專利名稱：活化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的激酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的來自白色念珠菌(Candida albicans)的活化細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的激酶和它的應(yīng)用。
細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cdk)是真核生物的細(xì)胞分裂周期調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)變和G2/M期轉(zhuǎn)變水平都是必需的。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的CDC28和栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的CDC2是被確認(rèn)的第一批Cdk。
Cdk的活化需要一個細(xì)胞周期蛋白分子的附著和Cdk的磷酸化，磷酸化位置是在被稱做“T環(huán)”區(qū)的保守蘇氨酸殘基。
現(xiàn)已證明這種磷酸化作用是由一種被稱做“Cdk活化激酶(CAK)”的激酶來完成的，在脊椎動物中，它以一種異質(zhì)三聯(lián)體的形式存在，包括一個催化亞基，稱為Cdk7；一個細(xì)胞周期蛋白類型的亞單位，稱為細(xì)胞周期蛋白H和因子MAT-1[參見綜述，SOLOMON，生化科學(xué)趨勢(TrendsBiochem.Sci)，19，496-500(1994)]。Cdk7-細(xì)胞周期蛋白H復(fù)合物另外還是TFIIH復(fù)合物的一個成分，該復(fù)合物在由RNA聚合酶II引起的基因基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄中是必需的，并且參與該聚合酶的大亞單位羧基末端區(qū)(CTD)的重復(fù)序列的磷酸化作用。
在栗酒裂殖酵母的裂體生殖中，一種類似Cdk7-細(xì)胞周期蛋白H的、包含稱做Crk1的催化亞單位和稱做Mcs2的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的復(fù)合物被識別?，F(xiàn)已證明Crk1基因?qū)?xì)胞生存能力是不可缺少的，并且已經(jīng)在體外觀察到Crk1-Mcs2復(fù)合物是與CAK活性和CTD-激酶活性有關(guān)的。[BUCK等，EMBO J.，14(24)，6173-83(1995)；DAMAGNEZ等，EMBO J.，14(24)，6164-72(1995)]。
在剛發(fā)芽的釀酒酵母中，一種包含有分別在其序列水平與激酶Cdk1和crk1及與調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞周期蛋白H和Mcs2相關(guān)的一種激酶(Kin28)和一種細(xì)胞周期蛋白(Ccll)的復(fù)合物也已被識別。復(fù)合物Kin28-Ccll形成復(fù)合物TFIIH的一部分，并有CTD-激酶活性，但是不涉及CAK活性。
最近，發(fā)明者已經(jīng)在釀酒酵母中鑒定出一種具有CAK活性的激酶，這種激酶被叫做CIV1(體內(nèi)CAK)，對應(yīng)的基因被叫做CIV1(THURET等，細(xì)胞(Cell)，86(4)，1996)。這些結(jié)果已經(jīng)被其他研究組確認(rèn)[KALDIS等，細(xì)胞(Cell)，86(4)，553-564(1996)；ESPINOZA等，科學(xué)(Science)，273(5282)，1714-1717 1996)]。 釀酒酵母CAK都是與絲氨酸-蘇氨酸激酶家族有關(guān)的，特別是與蛋白激酶CDC2和CDC28有關(guān)，它與先前在其他的機(jī)體中鑒定的CAK的不同在于缺乏甘氨酸豐富的保守基序GxGx(Y/F)GxV，該基序在大多數(shù)蛋白激酶中都存在，即一個5～29氨基酸的插入序列，位于在Cdk家族中保守的二級結(jié)構(gòu)成分之間；不同之處還有其CAK活性并不需要其整合到酶復(fù)合物中。
CIV1的CAK活性對細(xì)胞的分裂和存活不可缺少，發(fā)明者已經(jīng)在進(jìn)行研究是否在致病性酵母中存在與CIV1同源的基因，編碼具有CAK活性的蛋白激酶。的確，在這種情況下，得到調(diào)節(jié)這種活性的方法，特別是得到抑制劑，從工業(yè)或治療學(xué)的觀點上看都將是非常有意義的，主要是對殺真菌劑的生產(chǎn)尤為重要。
為了這個目標(biāo)，發(fā)明者首先使用來自釀酒酵母CIV1基因的各個不同區(qū)域的探針著手對致病性酵母白色念珠菌的DNA文庫進(jìn)行了篩選。但任何一個被使用的探針都沒能探測到白色念珠菌基因組中有同源序列的存在。
不過發(fā)明者已經(jīng)研究了是否白色念珠菌可能擁有釀酒酵母CAK的功能類似物，方法是通過檢查白色念珠菌里是否有一個或多個在釀酒酵母中有能力使CIV1基因的熱敏感突變體恢復(fù)CAK功能的基因。這樣他們成功地鑒定出一個白色念珠菌基因，它自身能在突變體中補(bǔ)充恢復(fù)有缺陷的CAK功能。
這個被叫做CaCIV1的基因序列已經(jīng)被確定下來；它在所附的序列表中以SEQ ID No1被列出；它的翻譯產(chǎn)物叫做CaCIV1，在SEQ ID No2下列出。


圖1表示的是CaCIV1的氨基酸序列(單字母代碼)與釀酒酵母CAK的氨基酸序列(叫做ScCIV1)的比較，以及與釀酒酵母激酶CDC28(叫做ScCDC28)的氨基酸序列的比較。在ScCIV1和CaCIV1中保守的殘基用黑體字母表示。
對圖1注釋的圖例說明k＝在大部分的蛋白激酶中保守的殘基；●＝在Cdk家族中經(jīng)常出現(xiàn)的殘基；○＝總是在Cdk家族中出現(xiàn)的殘基；+＝在Cdk家族和ScCIV1中出現(xiàn)的殘基；二級結(jié)構(gòu)a＝α螺旋；b＝β片層。
CaCIV1在所有的氨基酸序列中僅僅與釀酒酵母的CAK即ScCAV1具有28％的同一性。
不過，在ScCAV1和CaCAV1之間的相似性得以定義一個激酶家族—下文稱為CIV1，包括具有下列特征的蛋白質(zhì)-它們?nèi)狈騁xGx(Y/F)GxV，其中G表示甘氨酸，x表示任一氨基酸，Y/F表示酪氨酸或苯丙氨酸之一，V表示纈氨酸；-它們擁有非細(xì)胞周期蛋白依賴性的CAK活性。
本發(fā)明包含屬于如上面定義的CIV1家族的蛋白激酶，但除釀酒酵母CAKScCIV1之外。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的蛋白激酶可以從一種子囊菌中獲得，有利地是從半子囊菌，優(yōu)選是從白色念珠菌中得到。
本發(fā)明的蛋白激酶是例如在所附的序列表中以SEQ ID No2列出的蛋白激酶。
本發(fā)明的主題也包括編碼一種本發(fā)明蛋白激酶的核酸序列。
一種本發(fā)明的核酸序列是例如在所附序列表中以SEQ ID NO1列出的序列。
本發(fā)明的主題也包括至少18bp的核酸片段，它同源或互補(bǔ)于一個編碼本發(fā)明的CAK特異的多肽序列的核酸序列。
這些片段可以被特別用做雜交探針和/或擴(kuò)增引物，用于在白色念珠菌中分離和/或克隆編碼本發(fā)明的CAK的核酸序列。
本發(fā)明也包括至少15bp的核酸片段，優(yōu)選是至少18bp的片段，它同源或互補(bǔ)于一個編碼在本發(fā)明的CAK CaCIV1蛋白激酶家族和釀酒酵母的CAK ScCAV1間保守的多肽序列的核酸序列。
這些片段特別可以用做雜交探針和/或擴(kuò)增引物，以用于在除釀酒酵母和白色念珠菌以外的機(jī)體中檢測編碼與CAK CaCIV1和ScCIV1相關(guān)激酶的序列的存在，以及分離或克隆被識別的基因。本發(fā)明也包含以這種方式獲得的核酸序列，和被這些序列所編碼的CAK CaCIV1和ScCIV1家族的蛋白激酶。
本發(fā)明的主題也包括將至少一個本發(fā)明的核酸序列插入到一個合適的載體而構(gòu)成的任何重組載體，特別是任何表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易選擇出一個合適的載體，他可以在眾多的現(xiàn)有載體中，根據(jù)選擇用于擴(kuò)增和/或表達(dá)本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞來選擇。
本發(fā)明也包括用本發(fā)明的核酸序列轉(zhuǎn)化的原核或真核細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以被特別用于表達(dá)一種本發(fā)明的激酶，例如為了從細(xì)胞培養(yǎng)基中將其純化，例如使用類似于發(fā)明人先前對釀酒酵母CIV1敘述過的技術(shù)(THURET等，1996，上述引用的出版物)，或通過適當(dāng)?shù)募?xì)胞生存能力實驗來檢測它的活性。
本發(fā)明對激酶ScCIV1和CaCIV1功能同源性的證明使人們可以設(shè)計該激酶家族的許多應(yīng)用。
特別地，由于該激酶家族看來的非細(xì)胞周期蛋白依賴性CAK活性是細(xì)胞分裂和存活所必需的，抑制這種活性的物質(zhì)可以用做殺真菌劑，作為藥物或在工業(yè)水平使用。
例如，為了篩選如對白色念珠菌有活性的殺真菌物質(zhì)，在每種想確定其殺真菌性質(zhì)的產(chǎn)物存在下，測定CaCIV1—或其CIV1家族中非細(xì)胞周期蛋白依賴性CAK的功能性類似物—的激酶活性，并選擇對這種活性具有抑制作用的產(chǎn)物。
這種篩選可以在待測的潛在活化劑或抑制劑存在下，通過測定CIV1家族CAK的激酶活性來完成。例如，激酶活性可以在體外被測定，或者直接在合適的反應(yīng)混合物中，檢測一種多肽或一種底物蛋白如CDC28或Cdk2，或蛋白MBP(髓磷脂堿性蛋白)的磷酸化作用，或者間接檢測和/或測定底物蛋白的活性，而后者依賴于磷酸化作用。
激酶活性也可以通過細(xì)胞生存能力試驗在體內(nèi)測定，例如CaCIV1的激酶活性可以在不表達(dá)CAK ScCIV1但用CaCIV1基因轉(zhuǎn)化的釀酒酵母突變體細(xì)胞中有利地測定。
本發(fā)明也包括一種如上述因其對CIV1家族非細(xì)胞周期蛋白依賴性CAK的抑制活性而被選擇的產(chǎn)物在生產(chǎn)殺真菌劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明在下面的進(jìn)一步描述中會更清楚地得以理解，其中實施例描述了CaCIV1 CAK活性的檢測和相應(yīng)基因的克隆。
實施例釀酒酵母株CMY975(基因型CIV1-2 ura3 leu2 trpl lys2 ade2 adeS)攜帶CIV1基因的一個熱敏感性突變，并且因此生長于24℃而不是37℃。
這株酵母的培養(yǎng)物按醋酸鋰法[SCHIESTL和GIETZ，當(dāng)前遺傳學(xué)(Current Genetics)，16，339-346，(1989)]用克隆到載體YEp24 BamHI位點(多拷貝-URA3)[Botstein等，基因(Gene)8，17-24，(1979)]的白色念珠菌Sau3基因組片段文庫轉(zhuǎn)化。
CMY975細(xì)胞被接種在含有無尿嘧啶的合成培養(yǎng)基的平皿中，37℃培養(yǎng)。
獲得了此條件下生長的10個CMY975菌落。從這些菌落中回收這些含有白色念珠菌插入序列的YEp24質(zhì)粒，在大腸桿菌中擴(kuò)增。
確定這些質(zhì)粒中每一個的酶切圖譜，得以觀察到所有插入序列來自白色念珠菌基因組的同一區(qū)域。對該區(qū)域的測序可以確認(rèn)編碼一個339個氨基酸的蛋白激酶的同一開放讀碼框架，這顯示這10個分別獲得的插入序列相應(yīng)于一個相同的白色念珠菌基因，這個基因被稱為CaCIV1。
CaCIV1的序列在所附序列表中在SEQ ID NO1下給出，蛋白CaCIV1的序列在SEQ ID NO2下給出。CaCIV1蛋白序列與在數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行的比較顯示這種蛋白與釀酒酵母的CAK ScCIV1的氨基酸同一性僅為28％，與釀酒酵母的Cdk ScCDC28和白色念珠菌的CaCDC28的氨基酸同一性為24％。
將一段含有CaCIV1基因的3kb BamHI-ClaI基因組片段亞克隆到著絲粒質(zhì)粒TRP1 pRS414[SIKORSKI和HIETER，遺傳學(xué)(Genetics)，122，19-27(1989)]中。這個質(zhì)粒被用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母突變體，其中ScCIV1序列被從基因組中刪除，而在復(fù)制型質(zhì)粒中含有ScCIV1基因，它也攜帶選擇性基因URA3(CMY11G株基因組ura3 leu2 trpl lys2 civl LEU2/pJG43(URA3-ScCIVI))。pRS414-CaCIV1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞經(jīng)過反向選擇后并且缺失了pJG43質(zhì)粒(URA3-ScCIV1)是能夠生長的，這證實CaCIV1基因可以功能性代替必需的ScCIV1基因。因而，CaCIV1編碼一種ScCIV1的功能性同系物，并且足以恢復(fù)CAK活性。
序列表<110>FAYE，GerardVALAY，Jean GabrielMANN，CarlCEAINSTITUT CURIECNRS<120>活化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的激酶及其應(yīng)用<130>MJPrm263/33<140><141><150>FR 9710287<151>1997-08-12<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1020<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(1020)<400>1atg aag ttg tca gat tat tat ata gac aag gaa tta att tac aat agt 48Met Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr Ile Asp Lys Glu Leu Ile Tyr Asn Ser1 5 10 15gcc att tct gat ata tat acg gct att gat aag ttt aat aac tta cca 96Ala Ile Ser Asp Ile Tyr Thr Ala Ile Asp Lys Phe Asn Asn Leu Pro20 25 30gta tgt ctt aaa ata gtt gat gaa gat ttc agt ctt cca cca cat tca 144Val Cys Leu Lys Ile Val Asp Glu Asp Phe Ser Leu Pro Pro His Ser35 40 45atc cat cga gaa gtt ctt ata ctt aaa act ttg aaa cca cat cca aac 192Ile His Arg Glu Val Leu Ile Leu Lys Thr Leu Lys Pro His Pro Asn50 55 60ata att gaa tat ttt aat gat ctt aaa att tgt gac gat att ata tta 240Ile Ile Glu Tyr Phe Asn Asp Leu Lys Ile Cys Asp Asp Ile Ile Leu65 70 75 80gtc acc aaa ttg tat cgt tat gat ttg agt caa ttg att gaa att aca 288Val Thr Lys Leu Tyr Arg Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Ile Glu Ile Thr85 90 95aaa tat tgt aaa cga aca aca cga ttt att tat ggt att aat ggt aat 336Lys Tyr Cys Lys Arg Thr Thr Arg Phe Ile Tyr Gly Ile Asn Gly Asn100 105 110ctt gtt agt aat caa tat aca ctt gct aat gaa att gaa gaa aaa gat 384Leu Val Ser Asn Gln Tyr Thr Leu Ala Asn Glu Ile Glu Glu Lys Asp115 120 125atc aaa tta tgg tta aaa tca atg agt tca gga ctt gaa ttt att cat 432Ile Lys Leu Trp Leu Lys Ser Met Ser Ser Gly Leu Glu Phe Ile His130 135 140tca caa ggg ata att cat cgt gat ata aaa ccc agt aat att ttc ttt 480Ser Gln Gly Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Phe Phe145 150 155 160gcc cgg gat gat ata aca caa ccg att att gga gat ttt gat att tgt 528Ala Arg Asp Asp Ile Thr Gln Pro Ile Ile Gly Asp Phe Asp Ile Cys165 170 175tat gat tta aaa ctg cca cct aaa gat gaa ccc cct atg gcg aaa tat 576Tyr Asp Leu Lys Leu Pro Pro Lys Asp Glu Pro Pro Met Ala Lys Tyr180 185 190att gat gta tct aca ggt att tat aaa gca cca gaa ttg att ctt ggt 624Ile Asp Val Ser Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Pro Glu Leu Ile Leu Gly195 200 205ata act aat tat gaa tat gaa att gat att tgg tca ttg ggt ata att 672Ile Thr Asn Tyr Glu Tyr Glu Ile Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Ile210 215 220ttg act ggt tta tat tca gaa aat ttt caa agt gtt tta gtc aaa gat 720Leu Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Asn Phe Gln Ser Val Leu Val Lys Asp225 230 235 240gat aaa gaa ttg act aat gat tct cat gtt agt gat tta tat tta tta 768Asp Lys Glu Leu Thr Asn Asp Ser His Val Ser Asp Leu Tyr Leu Leu245 250 255aat caa ata ttt gaa aat ttc ggt aca ccc aat tta act gat ttt gaa 816Asn Gln Ile Phe Glu Asn Phe Gly Thr Pro Asn Leu Thr Asp Phe Glu260 265 270gat gaa tta ttt tgt gat gaa tat aat aat gaa aac ttg cat ttt aaa 864Asp Glu Leu Phe Cys Asp Glu Tyr Asn Asn Glu Asn Leu His Phe Lys275 280 285aaa ttc aat tta caa aaa tat cct aga aaa gat tgg gat att att tta 912Lys Phe Asn Leu Gln Lys Tyr Pro Arg Lys Asp Trp Asp Ile Ile Leu290 295 300cct cga tgc aat gat gat ttc atg aaa gaa att ttt acc aag atg att 960Pro Arg Cys Asn Asp Asp Phe Met Lys Glu Ile Phe Thr Lys Met Ile305 310 315 320aga tat gat cga agt aaa aga ata act tct aaa gaa atc tta caa tta1008Arg Tyr Asp Arg Ser Lys Arg Ile Thr Ser Lys Glu Ile Leu Gln Leu325 330 335atg tta gat tga1020Met Leu Asp340<210>2<211>339<212>蛋白<213>白色念珠菌<400>2Met Lys Leu Ser Asp Tyr Tyr Ile Asp Lys Glu Leu Ile Tyr Asn Ser1 5 10 15Ala Ile Ser Asp Ile Tyr Thr Ala Ile Asp Lys Phe Asn Asn Leu Pro20 25 30Val Cys Leu Lys Ile Val Asp Glu Asp Phe Ser Leu Pro Pro His Ser35 40 45Ile His Arg Glu Val Leu Ile Leu Lys Thr Leu Lys Pro His Pro Asn50 55 60Ile Ile Glu Tyr Phe Asn Asp Leu Lys Ile Cys Asp Asp Ile Ile Leu65 70 75 80Val Thr Lys Leu Tyr Arg Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Ile Glu Ile Thr85 90 95Lys Tyr Cys Lys Arg Thr Thr Arg Phe Ile Tyr Gly Ile Asn Gly Asn100 105 110Leu Val Ser Asn Gln Tyr Thr Leu Ala Asn Glu Ile Glu Glu Lys Asp115 120 125Ile Lys Leu Trp Leu Lys Ser Met Ser Ser Gly Leu Glu Phe Ile His130 135 140Ser Gln Gly Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Ser Asn Ile Phe Phe145 150 155 160Ala Arg Asp Asp Ile Thr Gln Pro Ile Ile Gly Asp Phe Asp Ile Cys165 170 175Tyr Asp Leu Lys Leu Pro Pro Lys Asp Glu Pro Pro Met Ala Lys Tyr180 185 190Ile Asp Val Ser Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Pro Glu Leu Ile Leu Gly195 200 205Ile Thr Asn Tyr Glu Tyr Glu Ile Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Ile210 215 220Leu Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Asn Phe Gln Ser Val Leu Val Lys Asp225 230 235 240Asp Lys Glu Leu Thr Asn Asp Ser His Val Ser Asp Leu Tyr Leu Leu245 250 255Asn Gln Ile Phe Glu Asn Phe Gly Thr Pro Asn Leu Thr Asp Phe Glu260 265 270Asp Glu Leu Phe Cys Asp Glu Tyr Asn Asn Glu Asn Leu His Phe Lys275 280 285Lys Phe Asn Leu Gln Lys Tyr Pro Arg Lys Asp Trp Asp Ile Ile Leu290 295 300Pro Arg Cys Asn Asp Asp Phe Met Lys Glu Ile Phe Thr Lys Met Ile305 310315 320Arg Tyr Asp Arg Ser Lys Arg Ile Thr Ser Lys Glu Ile Leu Gln Leu325 330 335Met Leu Asp
權(quán)利要求
1.屬于CIV1家族的蛋白激酶，其特征在于-它缺乏基序GxGx(Y/F)GxV，其中G表示甘氨酸，x表示任一氨基酸，Y/F表示酪氨酸或苯丙氨酸，V表示纈氨酸；-它具有非細(xì)胞周期蛋白依賴性的CAK活性；除釀酒酵母CAK ScCIV1以外。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白激酶，其特征是它能夠從白色念珠菌中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白激酶，其特征是它相應(yīng)于所附序列表中SEQ IDNO2下給出的序列。
4.編碼權(quán)利要求1到3任意一項的蛋白激酶的核酸。
5.將權(quán)利要求4的核酸插入到合適的載體中所構(gòu)建的重組載體。
6.篩選殺真菌產(chǎn)品的方法，其特征是它包含如下步驟，其中在每種想確定其殺真菌性質(zhì)的產(chǎn)品存在下，測定權(quán)利要求1所定義的CIV1家族的非細(xì)胞周期蛋白依賴性CAK的激酶活性，并選擇對該活性具有抑制作用的產(chǎn)品。
7.按權(quán)利要求6的方法選擇的產(chǎn)品在生產(chǎn)殺真菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有下列共同特征的蛋白激酶家族:它們?nèi)狈ΡＪ匦蛄蠫xGx(Y/F)GxV,它們具有一種非細(xì)胞周期蛋白依賴性CAK活性,該家族的蛋白激酶的抑制劑可用做殺真菌劑。
文檔編號A61P31/04GK1266456SQ98808008
公開日2000年9月13日 申請日期1998年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月12日
發(fā)明者G·費伊, J·G·瓦雷, C·曼恩, J－Y·蘇萊特 申請人:原子能委員會, 居里研究所, 國家科研中心