PEG@MIL-101 與 AuNPs@PEG@MIL_101 對 A β 4(|多肽毒性的影響
[0046]PEG@MIL-101 與 AuNPs@PEG@MIL_101 對 A β 4(|多肽毒性的影響通過 MTT 及 AO-EB 染色實驗檢測。
[0047]MTT法:將PC12細(xì)胞接種到96孔板上，每孔5 X 13個細(xì)胞，培養(yǎng)24h等細(xì)胞貼壁。為了檢測聚集的Αβ 4(|纖維的毒性，Αβ 4(|多肽或已聚集的Αβ 4(|纖維(30μΜ)同20yg/mLPEG麵IL-101與AuNPsOPEG^IL-lOl (實施例1制備得到)在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育3天。隨后細(xì)胞在這些孵育溶液中繼續(xù)培養(yǎng)72h。為了檢測PEG@MIL-101與AuNPs@PEG@MIL-101 (實施例I制備得到)的毒性，貼壁的PC12細(xì)胞(5 X 13/孔)同相應(yīng)濃度多孔金屬有機(jī)骨架一起培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)結(jié)束的前4h加入10 μ L/孔MTT溶液。4h后吸棄培養(yǎng)液，加入100 μ LDMS0，振蕩15min。酶標(biāo)儀測定OD值，吸收峰為450nm。按以下公式計算細(xì)胞的存活率:
[0048]細(xì)胞存活率(％ )=(加藥孔平均OD值/對照組平均OD值)X 100 %。
[0049]MTT結(jié)果如圖3A所示，Αβ4(ι纖維顯著減少PC12細(xì)胞的活力，細(xì)胞活力< 60%，而加入PEG@MIL-101與AuNPs@PEG@MIL-101后，細(xì)胞活力分別增加至91及97%。Αβ 4(|纖維加入PEG@MIL-101與AuNPs@PEG@MIL-101后，細(xì)胞活力分別為63 %及89 %。圖3B顯示，PEG@MIL-101與AuNPs@PEG@MIL-101對PC12細(xì)胞的活力沒有影響，無毒性。
[0050]AO-EB染色:PC12細(xì)胞按3 X 14/孔的密度接種于六孔板上，培養(yǎng)24h等細(xì)胞貼壁。Αβ4(ι 多肽或已聚集的 Αβ 4Q 纖維(30μΜ)同 20yg/mL PEG@MIL_101 與 AuNPs@PEG@MIL-101 (實施例1制備得到)在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育3天。隨后細(xì)胞在這些孵育溶液中繼續(xù)培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入200 μ L Α0/ΕΒ染液(5 μ L/mL)，37°C避光孵育3-5min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0051]AO-EB實驗結(jié)果同MTT結(jié)果一致(圖3C)，加入A β 4(|纖維后，死亡細(xì)胞數(shù)量增加(發(fā)橙色熒光)，Αβ 4(|單體或Αβ 4(|纖維加入AuNPsOPEG^IL-lOl后活細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到正常水平，說明PEG@MIL-101與AuNPs@PEG@MIL-101均可減少A β 4(|多肽的神經(jīng)毒性，AuNPsiPEG麵IL-101對已聚集A β 4(|纖維的神經(jīng)毒性的抑制作用強(qiáng)于PEG麵IL-101。
[0052]實施例4 PEG麵IL-1OI負(fù)載藥物在體外釋放
[0053]本實施例研宄了 AuNPs@PEG@MIL-101及PEG@MIL_101 (實施例1制備得到)作為藥物載體時對藥物的釋放，我們選用羅丹明B為被負(fù)載藥物。如圖4所示，MIL-101負(fù)載的羅丹明B隨著時間延長而逐漸釋放，并未出現(xiàn)納米微膠囊負(fù)載藥物時所出現(xiàn)的藥物在短時間內(nèi)(5min左右)的突然釋放，說明MIL-101所負(fù)載的藥物主要是從MIL-101上的孔中釋放和/或藥物-基質(zhì)相互作用的擴(kuò)散，而不是由MIL-101降解所導(dǎo)致的藥物釋放。因此，MIL-101可以作為一個穩(wěn)定的載體。經(jīng)PEG修飾MIL-101后的PEG麵IL-101，羅丹明B釋放的時間延長，表明PEG對MIL-101所負(fù)載的羅丹明B的釋放有緩釋作用，這可避免所負(fù)載的藥物在血液循環(huán)中的提前釋放。然而在AuNPs(gPEG麵IL-101中，羅丹明B的釋放非常緩慢，1h后的釋放量不到30%，這可能是由于修飾在MIL-101表面的AuNPs無法釋放從而阻礙了介孔里的藥物釋放。
【主權(quán)項】
1.一種金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物，其特征在于，在MIL-1Ol表面包覆PEG修飾劑而成，得PEG@MIL-101。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物，其特征在于，MIL-1Ol上還負(fù)載有AuNPs，得 AuNPs@PEG@MIL-101。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物，其特征在于，所述的PEG修飾劑為PEG-二胺。4.權(quán)利要求1所述的金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟:將MIL-101加入到PEG- 二胺溶液中，攪拌、離心、洗滌、干燥后即得PEG麵IL-101。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的MIL-101和PEG-二胺的質(zhì)量比為2?5:1 ;PEG-NH2溶液中PEG- 二胺的濃度為5?10mg/mL ;所述的攪拌是在30?40°C下攪拌I?4h。6.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包含如下步驟:將AuNPs溶液加入到PEGOMIL-1Ol溶液中并攪拌I?3h，離心、洗滌、干燥得到AuNPs@PEG@MIL-101。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，AuNPs和PEG麵IL-1Ol的質(zhì)量比為3 ?8:1 ；AuNPs 溶液中 AuNPs 的濃度為 0.5 ?1.5mg/mL，PEG@MIL_101 溶液中 PEG@MIL_101的濃度是5?15mg/mL。8.權(quán)利要求1?4任一項所述的金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物PEG麵IL-101或AuNPs@PEG@MIL-101在制備治療阿爾茲海默癥的藥物中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求1?4任一項所述的金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物PEG麵IL-101或AuNPs@PEG@MIL-101作為Αβ聚集抑制劑的應(yīng)用。10.權(quán)利要求1?4任一項所述的金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物PEG麵IL-101或AuNPs@PEG@MIL-101作為藥物載體的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及金屬有機(jī)材料制備領(lǐng)域，具體公開了一種金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物及其制備方法和應(yīng)用。所述金屬有機(jī)框架負(fù)載藥物，是在MIL-101表面包覆PEG修飾劑而成，得PEGMIL-101，還可進(jìn)一步負(fù)載AuNPs，得AuNPsPEGMIL-101。所述的PEGMIL-101對Aβ多肽聚集有很好的抑制作用；尤其是負(fù)載AuNPs合成AuNPsPEGMIL-101后，其對Aβ多肽聚集的抑制作用及破壞纖維結(jié)構(gòu)的能力顯著增強(qiáng)。
【IPC分類】A61K33/24, A61K47/34, A61P25/28, A61K33/00, A61K47/02
【公開號】CN104922673
【申請?zhí)枴緾N201510279930
【發(fā)明人】劉杰, 楊麗聰, 尹田田, 周艷暉
【申請人】暨南大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月27日...