作為轉(zhuǎn)染試劑的羧化多胺衍生物的制作方法
【專利說明】作為轉(zhuǎn)染試劑的羧化多胺衍生物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及多胺衍生物以及多胺衍生物用于將核酸和其它聚陰離子轉(zhuǎn)染至細(xì)胞 中的用途。本發(fā)明還涉及一種用于將聚陰離子轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中的方法，以及涉及用于此的試 劑盒和多胺衍生物。本發(fā)明的多胺衍生物是有效的轉(zhuǎn)染劑（transfectants)，具有非常低的 毒性，可用于轉(zhuǎn)染多種不同的細(xì)胞類型。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)染是將外源物質(zhì)引入至細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染的背景之下，"至細(xì)胞中"意指運輸外源 物質(zhì)穿過至少一層生物膜。可進(jìn)一步運輸至細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞器中。相比之下，僅僅是將物 質(zhì)包含在核內(nèi)體、胞飲或吞噬小泡或者溶酶體中不被認(rèn)為是轉(zhuǎn)染。
[0003] 外源物質(zhì)可包含諸如肽、蛋白質(zhì)以及各種類型的核酸的分子；后者可小至如寡核 苷酸或者長至如質(zhì)粒。外源物質(zhì)也可包含此類分子的裝配物（assemblies)。在任何情況 下，上述分子或裝配物是大的且親水的，這兩個特征阻礙了它們獨力的細(xì)胞攝取。因此轉(zhuǎn)染 需要使用特定的輔助試劑。除其它之外，多胺可為此類試劑。多胺在溶液中形成聚陽離子， 促進(jìn)與諸如核酸的聚陰離子的復(fù)合物（complex)形成。這些復(fù)合物是實際的能勝任轉(zhuǎn)染的 實體（transfection competent entities) 〇
[0004] Boussif 等人（Proc Natl Acad Sci USA (1995)，監(jiān)（16) :7297-7301)或者在 US6013240中）使用支鏈的聚亞乙基亞胺（polyethyleneimine，PEI)作為多胺，證明了多 胺和質(zhì)粒的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染。在持續(xù)該觀念的同時，其他人試圖通過各種手段來改進(jìn)該技術(shù)。 改進(jìn)轉(zhuǎn)染劑的策略包括：
[0005] ⑴選擇特定尺寸或構(gòu)型的聚陽離子，例如具有特定長度的直鏈的 PEI(ff02009/016507)；
[0006] (ii)使用此類聚陽離子的在代謝上不穩(wěn)定的多聚體（Gosselin等人（2001) Bioconj Chem, 11(6) :989-994 ;Lynn 等人（2001) J Am Chem Soc 123(33) :8155-8156; Gdpfrich等人的 W02007/020060 Janaka 等人的 W02007/120479);
[0007] (iii)使用脂質(zhì)混合物（Monahan等人的US7, 601，367);或者
[0008] (iv)對聚合物主鏈進(jìn)行化學(xué)改性，例如芳香族氨基酸的接枝（在Adib等人的 W02009/074970中）、組氨酸或咪唑基團(tuán)的接枝（在W02009/011402中）、如Wakefield等人 (2005)Bioconj Chem 16(5) :1204-1208中的烷基化或者利用膽固醇的改性（在Ferguson 等人的 US2007/0154447 中）。
[0009] 疏水改性改善了轉(zhuǎn)染劑的膜滲透（見于Wakefield等人），但與溶液中的復(fù)合物 的低穩(wěn)定性相關(guān)；配制的材料傾向于形成聚集體。聚乙二醇（PEG)的接枝（通過Matar 等人在 W02009/021017 中或者在 Rozema 等人（2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(32): 12982-12987中）抵制聚集，但另一方面其與生物活性對抗且必須為可逆的，如Rozema的發(fā) 表文獻(xiàn)中所示。
[0010] 從許多不同的策略以及從大量的報告中顯而易見的是，新型轉(zhuǎn)染劑的開發(fā)是深入 研究的課題。它們的應(yīng)用具有重大的商業(yè)意義；轉(zhuǎn)染試劑在2011年具有約200Mio USD的 市場容量（Frost&Sullivan，Global Transfection Markets (全球轉(zhuǎn)染市場），N6F0_01)。 toon] 轉(zhuǎn)染劑的開發(fā)和改良中的兩個最重要標(biāo)準(zhǔn)是（i)高信噪比以及（ii)穿過大量不 同細(xì)胞類型的有效轉(zhuǎn)染。信噪比描述了轉(zhuǎn)染復(fù)合物與單獨轉(zhuǎn)染劑或者與包含不相關(guān)核酸的 轉(zhuǎn)染復(fù)合物相比的效果。
[0012] 因此本發(fā)明的一個目的是提供一種用于將聚陰離子轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染劑以及 一種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。另一個目的是提供一種在標(biāo)準(zhǔn)（a)和/或（b)方面優(yōu)于市售材料的 轉(zhuǎn)染劑。鑒于先前所用的大量和多樣化的方法，尚未發(fā)現(xiàn)已教導(dǎo)此發(fā)明的具體原理。
[0013] 發(fā)明概沭
[0014] 上述目的通過以下方式實現(xiàn)：
[0015] (1)多胺衍生物用于將聚陰離子轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中的用途，所述多胺包含：
[0016] 多胺部分，所述多胺部分包含多個氨基；
[0017] 多個羧化取代基，所述羧化取代基包含經(jīng)由疏水連接體與所述多胺部分的氨基結(jié) 合的羧基；以及
[0018] 多個疏水取代基，所述疏水取代基與所述多胺部分的氨基結(jié)合；
[0019] 所述疏水連接體具有3至20的logP，該IogP是對通過將所述連接體與所述多胺 的羧基以及氨基結(jié)合的鍵替換為與氫原子結(jié)合的鍵從所述連接體獲得的化合物測定的；以 及
[0020] 所述疏水取代基具有1. 5至20的logP，該IogP是對通過將所述疏水取代基與所 述多胺部分的氨基結(jié)合的鍵替換為與氫原子結(jié)合的鍵從所述疏水取代基獲得的化合物測 定的。
[0021] (2)多胺衍生物用于將聚陰離子轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中的用途，所述多胺包含：
[0022] 多胺部分，所述多胺部分包含多個氨基；
[0023] 多個羧化取代基，所述羧化取代基包含經(jīng)由疏水連接體與所述多胺部分的氨基結(jié) 合的羧基，其中每個所述羧化取代基包含6至40個碳原子，優(yōu)選6至20個碳原子，更優(yōu)選 8至18個碳原子，并且每個所述疏水連接體可包含1至3個選自0、N及S的雜原子；以及
[0024] 多個疏水取代基，所述疏水取代基與所述多胺部分的氨基結(jié)合，其中每個所述疏 水取代基包含至少2個碳原子，優(yōu)選6至40個碳原子，并且在所述疏水取代基具有至少6 個碳原子的情況下可包含1至3個選自0、N及S的雜原子。
[0025] (3)根據(jù)第1項或第2項的用途，其中所述多胺衍生物的每個所述羧化取代基包含 下列基團(tuán)中的任何一個或多個作為所述疏水連接體：亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基、亞 環(huán)烯基、亞芳基以及它們的組合；和/或
[0026] 所述多胺衍生物的每個所述疏水取代基包含下列基團(tuán)中的任何一個或多個：烷 基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基以及它們的組合。
[0027] (4)如第1項或第2項所限定的多胺衍生物。
[0028] (5)多亞烷基亞胺（Polyalkylenimine)衍生物，其具有一個或多個羧基烷基取代 基以及一個或多個疏水取代基，所述羧基烷基取代基包含6至40個碳原子，所述疏水取代 基選自具有至少2個碳原子、優(yōu)選6至40個碳原子的烴取代基，其中每個所述疏水取代基 可為烷基或者可包含烷基和/或每個所述疏水取代基可為芳基或者可包含芳基。
[0029] (6)根據(jù)第5項的多亞烷基亞胺衍生物，其中所述多亞烷基亞胺衍生物中的羧基 烷基取代基和疏水取代基具有10 :1至0. 1 :1的摩爾比（C/A比），優(yōu)選這些基團(tuán)的C/A比 為 3 :1 至 0· 33 :1。
[0030] (7)根據(jù)第4項至第6項中任一項的多胺衍生物或多亞烷基亞胺衍生物，其中所述 羧化取代基全部相同且所述疏水取代基全部相同，并且一個所述羧化取代基中的碳原子加 上一個所述疏水取代基中的碳原子的總數(shù)為10至30,優(yōu)選為15至25。
[0031] (8)核酸或蛋白質(zhì)與本發(fā)明的多胺衍生物的復(fù)合物。
[0032] (9) 一種試劑盒，包括：
[0033] (i)如本文所限定的多胺衍生物，
[0034] (ii)pH介于4至8之間的緩沖溶液，以及
[0035] (iii)任選地使用說明手冊。
[0036] (10