專利名稱：含生物活性大分子的水性氣溶膠制劑及制備相應(yīng)氣溶膠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)制備用于吸入給藥的蛋白質(zhì)及其它生物活性大分子的氣溶膠、及制備這種氣溶膠的水性制劑的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于用于吸入給藥以治療糖尿病的高濃縮胰島素的水性制劑。
以吸入性氣溶膠形式給藥的方式已久為人知。這種氣溶膠不僅用于治療呼吸疾病，如氣喘，但也可使用于將肺或鼻道粘膜作為吸收器官時(shí)。通?；钚晕镔|(zhì)的血中濃度可高達(dá)足以治療身體其它部位疾病的濃度。吸入性氣溶膠也可用作疫苗。
實(shí)際上，許多方法可用于制備氣溶膠。活性物質(zhì)的懸浮液或溶液可藉助于推進(jìn)氣體而噴霧，或?qū)⑽⒘；勰┬问降幕钚晕镔|(zhì)液化在吸入的空氣中，或利用噴霧器霧化水溶液。
然而，在復(fù)合結(jié)構(gòu)的分子(如干擾素)情形時(shí)，水性溶液的霧化將易于導(dǎo)致活性物質(zhì)的活性嚴(yán)重減低，這估計(jì)是剪切力和加熱的結(jié)果。一般認(rèn)為，如低活性蛋白質(zhì)凝集體的形成，在這過(guò)程中也引起了部分作用。在文獻(xiàn)“重組體同質(zhì)干擾素在空氣噴射及超聲波霧化中的穩(wěn)定性”中，醫(yī)藥科學(xué)雜志(J.Pharm.Sci.)841210-1215頁(yè)(1955年)，A.Y.伊普(Ip)及其同事描述了以超聲波或噴射霧化后干擾素聚集體形成的實(shí)例，及伴隨而生的干擾素生物活性的損失。即使生物分子(生物活性大分子)并未完全破壞，在此所提到的活性損失相當(dāng)重要，因其造成可能十分昂貴的生物分子相當(dāng)大的消耗，且導(dǎo)致每次啟用的活性物質(zhì)劑量不準(zhǔn)確。在氣溶膠制劑時(shí)復(fù)合結(jié)構(gòu)的分子的活性減少并不限于干擾素；當(dāng)將其它蛋白質(zhì)[請(qǐng)參照如耐文(Niven)等人，醫(yī)藥研究雜志(Pharm.Res.)1253-59頁(yè)(1995年)]及生物分子制備氣溶膠形式時(shí)，也會(huì)發(fā)生或多或少的損失程度。
除了以工業(yè)制備含生物分子的氣溶膠外，需要有第二個(gè)步驟以確保生物分子吸入肺部。成年人的肺呈現(xiàn)相當(dāng)大的吸收表面積，但對(duì)肺吸收生物分子也有許多陰礙。當(dāng)通過(guò)鼻和口呼吸時(shí)空氣與其所含的氣溶膠進(jìn)入氣管且再經(jīng)過(guò)小及較小支氣管及細(xì)支氣管而進(jìn)到肺泡。肺泡具有比氣管、支氣管及細(xì)支氣管加在一起更大得多的表面積。它是主要吸收區(qū)域，不僅可吸收氧氣，也可吸收生物活性大分子。為了由空氣進(jìn)入血流中，分子必須通過(guò)肺泡上皮、微血管上皮及這兩層細(xì)胞間的含淋巴的間質(zhì)空隙。這可通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸方法而進(jìn)行。這兩層細(xì)胞排列相當(dāng)緊密，因此大部分大型生物大分子(如蛋白質(zhì))通過(guò)該障壁的速度較小型分子緩慢許多。通過(guò)肺泡上皮及微血管內(nèi)皮的過(guò)程中會(huì)與其它生物方法競(jìng)爭(zhēng)，而導(dǎo)致生物分子的破壞。支氣管肺泡液含外蛋白酶[請(qǐng)參考如華爾(Wall)D.A.及藍(lán)納提(Lanutti)，A.T.所發(fā)表“存于鼠及犬的支氣管肺泡洗出液中的高含量的外肽酶活性”，國(guó)際醫(yī)藥雜志(Int.J.Pharm.)97171-181頁(yè)(1993年)]。支氣管肺泡液也含有巨噬細(xì)胞，可藉吞噬作用使吸入的蛋白質(zhì)顆粒消失。這些巨噬細(xì)胞移至支氣管樹(shù)的基部，在這里它們可通過(guò)粘膜纖毛清除機(jī)理離開(kāi)肺部。隨后可移入淋巴系統(tǒng)。此外，巨噬細(xì)胞可被氣溶膠形式的蛋白質(zhì)影響其生理，如干擾素可活化肺泡巨噬細(xì)胞?；罨奘杉?xì)胞的移動(dòng)是傳播吸入性蛋白質(zhì)的系統(tǒng)性作用的另一個(gè)機(jī)理。該過(guò)程的復(fù)雜性說(shuō)明某一種蛋白質(zhì)的氣溶膠試驗(yàn)結(jié)果僅以有限的程度轉(zhuǎn)移到其它形式蛋白質(zhì)。如干擾素之間的微小差異即可使其對(duì)肺中的降解機(jī)理的感受性造成顯著的作用[見(jiàn)玻西(Bocci)等人“干擾素在肺中的分解代謝125I標(biāo)記人類干擾素α的肺泡吸收會(huì)有部分生物活性的損失”抗病毒研究(AntiviralResearch)4211-220頁(yè)(1984年)]。
蛋白質(zhì)及其它生物大分子理論上確實(shí)可霧化，但通常霧化會(huì)伴隨活性損失。本發(fā)明的目的是提供一種制備吸入性氣溶膠的方法，用該方法生物活性大分子(特別是蛋白質(zhì))可被霧化而無(wú)任何實(shí)質(zhì)性的活性損失。
新一代無(wú)推進(jìn)劑噴霧器描述于美國(guó)專利第5,497,944；該專利內(nèi)容在此作為參考資料。其中所描述的噴霧器的特殊優(yōu)點(diǎn)是不需要使用推進(jìn)劑氣體，特別是氟氯烴。
更先進(jìn)的噴霧器具體實(shí)施例揭露于PCT/EP96/04351＝WO97/12687中。對(duì)于本發(fā)明，參考資料是針對(duì)其中所述的圖6(Respimat)并涉及本申請(qǐng)的部分說(shuō)明書(shū)。其中所述的噴霧器可有利地應(yīng)用于制備本發(fā)明的含生物活性大分子吸入性氣溶膠。特別是，在其中所述的噴霧器可用于吸入胰島素。由于其輕便的尺寸，該裝置可使病患者隨時(shí)攜帶。利用所述的噴霧器，特定量(優(yōu)選為約15微升)的含活性物質(zhì)溶液可于高壓下通過(guò)小型噴嘴噴出以形成吸入性氣溶膠，其平均顆粒尺寸介于3至10微米。為吸入胰島素使用時(shí)，以每次可將10～50微升的氣溶膠制劑霧化成吸入性小滴的噴霧器較為合適。
根據(jù)本發(fā)明制備的氣溶膠特別重要的一點(diǎn)是使用上述專利或?qū)＠暾?qǐng)所描述的噴霧器來(lái)進(jìn)行含蛋白質(zhì)或其它生物活性大分子的活性物質(zhì)溶液的不含推進(jìn)劑的霧化。
本質(zhì)上，在其中所揭露的輕便尺寸霧化器(噴霧器，大小約10cm)包含上罩部分、泵罩、噴嘴、夾持裝置、彈簧罩、彈簧及貯存容器、其特征是-一個(gè)裝在上罩部分的泵罩，且其一端支撐一個(gè)有噴嘴或噴嘴結(jié)構(gòu)的噴嘴組件，-一個(gè)有閥組件的空心活塞，-一個(gè)固定空心活塞的傳動(dòng)凸緣，它位于上罩部分內(nèi)，一挾持裝置位于上罩部，-一個(gè)內(nèi)有彈簧的彈簧罩，它以一個(gè)旋轉(zhuǎn)軸承旋轉(zhuǎn)裝在上罩部，-下罩部以同軸方向裝在彈簧罩上。
關(guān)于有閥組件的空心活塞專利WO 97/12687是已揭露的類似裝置之一。其部分突入泵罩的圓筒中，且裝置成可于圓筒中作軸向移動(dòng)。特別可參考

圖1至4，尤其圖3，以及專利說(shuō)明的相關(guān)部分。當(dāng)彈簧放松時(shí)，有閥組件的空心活塞在其高壓側(cè)可施與液體(適當(dāng)?shù)幕钚晕镔|(zhì)溶液)5-60Mpa(約50-600巴)，較佳為10-60Mpa(約100-600巴)，的壓力。
閥組件優(yōu)選安置于面對(duì)噴嘴組件的空心活塞的尾端。
噴嘴組件中的噴嘴優(yōu)選為微結(jié)構(gòu)，如由微技術(shù)制造。微結(jié)構(gòu)噴嘴組件公開(kāi)于，如WO-94/07607中；該專利說(shuō)明的內(nèi)容在此做為參考資料。
噴嘴組件包括，如兩片互相緊密接合的玻璃和/或硅，其中至少一片具有一個(gè)或多個(gè)微結(jié)構(gòu)的管，它連接噴嘴的入口端至排出端。于噴嘴的排出端至少有一個(gè)小于或相當(dāng)于10微米的圓形或非一圓形的開(kāi)口。
噴嘴組件的噴嘴中液體的流動(dòng)方向可互相平行或傾斜。如果噴嘴組件的排出端至少有2個(gè)噴嘴開(kāi)口，則流動(dòng)方向可以互相傾斜20-160°角，優(yōu)選角度為60-150°。流動(dòng)方向在噴嘴開(kāi)口附近會(huì)合。
夾持裝置有一彈簧，優(yōu)選為圓筒狀螺旋形的壓縮彈簧，作為機(jī)械能的儲(chǔ)存處。彈簧作用于傳動(dòng)凸緣作為跳變組件，其移動(dòng)是由鎖定組件的位置來(lái)決定。傳動(dòng)凸緣的通道準(zhǔn)確地由上下制動(dòng)栓所限制。優(yōu)選是以與下罩部的彈簧罩反向旋轉(zhuǎn)上罩部所產(chǎn)生的外力矩，通過(guò)一個(gè)力傳送齒輪，如螺旋形的推力凸輪，將彈簧置于張力下(上緊)。于這種情況下，上部罩部分及傳動(dòng)凸緣含有單速或多速楔形齒輪。
含有嚙合鎖定面的鎖定組件以環(huán)形圍繞傳動(dòng)凸緣。它包括，如本身具有徑向彈性變形的塑料或金屬環(huán)。該環(huán)安置在霧化器軸的直角平面上。彈簧上緊后，鎖定組件的鎖定面滑入傳動(dòng)凸緣的通道，并防止彈簧松開(kāi)。鎖定組件是以按鈕啟動(dòng)。啟動(dòng)按鈕是連接或聯(lián)合在鎖定組件上。要啟動(dòng)鎖定裝置，須以平行于環(huán)平面方向壓下啟動(dòng)按鈕，優(yōu)選為壓入噴霧器中；可變形環(huán)因而在環(huán)平面上變形。鎖定閥的詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)述于WO 97/20590。
下罩部分可以軸向壓在彈簧罩上，并覆蓋軸承、軸傳動(dòng)部及溶液貯藏容器。
操作霧化器時(shí)，以與下罩部反方向旋轉(zhuǎn)上罩部，下罩部中有彈簧罩。藉助于螺旋形推力凸輪而壓縮和偏壓彈簧，而鎖定裝置會(huì)自動(dòng)吻合。旋轉(zhuǎn)角度優(yōu)選為360°的完整分?jǐn)?shù)，例如180°。當(dāng)彈簧偏壓時(shí)，上部罩部的傳動(dòng)組件會(huì)移動(dòng)些許距離，將空心活塞拉回到泵罩圓筒中，結(jié)果部分貯存容器內(nèi)的液體被吸到噴嘴前方的高壓室內(nèi)。
必要時(shí)，多個(gè)裝有霧化溶液的可交換貯存容器都可插入霧化器并應(yīng)用。貯存容器含有本發(fā)明的水性氣溶膠制劑。
霧化步驟起始于輕壓?jiǎn)?dòng)按鈕。鎖定裝置會(huì)打開(kāi)傳動(dòng)組件。偏壓彈簧將活塞推入泵罩圓筒中。液體會(huì)以霧化形式離開(kāi)霧化器噴嘴。
其它詳細(xì)構(gòu)造公開(kāi)于PCT專利申請(qǐng)WO 97/12683和WO 97/20590；這些刊物內(nèi)容在此做為參考資料。
霧化器(噴霧器)的元件是用適于此目的的材料來(lái)制造。霧化器的外罩和-甚至其操作允許的-其它部分優(yōu)選為塑料制，如注模制造。為醫(yī)藥用途，應(yīng)使用生理可接受的材料。
描述于WO 97/12687的霧化器可用在，如不含推進(jìn)劑產(chǎn)品的藥物氣溶膠。其可產(chǎn)生平均約5微米大小的吸入性氣溶膠小滴。
圖4a/b，與WO 97/12687的圖6a/b相同，所表示的噴霧器(Respimat)可使根據(jù)本發(fā)明的水性氣溶膠制劑方便地吸入。
圖4a表示彈簧已偏壓的霧化器的縱切面，圖4b表示彈簧已松開(kāi)的霧化器的縱切面。
上罩部51含有泵罩52，在其端部裝有噴霧器噴嘴的座53。噴嘴座中裝有噴嘴組件54及過(guò)濾器55?？招幕钊?7固定在挾持裝置的傳動(dòng)凸緣56中，部分突入泵罩的圓筒中?？招幕钊捕烁接虚y組件58?？招幕钊悦芊?9封住。上罩部?jī)?nèi)部是彈簧松開(kāi)時(shí)支持傳動(dòng)凸緣的制動(dòng)栓60。傳動(dòng)凸緣上是當(dāng)彈簧偏壓時(shí)支持凸緣的制動(dòng)栓61。于彈簧偏壓后，鎖定組件62在制動(dòng)栓61和上罩部的一個(gè)支撐點(diǎn)63間運(yùn)動(dòng)。啟動(dòng)鈕64連接到鎖定組件。上罩部分的尾端為口部件65，以可移動(dòng)的保護(hù)套66關(guān)閉。
有壓縮彈簧68的彈簧罩67藉助于固定突扣(Schnappnasen)69及可旋轉(zhuǎn)軸承而裝在上罩部上。推壓下罩部70套住彈簧罩。彈簧罩內(nèi)裝有用于要霧化的液體72的可替換貯存容器71。貯存容器以塞子73密封，空心活塞通過(guò)塞子伸入貯存容器，其尾端浸入液體中(供應(yīng)活性物質(zhì)溶液)。
機(jī)械計(jì)數(shù)器的主軸74是裝在彈簧罩的外表面。面向上部罩部分的主軸端部是傳動(dòng)小齒輪75?；瑝K76裝在主軸上。
上述的噴霧器適于霧化本發(fā)明的氣溶膠制劑以產(chǎn)生適于吸入的氣溶膠。
噴霧器的有效性可利用實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)試驗(yàn)，先將蛋白質(zhì)溶液霧化，再以所謂的“阱”收集噴霧(見(jiàn)圖1)。氣溶膠貯存器(a)中的蛋白質(zhì)活性與所收集的液體(b)的活性相比較，例如通過(guò)免疫測(cè)定法或應(yīng)用蛋白質(zhì)生物有效性分析。該實(shí)驗(yàn)可評(píng)估噴霧法中蛋白質(zhì)的損壞度。第二種氣溶膠質(zhì)量的變數(shù)是所謂“吸入比例”，在此定義為具有測(cè)定的平均空氣動(dòng)力學(xué)直徑[measured medianaero-dynamic diameter(MMAD)]小于5.8微米的霧狀小滴的比例。吸入比例可應(yīng)用“安德生沖擊器(Andersen Impactor)”進(jìn)行測(cè)量。為了良好蛋白質(zhì)吸收，重要的是不僅須達(dá)到霧化而無(wú)任何實(shí)質(zhì)上的活性損失而且也要產(chǎn)生有良好吸入性比例(約60％)的氣溶膠。小于5.8微米MMAD的氣溶膠明顯較適于以達(dá)到肺泡，于該處被吸收的機(jī)會(huì)明顯增加。霧化裝置的有效性也可于體內(nèi)系統(tǒng)試驗(yàn)；在這情況下如對(duì)肺蛋白酶敏感性之類的因素也會(huì)有影響。作為體內(nèi)試驗(yàn)系統(tǒng)的實(shí)例，將含蛋白質(zhì)的霧通過(guò)氣管插管給藥于狗。于適當(dāng)時(shí)間間隔采取血液樣本，再以免疫法或生物方法測(cè)量血漿中的蛋白質(zhì)含量。
合適的噴霧器描述于上面提及的美國(guó)專利US 5,497,944及WO 97/12687中，特別如圖6a/b所示(于本專利申請(qǐng)中為圖4a/b)。用于霧化本發(fā)明生物活性大分子的水性氣溶膠制劑的優(yōu)選噴嘴裝置示于美國(guó)專利的圖8。
令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)上述不含推進(jìn)劑的噴霧器可噴出預(yù)定量-例如15微升-的氣溶膠制劑，在100至500巴的高壓下，通過(guò)至少一個(gè)液壓直徑為1-12微升的噴嘴，得以產(chǎn)生平均粒徑小于約10微米的可吸入小滴，它適于霧化蛋白質(zhì)和其它大分子的水性氣溶膠制劑，因?yàn)樗伸F化的蛋白質(zhì)范圍廣泛，而沒(méi)有任何明顯的活性損失。以上述美國(guó)專利圖8所示的噴嘴裝置為優(yōu)選。特別令人驚訝的是這種噴霧器霧化干擾素的能力，因其它裝置都會(huì)在霧化過(guò)程造成極大的活性損失。不論體外試驗(yàn)或是體內(nèi)試驗(yàn)，干擾素ω以這裝置霧化后的特高活性也令人驚訝。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是其甚至對(duì)高濃度生物活性大分子溶液霧化的驚人能力而且也沒(méi)有任何活性的實(shí)質(zhì)損失。使用高濃度溶液使得裝置可小到舒適地經(jīng)常攜帶于外套口袋或手提包內(nèi)。公開(kāi)于圖4的噴霧器可滿足這些需求并可用于霧化高濃度的生物活性大分子溶液。
舉例而言，此類裝置特別適于使糖尿病患者通過(guò)吸入胰島素而自行治療。優(yōu)選使用含有20至90毫克/毫升的胰島素的高濃度水性溶液，更好是含33至60毫克/毫升胰島素的溶液，特別是含33至40毫克/毫升胰島素溶液。依噴霧器中可用的貯存器尺寸，含胰島素溶液的濃度大于25毫克/毫升，優(yōu)選為30毫克/毫升，適于由上述的手持裝置吸入有效治療量的胰島素。藉吸入給藥胰島素使活性物質(zhì)能快速開(kāi)始作用，使病患者可自行于如開(kāi)飯前以所需量治療。如Respimat的小尺寸使病患者可時(shí)常攜帶該裝置。
Respimat(WO 97/12867中圖6)有一固定量的給劑室，使病患者藉噴霧次數(shù)決定并吸入所需的胰島素劑量。除噴霧次數(shù)外，胰島素計(jì)量還決定于貯存器72中胰島素溶液的濃度。其可在，如25及90毫克/毫升之間，大于約30毫克/毫升的較高濃度溶液為優(yōu)選。
制備高濃度穩(wěn)定胰島素溶液的方法描述于，如WO專利申請(qǐng)83/00288(PCT/DK82/00068)及83/03054(PCT/DK83/00024)，其在此做為參考材料。
根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)上述裝置投藥含胰島素氣溶膠制劑不應(yīng)大于1600.10-6Pas的動(dòng)態(tài)粘度以確保噴霧產(chǎn)生劑量的吸入比例不低于可接受程度。以粘度值限于1200.10-6以下的胰島素溶液為優(yōu)選，最佳為達(dá)1100.10-6Pas(Pascalseconds)。必要時(shí)，可不使用水為溶劑而改以溶劑混合物以降低藥物溶液的粘度。這點(diǎn)可通過(guò)如添加乙醇而進(jìn)行。水性配方中乙醇的量可高達(dá)50％；優(yōu)選量為30％。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提出適合應(yīng)用于本申請(qǐng)專利方法的適當(dāng)氣溶膠制劑。
本發(fā)明也涉及水性溶液形式的氣溶膠制劑，它含有作為活性物質(zhì)生物活性大分子，特別是蛋白質(zhì)和肽，其濃度介于3毫克/毫升及150毫克/毫升之間，或介于25毫克/毫升及100毫克/毫升之間。
已發(fā)現(xiàn)，令人驚奇地，應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)方法，方可使高粘度溶液大分子噴射出適當(dāng)尺寸的吸入小滴。這使每次應(yīng)用時(shí)可給以更大量活性物質(zhì)，且因此增加大分子的吸入性治療方法的療效。
根據(jù)本發(fā)明方法，含大分子(例如白蛋白)的水性氣溶膠制劑可應(yīng)用達(dá)1600.10-6Pas的粘度(于25℃測(cè)量)。粘度為1500.10-6Pas時(shí)仍可獲得32％的吸入比例。
粘度高達(dá)1100.10-6Pas的大分子較高粘度溶液為優(yōu)選。以此溶液，可獲得含約60％吸入比例的含活性物質(zhì)的小滴。特性粘度值可用文獻(xiàn)中的方法利用Ostwald的粘度計(jì)測(cè)量。作為比較，水的粘度為894.10-10Pas(于25℃測(cè)量)。
為說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)，下面描述干擾素ω溶液的體外及體內(nèi)試驗(yàn)。Respimat和干擾素ω的體外試驗(yàn)將Respimat裝置(a)的貯存器裝入5毫克/毫升干擾素ω溶液(調(diào)配成50mM檸檬酸三鈉，150mM NaCl，pH5.5)。啟動(dòng)該裝置，以28升/分鐘的氣流霧化約12.9微升的量(壓一下)。霧化溶液被阱(圖1)收集。以免疫方法測(cè)量貯存溶液中及被收集于阱的溶液中的干擾素ω，使用ELISA，及生物學(xué)方法，通過(guò)抑制腦心肌炎病毒感染的A549細(xì)胞的破壞程度進(jìn)行測(cè)量。干擾素的免疫測(cè)量法相當(dāng)簡(jiǎn)單。已發(fā)表的霧化蛋白質(zhì)試驗(yàn)在許多情況下受限于免疫測(cè)量法。然而，外加的生物測(cè)量非常重要，由于其特別敏感且為與治療學(xué)有關(guān)的定量法測(cè)定蛋白質(zhì)破壞程度的方法。這些方法并不會(huì)得到如物理-化學(xué)或免疫方法的相同結(jié)果，這是由于分子在與抗體結(jié)合時(shí)會(huì)失去其生物特性而無(wú)任何改變。
在三次實(shí)驗(yàn)中，在阱中的溶液(b)中發(fā)現(xiàn)基于初始溶液有84％、77％及98％的免疫學(xué)所確認(rèn)的干擾素。對(duì)相同溶液的生物測(cè)量所獲得的結(jié)果為在阱中的收集溶液有54％、47％及81％的回收率的生物學(xué)確認(rèn)干擾素。此高比率表明以Respimat裝置霧化僅破壞相當(dāng)少量的干擾素活性。由上述Respimat裝置噴出的霧同時(shí)以氣流(28升/分鐘)通過(guò)安德生(Andersen)沖擊器。測(cè)量其大小小于5.8微米的顆粒比例(“吸入比例”)。吸入比例相當(dāng)于70％(免疫測(cè)量)。如干擾素之類的蛋白質(zhì)通常用人的血清蛋白調(diào)配以對(duì)敏感的干擾素提供更進(jìn)一步的保護(hù)。對(duì)含有另外人血清白蛋白(0.5％)的上述制劑也進(jìn)行了試驗(yàn)。在三次試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)基于原始溶液在阱中收集的溶液(b)中含83％、83％及79％(同樣的與初始溶液相比較)的免疫學(xué)確認(rèn)的干擾素。用相同溶液作生物測(cè)量則在阱的收集溶液中獲得60％、54％及66％的生物學(xué)活性干擾素。其吸入比例(免疫學(xué)測(cè)量法)為67％。在另一組試驗(yàn)中，將濃度為53毫克/毫升的濃縮干擾素ω溶液倒入Respimat裝置的貯存器中，然后霧化。在四次試驗(yàn)中，基于初始溶液，在阱收集的溶液(b)內(nèi)發(fā)現(xiàn)100％、60％、68％及72％的免疫學(xué)可確認(rèn)的干擾素。用相同溶液進(jìn)行生物學(xué)測(cè)量，則在阱收集溶液中可獲得95％、98％、61％及83％回收率的生物學(xué)可確認(rèn)的干擾素。這種高回收率表明Respimat裝置也可應(yīng)用于霧化濃縮蛋白質(zhì)溶液而不會(huì)造成過(guò)多干擾素活性的損失。Respimat和干擾素ω的體內(nèi)試驗(yàn)將干擾素ω以吸入及靜脈注射途徑在不同實(shí)驗(yàn)中對(duì)同一只狗給藥。以免疫學(xué)及生物學(xué)方法測(cè)量不同時(shí)間的血中干擾素含量。此外，測(cè)量血中的新蝶呤(neopterin)含量。新蝶呤是免疫活化的標(biāo)記；它是由巨噬細(xì)胞在干擾素刺激后所釋放[見(jiàn)Fuchs等人，“新蝶呤，作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的標(biāo)記在生化及臨床中的用途”(Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.)1011-6頁(yè)(1993年)]。新蝶呤含量的測(cè)量可用于定量干擾素活性。
預(yù)先進(jìn)行基礎(chǔ)鎮(zhèn)靜，再以戊巴比妥麻醉后，將干擾素給藥予狗。將動(dòng)物插管且裝上人工通氣(控制呼吸量每分鐘體積為4升/分鐘，速度每分鐘呼吸10次)。用Respimat裝置共噴射20次以投藥。每次噴藥都在開(kāi)始吸氣時(shí)。于吸入期之后及呼出前有5秒鐘的間隔。在下一次給藥干擾素ω前該動(dòng)物有二次無(wú)給藥的呼吸周期。為取得血清及肝素血漿，于干擾素投藥前且于干擾素投藥后不同時(shí)間內(nèi)采集血液，直到14天。測(cè)量肝素血漿中的干擾素ω是使用ELISA的免疫法及以生物學(xué)法，通過(guò)抑制腦心肌炎病毒感染A549細(xì)胞的破壞來(lái)測(cè)定。血清新蝶呤是以免疫法測(cè)定。圖2表明由Respimat裝置噴20次干擾素ω后，用免疫學(xué)方法(圖2a)及生物學(xué)方法(圖2b)測(cè)量所得的干擾素ω含量。令人驚奇地，以吸入法投藥后，可測(cè)得非常高的血清新蝶呤含量。在所進(jìn)行的體外試驗(yàn)中，Respimat裝置噴一次的溶液量平均相當(dāng)于12.8毫克/每噴次。因此可預(yù)料使用5毫克/毫升溶液的Respimat噴20次后可輸送約1.28毫克的干擾素。給予該劑量后的新蝶呤測(cè)量值與以靜脈注射給予0.32毫克的干擾素后的新蝶呤測(cè)量值相比可得更高并持續(xù)更久的含量。圖3表示該結(jié)果。高的新蝶呤含量可證明通過(guò)Respimat投予干擾素可得良好的生物學(xué)活性。
Respimat裝置的可霧化生物活性大分子的優(yōu)點(diǎn)并不限于干擾素，可見(jiàn)實(shí)例2所示。Respimat和錳過(guò)氧化物歧化酶的體外試驗(yàn)霧化試驗(yàn)物質(zhì)的裝置和相關(guān)的阱示于圖1。于這實(shí)驗(yàn)中，將Respimat裝置的貯存容器(a)裝滿3.3毫克/毫升的錳過(guò)氧化物歧化酶(MnSOD)的磷酸鹽-緩沖生理食鹽水(PBS)。操作該裝置并以28升/分鐘的氣流量霧化約13微升(噴一次)的量。正確的霧化量是以重量分析法測(cè)定(在三個(gè)連續(xù)試驗(yàn)測(cè)量值為12.8、13.7及14.3毫克)。霧化溶液收集在阱(b)中。該阱含20毫升PBS。此外，添加2毫升的5％牛血清白蛋白以穩(wěn)定阱中的蛋白質(zhì)。測(cè)量貯存溶液及收集于阱中的溶液中的MnSOD，它是通過(guò)ELISA的免疫法及通過(guò)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)后所還原的過(guò)氧化物量的酶促法測(cè)量。于三次試驗(yàn)中，測(cè)量收集于阱中溶液(b)的霧化溶液中有78％、89％及83％的免疫學(xué)可確認(rèn)的MnSOD。霧化后沒(méi)有可測(cè)出的酶活性損失。其可吸入比例(免疫測(cè)量)為61％。
下列實(shí)施例描述根據(jù)本發(fā)明所生產(chǎn)的含胰島素作為活性物質(zhì)的氣溶膠制劑。胰島素溶液的制備及填充至噴霧器將牛的175毫克結(jié)晶胰島素(鈉鹽)(根據(jù)制造商資料，相當(dāng)于4462.6 I.U.)溶于3.5毫升的無(wú)菌純水(Seralpur水)。加入溶于100微升無(wú)菌純水中的8.5微升間-甲酚(相當(dāng)于8.65毫克)及7.53毫克的酚并輕輕攪拌。在此溶液中加入365微升的5毫克/毫升ZnCl2溶液(相當(dāng)于所使用胰島素重量的0.5％的鋅)且以0.2N NaOH將pH調(diào)整至7.4。將混合物體積以無(wú)菌水加至5毫升并以無(wú)菌微孔過(guò)濾器(孔徑為0.22微米)過(guò)濾。將4.5毫克氣溶膠制劑轉(zhuǎn)移至噴霧器(Respimat)的貯存器內(nèi)(72，圖4)。將容器以蓋子關(guān)閉且裝到該裝置上。
這樣制備的氣溶膠制劑中胰島素濃度約35毫克/毫升，溶液粘度約1020.10-6Pas。Pespimat及高濃度胰島素溶液的體內(nèi)試驗(yàn)預(yù)先接受基礎(chǔ)鎮(zhèn)靜后，將胰島素投予以戊巴比妥麻醉的狗。將動(dòng)物如上所述插管并通氣。用Respimat裝置共噴送6次的胰島素溶液。每次噴藥都在開(kāi)始吸氣時(shí)。于吸入期之后及呼出前有5秒的間隔。下一次投予胰島素前有二次不投藥的呼吸循環(huán)。采血時(shí)間為投藥前1小時(shí)、投藥時(shí)及長(zhǎng)達(dá)8小時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間。應(yīng)用Trasch、Koller及Tritscher法[Klein.Chem.30；969(1984年)]測(cè)量新鮮血液中的血葡萄糖含量，它是使用由Boehringer Mannheim制造的Refletron裝置進(jìn)行的。令人驚奇地，即使以如此高濃度胰島素溶液，仍可得到良好生物活性(在以吸入法投予胰島素后可降低血中葡萄糖含量)。結(jié)果示于圖5。
根據(jù)本發(fā)明的水性氣溶膠制劑除活性物質(zhì)和水份外，若有需要可含其它溶劑如乙醇。乙醇量是受限制的，其作用是溶解活性物質(zhì)，這因?yàn)榛钚晕镔|(zhì)在過(guò)高濃度時(shí)可能會(huì)從氣溶膠制劑中沉淀出來(lái)。可穩(wěn)定溶液的添加劑如藥學(xué)上可接受的防腐劑，如乙醇、酚、甲苯酚或?qū)αu苯甲酸酯(paraban)、藥學(xué)上可接受的酸、堿或調(diào)節(jié)pH的緩沖液或表面活性劑都可以。此外，為了穩(wěn)定溶液或促進(jìn)氣溶膠品質(zhì)，可添加金屬螯合劑如EDTA。為了增進(jìn)氣溶膠制劑中的活性物質(zhì)的溶解度和/或穩(wěn)定性，可添加氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、以及特別是聚丙烯纖維(prolene)。
除干擾素、過(guò)氧化物歧化酶及胰島素外，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑的優(yōu)選活性物質(zhì)有反義寡核苷酸苯基二氫喹唑啉(orexine)促紅細(xì)胞生成素腫瘤壞死因子-α腫瘤壞死因子-βG-CSF(粒性白細(xì)胞菌落刺激因子)GM-CSF(粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞菌落刺激因子)安尼克信素(annexins)降鈣素勒帕茄堿(leptins)甲狀旁腺素甲狀旁腺素片段白介素，如白介素2、白介素10、白介素12可溶性ICAM(細(xì)胞間粘合分子)促生長(zhǎng)激素抑制素生長(zhǎng)激素tPA(組織纖溶酶原激活物)TNK-tPA腫瘤-相關(guān)抗原(呈肽、蛋白質(zhì)或DNA)肽緩激肽拮抗劑尿舒張肽(urodilatin)GHRH(生長(zhǎng)激素釋放激素)CRF(促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子)EMAP II肝素可溶性白介素接受體如sIL-1接受體疫苗，如肝炎疫苗或麻疹疫苗反義聚核苷酸轉(zhuǎn)錄因子
權(quán)利要求
1.一種水性氣溶膠制劑，其是用于吸入給藥作為活性物質(zhì)的生物活性大分子，其特征是，該水性氣溶膠制劑的活性物質(zhì)含量濃度在3毫克/毫升至150毫克/毫升之間，優(yōu)選為25至100毫克/毫升間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的水性氣溶膠制劑，其特征是，該活性物質(zhì)是生物活性蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的水性氣溶膠制劑，其特征是，使用胰島素作為活性物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的水性氣溶膠制劑，其特征是，作為活性物質(zhì)的胰島素濃度大于25毫克/毫升，優(yōu)選為大于30毫克/毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的水性氣溶膠制劑，其特征是，該化合物是選自下列作為活性物質(zhì)反義寡核苷酸苯基二氫喹唑啉(orexine)促紅細(xì)胞生成素腫瘤壞死因子-α腫瘤壞死因子-βG-CSF(粒性白細(xì)胞菌落刺激因子)GM-CSF(粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞菌落刺激因子)安尼克信素(annexins)降鈣素勒帕茄堿(leptins)甲狀旁腺素甲狀旁腺素片段白介素，如白介素2、白介素10、白介素12可溶性ICAM(細(xì)胞間粘合分子)促生長(zhǎng)激素抑制素生長(zhǎng)激素tPA(組織纖溶酶原激活物)TNK-tPA腫瘤-相關(guān)抗原(呈肽、蛋白質(zhì)或DNA)肽緩激肽拮抗劑尿舒張肽GHRH(生長(zhǎng)激素釋放激素)CRF(促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子)EMAP II肝素可溶性白介素接受體如sIL-1接受體疫苗，如肝炎疫苗或麻疹疫苗反義聚核苷酸轉(zhuǎn)錄因子
6.根據(jù)權(quán)利要求1的水性氣溶膠制劑，其特征是，以過(guò)氧化物歧化酶作為活性物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的水性氣溶膠制劑，其特征是，以干擾素作為活性物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的水性氣溶膠制劑，其特征是，以干擾素ω作為活性物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的水性氣溶膠制劑，其特征是，它含有一種或多種選自以下的包括表面活性物質(zhì)的助劑，如表面活性劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、滲透增強(qiáng)劑和/或防腐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的水性氣溶膠制劑，其特征是，它含有一種氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的水性氣溶膠制劑，其特征是，它含有脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸以增進(jìn)活性物質(zhì)的溶解度或穩(wěn)定性。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的水性氣溶膠制劑，其特征是，該氣溶膠制劑的粘度至高達(dá)1600.10-6Pas。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的水性氣溶膠制劑，其特征是，該氣溶膠制劑的粘度介于900.10-6Pas至1100.10-6Pas之間。
14.一種用于吸入給藥作為活性物質(zhì)的生物活性大分子的水性氣溶膠制劑，其特征是，該水性溶液的粘度介于900.10-6Pas至1600.10-6Pas之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的水性氣溶膠制劑，其特征是，該水性溶液的粘度介于950至1300.10-6Pas之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求13、14或15項(xiàng)的水性氣溶膠制劑，其特征是，該氣溶膠制劑含有權(quán)利要求3或5中所述的活性物質(zhì)。
17.一種由氣溶膠制劑制備用于以吸入法給藥以生物活性大分子的氣溶膠的方法，特別是以肽或蛋白質(zhì)作為活性物質(zhì)，其特征是，在不含推進(jìn)劑的噴霧器中，在100及500巴間的高壓下，通過(guò)至少一個(gè)液壓的直徑為1至12微米的噴嘴，自定量室中定量噴出單一劑量的醫(yī)療有效量的氣溶膠制劑，于1至2秒的期間內(nèi)形成平均粒徑小于10微米的吸入性小滴。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征是，該單一劑量的有效量為10至20微升。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征是，該噴霧器有2個(gè)噴嘴，噴嘴方向排成使兩股噴流會(huì)合，以致使氣溶膠制劑霧化。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1至16的水性氣溶膠制劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)的方法，其特征是，該氣溶膠制劑中的活性物質(zhì)為胰島素。
22.一種以吸入胰島素投藥以治療糖尿病的方法，其特征是，于單次使用時(shí)，使用噴霧器噴出10至50微升的含有25毫克/毫升至60毫克/毫升胰島素的溶液，形成吸入性小滴。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征是，吸入含30至40毫克/毫升的胰島素溶液10至20微升。
24.一種以胰島素含量高于30毫克/毫升的溶液來(lái)制備平均粒徑小于10微米的氣溶膠，以吸入法治療糖尿病的用途。
25.一種以胰島素含量在25至60毫克/毫升的溶液來(lái)制備平均粒徑小于10微米的氣溶膠，以吸入法治療糖尿病的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征是，利用不含推進(jìn)劑的噴霧器，由10至50微升，優(yōu)選為10至20微升溶液來(lái)的制備氣溶膠。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于用于生產(chǎn)不含推進(jìn)劑的吸入性氣溶膠的含生物活性大分子的水性氣溶膠制劑。
文檔編號(hào)A61K9/12GK1265583SQ98807895
公開(kāi)日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月4日
發(fā)明者赫伯特·蘭科, 克里斯托弗·J·M·米德, 伯恩德·齊倫伯格, 拉爾夫·C·賴姆霍爾茲 申請(qǐng)人:貝林格爾英格海姆法瑪公司