專利名稱：細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的增強(qiáng)劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，更詳細(xì)地說是涉及藥理學(xué)和治療方法，是用來通過增加和/或調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和造血因子的內(nèi)源性產(chǎn)生而預(yù)防和治療各種疾病。
已知有大量?jī)?nèi)源性產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物體液因子即細(xì)胞因子和造血因子具有重要的生物學(xué)活性，并在各種人類疾病的治療中是非常有用的1，2。許多這樣的因子正進(jìn)行人體測(cè)試，已證明功效的那些可作為藥劑從商業(yè)上獲得。
在腫瘤學(xué)中最廣泛研究的細(xì)胞因子和造血因子是白細(xì)胞介素2(IL-2)3，4，腫瘤壞死因子α(TNF-α)5，紅細(xì)胞生成素，巨嗜細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞集落刺激因子(分別為GM-CSF和G-CSF6，7)。研究用于治療傳染病的細(xì)胞因子和造血因子也不少干擾素(IFN-g和IFN-b)8，9，10，集落刺激因子11，12，以及類似物質(zhì)13。集落刺激因子和紅細(xì)胞生成素在血液學(xué)中廣泛使用14，15。
但是，這些外源性給予的試劑在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用存在局限性，這與下列因素有關(guān)缺乏可接受的藥物制劑或費(fèi)用過高，這些物質(zhì)在生物培養(yǎng)基中的半衰期短，劑量的確定困難以及許多毒性和變應(yīng)性作用16，17，即使是重組產(chǎn)物也因人工合成過程中的操作波動(dòng)而對(duì)人有機(jī)體有或多或少的免疫原性。
關(guān)于這一點(diǎn)，考慮到要達(dá)到更恒定且顯著的治療作用而沒有副反應(yīng)，因此最好是誘導(dǎo)患者體內(nèi)的自身細(xì)胞因子和造血因子立即內(nèi)源性產(chǎn)生。因這種內(nèi)在刺激而產(chǎn)生的治療作用沒有與外源性引入細(xì)胞因子和造血因子有關(guān)的所有缺點(diǎn)。
目前有大量化合物正在實(shí)驗(yàn)室和臨床評(píng)定它們刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的情況。普遍已知的情況包括成功的例子是利用微生物產(chǎn)物來治療癌癥，近十年來已顯示這將經(jīng)刺激腫瘤壞死因子內(nèi)源性產(chǎn)生而介導(dǎo)?，F(xiàn)在，能引起各種細(xì)胞因子和造血因子同時(shí)產(chǎn)生的產(chǎn)物已逐漸被認(rèn)為是多細(xì)胞因子誘導(dǎo)物。其中一些是已殺死的鏈球菌制品，不透明諾卡氏菌，和其他細(xì)菌產(chǎn)物19，20，21。然而，實(shí)際上所有具有這樣的效力的物質(zhì)不是已殺死的微生物或微生物產(chǎn)物，就是具有不均勻組成的化合物，這使得它們的醫(yī)學(xué)應(yīng)用是有限的，或者甚至使得它們的治療用途無法實(shí)現(xiàn)。因此，尋找細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的醫(yī)學(xué)和藥學(xué)上可接受的誘導(dǎo)物的問題迄今為止仍未解決。
在該申請(qǐng)中一般將氧化型谷胱甘肽(也叫做二硫化谷胱甘肽和GSSG)叫做GSSG。
已知GSSG是三肽谷胱甘肽(g-谷胺?；?半胱氨酰-甘氨酸)的遮蔽物，其中具有上述結(jié)構(gòu)的三肽的兩個(gè)分子是經(jīng)半胱氨酸殘基間的共價(jià)二硫鍵連接的。因此，三肽谷胱甘肽(谷胱甘肽，還原型谷胱甘肽，GSH；下文中叫做GSH)及其遮蔽物GSSG都是存在于動(dòng)物組織和生物液體中的天然代謝物。同時(shí)，GSSG的天然血液濃度不足以在正常和病理?xiàng)l件下誘導(dǎo)細(xì)胞因子內(nèi)源性產(chǎn)生。
GSH是氨基酸代謝中最重要的中間體之一，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一個(gè)因子22，23。GSH的還原性能和其因半胱氨酸殘基的巰基部分而作為還原等價(jià)物的供體的功能具有決定性意義。GSH的這一特性使得該物質(zhì)在最重要的胞內(nèi)抗氧化劑系統(tǒng)之一中起關(guān)鍵性作用，該系統(tǒng)由這樣的GSH和它的可逆轉(zhuǎn)化為GSSG的兩種酶谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶組成24，25。所述系統(tǒng)的永久功能對(duì)于內(nèi)源性產(chǎn)生的氧化劑以及外源物質(zhì)的活性代謝物的滅活或還原來說是必不可少的26，27。
還已知GSH參與涉及一組酶的解毒反應(yīng)，這組酶總稱為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶28。這些酶能使GSH分子與各種生物異源物質(zhì)通過在生物異源物質(zhì)與谷胱甘肽間經(jīng)三肽的半胱氨酸殘基的巰基部分成鍵而結(jié)合在一起。隨后該結(jié)合物的降解是g-谷氨酰基環(huán)化酶催化的，且根據(jù)生物異源物質(zhì)的性質(zhì)可有相當(dāng)大的變化。
在天然條件下，由于GSSG不斷地還原為GSH，因此其量不能積累到足以誘導(dǎo)細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生。GSSG口服后也會(huì)自動(dòng)在腸和肝中還原為GSH，若作為由氨基酸制成的任何產(chǎn)物，該物質(zhì)可在胃腸道中被蛋白酶降解。
已知GSSG是用作治療患者的輔助飲食的營養(yǎng)補(bǔ)充劑中的一種成分29。但是，作為肽類物質(zhì)，大多數(shù)口服的GSSG在胃腸道中消化了，其余在腸和肝細(xì)胞中還原為GSH，可部分進(jìn)入循環(huán)的僅是還原型谷胱甘肽。因此，與大量其他化合物一起口服GSSG的主要目的29是促進(jìn)還原型谷胱甘肽(GSH)的血液和組織濃度的升高。
按照本發(fā)明，GSSG通過胃腸道釋放到有機(jī)體內(nèi)消除了其作為細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的激活劑/調(diào)節(jié)劑的活性的實(shí)現(xiàn)的可能性。因此，GSSG僅非腸道途徑給藥可保護(hù)谷胱甘肽在血液和其他體液中的氧化型狀態(tài)。另外，使用一些能延長GSSG在生物培養(yǎng)基中的半衰期的試劑對(duì)GSSG的多細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性的實(shí)現(xiàn)來說是重要的。
已知建議為醫(yī)用增加GSH的內(nèi)源性濃度以增加免疫力和治療毒血癥，中毒，糖尿病，心血管疾病，感染以及其他疾病31，32，33。文獻(xiàn)中顯示了GSH和GSSG的可能的功用。
據(jù)報(bào)道，外源GSH或其直接(g-谷氨酰基-半胱氨酸，n-乙酰-半胱氨酸，和n-乙酰-半胱氨酸-甘氨酸)或間接(2-氧噻唑烷-4-羧酸酯)生化前體，或它們的鹽和酯，在各種疾病的治療中用作藥劑和食物添加劑34，35，36，37，38。
據(jù)稱GSH還可用作癌癥化療中防止神經(jīng)毒性的化學(xué)保護(hù)劑39以及與抗腫瘤劑結(jié)合以增強(qiáng)它們的作用40。
不過，目前文獻(xiàn)中還沒有關(guān)于GSSG以其自身能力用來誘導(dǎo)細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的能力(單一物質(zhì))而作為藥物的報(bào)道。已知該物質(zhì)對(duì)人和動(dòng)物疾病即沒有醫(yī)療作用，也沒有用作治療疾病的藥劑。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種活性物質(zhì)，和所述物質(zhì)和/或其衍生物與其活性的增量劑和/或增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑的有益結(jié)合物，它們能在個(gè)體或需要其的患者體內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生。
本申請(qǐng)中所用的“需要其的患者”是指有一種或多種疾病表現(xiàn)的哺乳動(dòng)物例如人，家養(yǎng)動(dòng)物和家畜包括貓，狗，牛和馬，在這些疾病中刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子或造血因子(或兩種)產(chǎn)生將被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是有益的。本申請(qǐng)中所用的“治療劑”的含義包括含有GSSG的物質(zhì)或僅有GSSG的任何藥物劑型，它有治療腫瘤，感染，血液、免疫或其他疾病的作用。治療作用，正如將被進(jìn)一步確定的，是指對(duì)人和其他哺乳動(dòng)物有益的任何作用，包括治愈，預(yù)防，維持有益濃度，或是以與人和其他哺乳動(dòng)物體有關(guān)的任何有益的方式。
按照本發(fā)明，正是GSSG胃腸外給藥在健康和患病的個(gè)體或需要其的患者體內(nèi)誘導(dǎo)了內(nèi)源性細(xì)胞因子和/或造血因子的產(chǎn)生。
為了尋找細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)上可接受的誘導(dǎo)物，申請(qǐng)人進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)了先前已知的物質(zhì)氧化型谷胱甘肽(氧化型谷胱甘肽，二硫化谷胱甘肽，GSSG；下文中一般稱為GSSG)的新的性能。
當(dāng)胃腸外給藥或作用于分離細(xì)胞時(shí)，該物質(zhì)能在健康和患病的哺乳動(dòng)物(動(dòng)物和人)體內(nèi)誘導(dǎo)數(shù)種細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生。
內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)物或激活劑/調(diào)節(jié)劑是氧化型谷胱甘肽(GSSG)，它是具有g(shù)-谷氨?；?半胱氨酰-甘氨酸結(jié)構(gòu)的還原型谷胱甘肽的遮蔽物，其中兩個(gè)三肽分子經(jīng)半胱氨酸殘基間的共價(jià)二硫鍵結(jié)合。
按照本發(fā)明，提供了一種刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的方法，是通過在足夠長的時(shí)期內(nèi)向需要刺激細(xì)胞因子或造血因子或二者都需要的哺乳動(dòng)物體內(nèi)加入有效量的氧化型谷胱甘肽以刺激所述內(nèi)源性產(chǎn)生，從而達(dá)到治療效果。
谷胱甘肽優(yōu)選胃腸外或局部加入。在優(yōu)選的形式中，該方法是通過加入氧化型谷胱甘肽(GSSG)或其衍生物及半衰期的增量劑和/或增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行的，從而增強(qiáng)預(yù)期的刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的作用并在體內(nèi)產(chǎn)生治療作用。
GSSG衍生物優(yōu)選自GSSG分子通過與下列物質(zhì)共價(jià)結(jié)合而化學(xué)修飾的化合物半胱胺-(2-巰基乙胺)，硫辛酸(6，8-硫辛酸)，肌肽(b-丙氨酰-組氨酸)，腺苷(9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤)，甲硫氨酸(2-氨基-4-[甲硫基]丁酸)；也可使用在該處列出的氨基酸的D和L形式。
特別希望的衍生物是GSSG與半胱胺共價(jià)結(jié)合的(S-硫乙胺-二硫化谷胱甘肽)，或是與硫辛酸共價(jià)結(jié)合的(雙-[6，8-硫辛基]二硫化谷胱甘肽)，或是與肌肽共價(jià)結(jié)合的([b-丙氨酰-組氨酸]二硫化谷胱甘肽)，或是與腺苷共價(jià)結(jié)合的([9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤]二硫化谷胱甘肽)，或是與甲硫氨酸共價(jià)結(jié)合的(雙-[2-氨基-4-[甲硫基]丁酰]二硫化谷胱甘肽)，或其混合物，包括此處這些氨基酸的D和/或L形式。
增量劑優(yōu)選自下列成員藥學(xué)上可接受的助氧劑化合物(過氧化氫，抗壞血酸)，能形成使GSSG分子穩(wěn)定的弱離子鍵和配位鍵的化合物(二甲基亞砜)，或是作為通過谷胱甘肽還原酶催化將NADP-H-依賴性GSSG還原為GSH的競(jìng)爭(zhēng)劑物質(zhì)，能對(duì)葡糖-6-磷酸脫氫酶或其他NADP-H-依賴性酶催化的NADP+還原為NADP-H產(chǎn)生可逆抑制的化合物，或其混合物。
特別希望的增量劑是過氧化氫，肌苷，抗壞血酸，二甲基亞砜或胱胺，或其混合物。
增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑優(yōu)選自下列成員甲基供體(如膽堿-氯化物{[2-羥乙基]氯化三甲銨}或S-腺苷-甲硫氨酸)，胞內(nèi)氧還-氧化對(duì)的代表物(如硫辛酸/脫氫硫辛酸，葉酸/脫氫葉酸，抗壞血酸/脫氫抗壞血酸)。本文中所用的增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑或增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑是指從治療效果上說有益地增加或改變GSSG或其衍生物的治療作用，但不是GSSG半衰期的增量劑的物質(zhì)。
特別希望的增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑是膽堿-氯化物，S-腺苷-甲硫氨酸，硫辛(6，8-硫辛)酸和葉酸(蝶酰谷氨酸)。
在優(yōu)選的形式中，對(duì)GSSG基和其鹽來說，GSSG以0.01-0.5mgGSSG基/kg體重的劑量加入體內(nèi)，對(duì)GSSG衍生物來說是0.01-0.1mg，每24小時(shí)內(nèi)至少一次，盡管它可在每24小時(shí)期間內(nèi)以對(duì)GSSG基和其鹽來說0.01-0.5mg/kg體重的24小時(shí)總劑量，對(duì)GSSG衍生物來說0.01-0.1mg的劑量連續(xù)注射或加入體內(nèi)。優(yōu)選給藥和加入體內(nèi)進(jìn)行到得到了預(yù)期的使細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生增加的刺激作用并產(chǎn)生了治療作用為止。
按照本發(fā)明提供了治療腫瘤，感染，血液、免疫和其他疾病的治療劑，它包含有效量的氧化型谷胱甘肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑。優(yōu)選胃腸外使用的氧化型谷胱甘肽是在藥學(xué)上可接受的溶劑中，例如水溶液包括水，葡萄糖溶液，氯化鈉等滲溶液，緩沖鹽溶液。優(yōu)選通過增加氧化型谷胱甘肽的半衰期而能增強(qiáng)并延長治療作用的藥學(xué)上可接受的增量劑，或利用除增加GSSG半衰期以外的機(jī)制的藥學(xué)上可接受的GSSG活性增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑與GSSG一起使用。
申請(qǐng)人首次顯示外源GSSG或其鹽對(duì)哺乳動(dòng)物(人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)細(xì)胞的能誘導(dǎo)細(xì)胞因子和造血因子的即刻作用能刺激這些分子的合成和使它們?cè)谘?體內(nèi)條件)或培養(yǎng)基(來自體內(nèi)或體外條件)中的濃度增加。另外，GSSG或其鹽的使用確保了細(xì)胞因子信號(hào)的胞內(nèi)傳遞途徑的調(diào)節(jié)，并因此再現(xiàn)了這些細(xì)胞因子的作用。所提出的方法可以產(chǎn)生刺激細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生的作用，這一作用是通過將GSSG給予有機(jī)體或加入到培養(yǎng)基中，以及通過將GSSG與即能介導(dǎo)谷胱甘肽維持氧化形式的時(shí)間延長又能介導(dǎo)其活性的增強(qiáng)或有益調(diào)節(jié)的藥理學(xué)活性制劑結(jié)合給藥而得到的。申請(qǐng)人進(jìn)行的研究顯示GSSG及其制劑在各種實(shí)驗(yàn)和臨床病理學(xué)條件下具有治療作用。
所顯示的GSSG誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子在體內(nèi)產(chǎn)生的刺激導(dǎo)致了抗腫瘤、抗感染、造血、免疫調(diào)節(jié)和其他藥理學(xué)作用，并又對(duì)各種疾病產(chǎn)生了較多或較少程度的治療或預(yù)防作用。
與附圖相結(jié)合來閱讀下面的說明書將更好地理解本發(fā)明的上述以及其他目的、特性和優(yōu)點(diǎn)，附圖包括
圖1a，1b，1c和1d分別是細(xì)胞HL-60(空白或在本發(fā)明制劑存在下)的熒光流式細(xì)胞分析曲線圖，和人淋巴細(xì)胞(空白或在本發(fā)明制劑存在下)的熒光流式細(xì)胞分析曲線圖，如將在實(shí)施例4的討論中所描述的，是關(guān)于在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的制劑活性的研究；和圖2是GSSG的結(jié)構(gòu)圖，其中標(biāo)出了當(dāng)GSSG鹽和衍生物再現(xiàn)時(shí)用于化學(xué)修飾的部位；和圖3，4，5，6和7是與GSSG共價(jià)結(jié)合的化合物的圖與半胱胺結(jié)合的(S-硫乙胺-二硫化谷胱甘肽，圖3)；與硫辛酸結(jié)合的(雙-[6，8-硫辛基]二硫化谷胱甘肽，圖4)；與肌肽結(jié)合的([b-丙氨酰-組氨酸]二硫化谷胱甘肽，圖5)；與腺苷結(jié)合的([9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤]二硫化谷胱甘肽，圖6)；或與甲硫氨酸結(jié)合的(雙-[2-氨基-4-[甲硫基]丁酰]二硫化谷胱甘肽，圖7)。
按照本發(fā)明，所提出的用于治療腫瘤、感染、血液和其他疾病的藥劑，其中刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生，是合適的，具有有效量的GSSG和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物作為其活性組成部分。將該藥劑的藥物劑型制備成對(duì)于GSSG和其鹽來說含有0.01-2.0％GSSG基，或?qū)τ贕SSG衍生物來說含有0.01-4.0％的可注射溶液也是有利的。
按照本發(fā)明用作治療劑或藥劑的GSSG顯示于圖2中。GSSG和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物優(yōu)選在載體或溶液例如氯化鈉等滲溶液、葡萄糖溶液、其他緩沖液和鹽溶液中使用。任何含水或溶劑載體或溶劑都可使用，只要總?cè)芤夯蚍稚⒁号c機(jī)體相容且藥學(xué)上可接受，即它不會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生任何不希望的副作用或不希望的與GSSG和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物間的相互作用。
在圖2的結(jié)構(gòu)式中，點(diǎn)X1，X2，X3，X4，X5和X6是用于GSSG的化學(xué)修飾的部位。一般說來，GSSG和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物是以在溶液中的形式使用的，或者可以是任何其生理上和藥學(xué)上可接受的鹽。X1，X4是鈉離子或鋰離子或混合物的二鈉和二鋰鹽是優(yōu)選的溶解性最好的藥物。如果沒有使用其他取代基，X1，X2，X3和X4可各自為氫。也可使用GSSG的其他鹽，只要它們是藥學(xué)上可接受的，即不會(huì)對(duì)機(jī)體有副作用，例如X1，X2，X3和X4可以都是(或者它們中的一個(gè)或多個(gè)可以是)鉀，鈣，鋅，鉬，釩，氟化物，其混合物或者任何其他藥學(xué)上可接受的取代基。在本發(fā)明中優(yōu)選使用水溶性鹽。
在圖3的結(jié)構(gòu)式中，點(diǎn)X1(或者可能是X1，和X2)是標(biāo)記出的與半胱胺分子(2-巰基乙胺)共價(jià)結(jié)合的部位。在圖4的結(jié)構(gòu)式中，標(biāo)記出的點(diǎn)X5和X6是與硫辛酸(6，8-硫辛酸)分子共價(jià)結(jié)合的部位。在圖5的結(jié)構(gòu)式中，點(diǎn)X3是與肌肽(b-丙氨酰-組氨酸)分子共價(jià)結(jié)合的部位。在圖6的結(jié)構(gòu)式中，點(diǎn)X2是與腺苷(9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤)分子共價(jià)結(jié)合的部位。在圖7的結(jié)構(gòu)式中，點(diǎn)X5和X6是與甲硫氨酸(2-氨基-4-[甲硫基]丁酸)分子共價(jià)結(jié)合的部位。
按照本發(fā)明，有利的是使用這樣的GSSG或其衍生物藥物劑型和/或藥物組合物，它們或者可延長氧化型谷胱甘肽在組織和生物液體中的半衰期，或者可增加或有益地調(diào)節(jié)GSSG所顯示的生物和治療性能。
按照本發(fā)明，為了增加、有益調(diào)節(jié)和/或延長GSSG的治療作用，建議其藥物劑型(可注射溶液)含有如上所述(參見圖3-7)的GSSG和/或其衍生物，以及能延長GSSG和/或其衍生物的半衰期或增強(qiáng)/調(diào)節(jié)它們的生物和治療作用的藥學(xué)上可接受的成分(增量劑，增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑)。GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物可與上面提到的增量劑，增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑一起以單劑形式存在(事先制備好或臨時(shí)制備的單一可注射溶液)，或者是利用分開的藥物劑型釋放到體內(nèi)GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物和/或衍生物鹽的可注射溶液；和上面所提到的增量劑、增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑的任何藥學(xué)上可接受的藥物劑型、劑量組和給藥途徑。
關(guān)于藥學(xué)上可接受的GSSG的衍生物，可以應(yīng)用的是這些化合物或它們的藥學(xué)上可接受的鹽中的一個(gè)，其中GSSG與半胱胺共價(jià)結(jié)合(S-硫乙胺-二硫化谷胱甘肽，參見圖3結(jié)構(gòu)式)；或是與硫辛酸共價(jià)結(jié)合(雙-[6，8-硫辛基]二硫化谷胱甘肽，參見圖4)；或是與肌肽共價(jià)結(jié)合([b-丙氨酰-組氨酸]二硫化谷胱甘肽，參見圖5)；或是與腺苷共價(jià)結(jié)合([9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤]二硫化谷胱甘肽，參見圖6)；或是與甲硫氨酸共價(jià)結(jié)合(雙-[2-氨基-4-[甲硫基]丁酰]二硫化谷胱甘肽，參見圖7)。
這是因?yàn)樯鲜龇肿?半胱胺，硫辛酸，肌肽，腺苷，或甲硫氨酸)之一作為修飾的GSSG分子的一個(gè)組成部分而存在穩(wěn)定了相應(yīng)衍生物的結(jié)構(gòu)，使其更堅(jiān)固地對(duì)抗蛋白水解作用和/或向GSH的還原。穩(wěn)定GSSG，其鹽，或其衍生物/衍生物鹽的分子，和保護(hù)它們對(duì)抗蛋白水解作用和/或還原作用的另一種方式可通過將構(gòu)造GSSG和上述衍生物分子的L-氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)替換為D-形式來實(shí)現(xiàn)。
最優(yōu)選的所有藥學(xué)上可接受的GSSG或衍生物可以1.0％可注射溶液的形式用作藥劑，對(duì)于GSSG基和其鹽劑量范圍是0.01-0.5mg GSSG基/kg體重，對(duì)于GSSG衍生物劑量范圍是0.01-1.0mg，優(yōu)選濃度范圍是0.5％-5.0％，一天一次或多次，一天或多天快速或連續(xù)給藥，直到產(chǎn)生預(yù)期的治療作用。關(guān)于藥學(xué)上可接受的成分或延長谷胱甘肽維持氧化形式的增量劑，可以應(yīng)用0.003％過氧化氫和/或5.0％抗壞血酸。這是因?yàn)樵诨钚匝踔虚g體供體(即氧化劑)過氧化氫或抗壞血酸的存在下，GSSG被谷胱甘肽還原酶還原為GSH的速度較低，由此使外源性加入生物培養(yǎng)基中的GSSG的還原減慢。
過氧化氫的用量?jī)?yōu)選為所用溶液重量的0.03-0.0003％(1.0-5.0ml溶液，無論它們是否含有GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物/衍生物鹽)?？箟难岬挠昧?jī)?yōu)選為所用溶液重量的0.1-10％(1.0-10.0ml溶液，無論它們是否含有GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物/衍生物鹽)。
過氧化氫(H2O2)和/或抗壞血酸在用于胃腸外給藥的藥物劑型的配制中可接受的濃度的使用，以及任何其他助氧劑化合物(活性氧形式的供體)的使用，使得延長氧化型谷胱甘肽和/或其衍生物在生物液體和組織中的半衰期的可能的方法僅能實(shí)現(xiàn)一種，由此增強(qiáng)并延長GSSG和/或其衍生物的藥理學(xué)作用。
我們還發(fā)現(xiàn)了一些其他的能介導(dǎo)外源GSSG和/或其衍生物在生物培養(yǎng)基中還原為GSH過程延遲的藥學(xué)上可接受的成分或增量劑。它們特別是能形成使GSSG分子穩(wěn)定的弱離子和/或配位鍵的化合物，例如二甲基亞砜；能與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的還原型或NADP-H建立競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的因子，例如肌苷(和其他次黃嘌呤衍生物)；以及能可逆抑制NADP+的氧化型還原為DADPH過程的試劑，例如胱胺(2，2＇-二硫-雙[乙胺])和其他葡糖-6-磷酸-脫氫酶的抑制劑。
除了過氧化氫和抗壞血酸以外，其他藥理學(xué)上可接受的能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的成分之一可以是二甲基亞砜，它通過與GSSG的原子形成弱離子鍵和配位鍵而使GSSG或其衍生物分子穩(wěn)定。二甲基亞砜最優(yōu)選用7.0％(v/v)溶液，并優(yōu)選用0.1％-30％(體積)的溶液(當(dāng)應(yīng)用于表皮/通過滴注應(yīng)用時(shí)，溶液體積為1.0-30.0ml或更多，無論它們是否含有GSSG/GSSG鹽和/或其衍生物/衍生物鹽。
既然還原型NADP-H是催化GSSG還原為GSH的谷胱甘肽還原酶系統(tǒng)的關(guān)鍵輔因子，那么延遲GSSG還原或阻斷NADP-H被谷胱甘肽還原酶生物氧化的任何藥學(xué)上可接受的化合物或生物物理作用都將有利于阻止GSSG/GSSG鹽和/或其衍生物/衍生物鹽在生物培養(yǎng)基中的還原，并因此將增強(qiáng)和延長其治療作用。
根據(jù)所進(jìn)行的研究，我們首次發(fā)現(xiàn)當(dāng)GSSG與能與NADP-H競(jìng)爭(zhēng)的試劑結(jié)合使用時(shí)，以及與可逆抑制由葡糖-6-磷酸-脫氫酶催化的酶促反應(yīng)(該反應(yīng)介導(dǎo)NADP+氧化型的還原)的化合物結(jié)合使用時(shí)，GSSG的醫(yī)藥學(xué)作用將增強(qiáng)。可以使用葡萄糖氧化的戊糖磷酸途徑的可逆抑制劑。
因此，除了過氧化氫、抗壞血酸和二甲基亞砜以外，其他藥理學(xué)上可接受的能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的成分之一可以是肌苷(次黃嘌呤-9-D-呋喃核糖核苷)，其最優(yōu)選用0.1％的溶液，優(yōu)選用0.1％-5％(重量)的溶液(溶液為1.0-5.0ml，無論它們是否含有GSSG/GSSG鹽和/或其衍生物/衍生物鹽。
所進(jìn)行的研究顯示肌苷促進(jìn)了GSSG的生物和治療作用。已證明肌苷的這一性能是基于其與NADP-H競(jìng)爭(zhēng)的能力，并因此使GSSG延遲還原為GSH。另外，我們還發(fā)現(xiàn)其他次黃嘌呤衍生物(包括肌苷，核苷，次黃嘌呤核苷和其他肌苷的核苷衍生物)也具有這種性能。
除了過氧化氫、抗壞血酸、二甲基亞砜和肌苷外，胱胺(2，2＇-二硫-雙[乙胺])是另一種能使GSSG較慢還原的藥學(xué)上可接受的試劑，如果使用，最優(yōu)選用0.1％的溶液，優(yōu)選用0.1％-3％(重量)的溶液(例如溶液為1.0-5.0ml，無論它們是否含有GSSG/GSSG鹽和/或其衍生物/衍生物鹽)。
我們的研究顯示胱胺促進(jìn)了GSSG的生物和治療作用。該作用是由于胱胺能用作介導(dǎo)NADP+還原為NADP-H的戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵酶葡糖-6-磷酸-脫氫酶的可逆抑制劑。
關(guān)于能增強(qiáng)或有益調(diào)節(jié)GSSG和/或其衍生物的生物學(xué)和治療作用的藥學(xué)上可接受的成分，有幾組化合物顯示能增強(qiáng)、增加或有益改變GSSG和/或其衍生物的作用。因此有幾種GSSG/GSSG鹽和/或其衍生物/衍生物鹽的作用的增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑可指定為下面幾組化合物。
當(dāng)這些試劑用于治療免疫學(xué)和感染性實(shí)驗(yàn)病理學(xué)條件下的動(dòng)物時(shí)，甲基供體如膽堿-氯化物和S-腺苷-甲硫氨酸與GSSG(和/或其鹽/衍生物)結(jié)合使用與GSSG單獨(dú)(和/或其鹽/衍生物)相比表現(xiàn)得更有效。而且，已顯示膽堿-氯化物可以最優(yōu)選以10％的溶液用于患者，優(yōu)選1.0％-20％(重量)的溶液(1.0-5.0ml溶液，無論它們是否含有GSSG或其衍生物)。S-腺苷-甲硫氨酸可以最優(yōu)選5.0％的溶液用于患者，優(yōu)選用作1.0％-10％(重量)的溶液(1.0-5.0ml溶液，無論它們是否含有GSSG和/或其衍生物)。
還發(fā)現(xiàn)能形成胞內(nèi)氧還-氧化對(duì)的化合物(硫辛酸，葉酸和抗壞血酸)增強(qiáng)了GSSG/衍生物對(duì)免疫學(xué)、感染或其他疾病(糖尿病)的作用。硫辛酸可以最優(yōu)選0.5％的溶液用于患者，優(yōu)選0.1％-1.0％(重量)的溶液(1.0-5.0ml溶液，無論它們是否含有GSSG和/或其衍生物)。葉酸可以最優(yōu)選0.5％的溶液用于患者，優(yōu)選0.1％-1.0％(重量)的溶液(2.0-5.0ml溶液，無論它們是否含有GSSG和/或其衍生物)。
因此，本發(fā)明還提出了增強(qiáng)或有益調(diào)節(jié)GSSG刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的能力的方法，它必須使用包括GSSG和/或其衍生物和其他能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的成分(增量劑)或能增強(qiáng)/有益調(diào)節(jié)GSSG和/或其衍生物的生物學(xué)及治療作用的成分(增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑)的藥物組合物。GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物可與增量劑和增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑結(jié)合以單劑形式給藥，或者可利用任何結(jié)合使用的各組分的藥學(xué)上可接受的給藥途徑將其與增量劑和增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑分別釋放到體內(nèi)。這一點(diǎn)可以例如通過給予包括GSSG/GSSG鹽和/或GSSG衍生物/衍生物鹽的藥物劑型的藥學(xué)上可接受的組合物；和包括其他能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的產(chǎn)物(增量劑)，和/或能增強(qiáng)/有益調(diào)節(jié)GSSG/GSSG鹽和/或GSSG衍生物/衍生物鹽的治療作用的產(chǎn)物的藥物劑型的藥學(xué)上可接受的組合物實(shí)現(xiàn)。本文中所用的術(shù)語“GSSG衍生物”是指S-硫乙胺-二硫化谷胱甘肽，或是雙-[6，8-硫辛基]二硫化谷胱甘肽，或是[b-丙氨酰-組氨酸]二硫化谷胱甘肽，或是[9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤]二硫化谷胱甘肽，或是雙-[2-氨基-4-[甲硫基]丁酰]二硫化谷胱甘肽，構(gòu)成GSSG分子的一個(gè)或多個(gè)L-氨基酸被其D-型取代并以相同劑量范圍給藥(0.01-1.0mg/kg)。
本文中所用的術(shù)語“增量劑”是指優(yōu)選0.003％的過氧化氫，優(yōu)選5.0％的抗壞血酸或其他具有氧化劑活性的化合物；優(yōu)選7.0％的二甲基亞砜，或其他能形成使GSSG分子穩(wěn)定的弱離子和/或配位鍵的化合物；優(yōu)選0.1％的肌苷(次黃嘌呤-9-D-呋喃核糖核苷)，或其衍生物包括肌苷核苷；和優(yōu)選0.1％的胱胺(2，2＇-二硫-雙[乙胺]，或其他能對(duì)戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵酶葡糖-6-磷酸-脫氫酶產(chǎn)生可逆抑制的化合物。
本文中所用的術(shù)語“增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑”或“增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑”是指優(yōu)選10％的膽堿-氯化物，優(yōu)選5.0％的S-腺苷-甲硫氨酸或其他藥學(xué)上可接受的甲基供體；優(yōu)選0.5％的硫辛酸；優(yōu)選0.5％的葉酸或其他能形成胞內(nèi)氧還-氧化對(duì)的化合物。在本申請(qǐng)中所提到的任何其他能增強(qiáng)和/或有益調(diào)節(jié)GSSG/衍生物的任何生物學(xué)或治療作用的化合物或物理影響也看做是“增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑”。
本文中所用的術(shù)語“表皮地/通過滴注”是指當(dāng)有治療/藥劑應(yīng)用于皮膚表面或表面粘膜(表皮，或皮膚，或表面的，或局部使用)時(shí)，或當(dāng)有腔內(nèi)療法/藥劑通過加入天然和/或人工體腔(或其中的空隙)如胃、膀胱、陰道、直腸、腹腔或胸膜腔，關(guān)節(jié)內(nèi)空隙，氣道，上頜骨竇等，或任何病理學(xué)和/或創(chuàng)傷性腔中而使用時(shí)，任何生理和/或醫(yī)學(xué)上可接受的給藥途徑。
我們發(fā)現(xiàn)GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物與增量劑或增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑結(jié)合經(jīng)胃腸外給藥(靜脈給藥，腹腔給藥，肌內(nèi)給藥等)刺激了內(nèi)源性產(chǎn)生TNF-a，IFN-a和IFN-g，IL-1，IL-2，IL-6，IL-10，G-CSF，集落刺激因子，紅細(xì)胞生成素，和GM-CSF，和/或以比單獨(dú)應(yīng)用GSSG和/或其鹽，和/或其衍生物更大的程度再現(xiàn)了它們?cè)趯?shí)驗(yàn)動(dòng)物的有機(jī)體中的作用。GSSG和/或其衍生物以及任何增量劑或增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑可利用單劑形式給藥，也可利用所用任何組合的每一組分的不同的藥學(xué)上可接受的劑型(以及劑量組和給藥途徑)給藥。
所進(jìn)行的研究證明了上述化合物增強(qiáng)和/或有益改變GSSG和/或鹽和/或衍生物的生物學(xué)及治療作用的能力，這顯然使得它們與GSSG和/或鹽和/或衍生物的結(jié)合使用是便利的，用來治療腫瘤、感染、血液以及其他疾病，在這些疾病的治療中刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是有益的。
因此，按照本發(fā)明，為了增強(qiáng)并延長GSSG的治療作用，優(yōu)選GSSG或其鹽或衍生物/衍生物鹽的最終藥物制劑(1-5ml注射用溶液)應(yīng)含有其他藥學(xué)上可接受的能延長GSSG、鹽或衍生物在生物培養(yǎng)基中的半衰期或能增強(qiáng)/有益調(diào)節(jié)它們的生物學(xué)或治療作用的成分。任何所提出的藥學(xué)上可接受的成分還可利用任何其他藥學(xué)上可接受的劑型以及劑量組和給藥途徑與GSSG和/或其衍生物分別給藥。
非GSSG和其衍生物的這些藥學(xué)上可接受的成分，它們用于治療人時(shí)最優(yōu)選的濃度和劑量可以是a)0.003％的過氧化氫，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是0.03-0.0003％(重量)，劑量范圍是1.0-5.0ml以上；5.0％的抗壞血酸，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是0.1-10％(重量)，劑量范圍是1.0-10.0ml以上；或任何其他具有活性氧中間體供體活性的藥學(xué)上可接受的助氧劑化合物；b)7.0％(v/v)的二甲基亞砜，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是0.1-30％(體積)，劑量范圍是1.0-30.0ml以上；任何其他能通過與GSSG的原子形成弱離子和配位鍵而使GSSG或其衍生物分子穩(wěn)定的藥學(xué)上可接受的化合物；c)0.1％的肌苷(次黃嘌呤-9-呋喃核糖核苷)，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是0.1-5.0％(重量)，劑量范圍是1.0-5.0ml以上；任何其他由谷胱甘肽還原酶催化的GSSG向GSH的NADP-H依賴性還原的藥學(xué)上可接受的競(jìng)爭(zhēng)劑；d)0.1％的胱胺(2，2＇-二硫-雙[乙胺])，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是0.1-3.0％(重量)，劑量范圍是1.0-5.0ml以上；任何其他能對(duì)由葡糖-6-磷酸-脫氫酶或其他NADP依賴性酶催化的DNDP+向NADP-H的還原產(chǎn)生可逆抑制的藥學(xué)上可接受的化合物。
e)10％的膽堿-氯化物，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是1.0-20％(重量)，劑量范圍是1.0-5.0ml以上；
5.0％的S-腺苷-甲硫氨酸，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是1.0-10％(重量)，劑量范圍是1.0-5.0ml以上；任何其他能作為甲基供體的藥學(xué)上可接受的化合物；f)0.5％的硫辛酸，當(dāng)經(jīng)表皮或通過滴注給藥時(shí)，可接受的濃度范圍是0.1-1.0％(重量)，劑量范圍是1.0-5.0ml以上；任何其他能形成胞內(nèi)氧還-氧化對(duì)的藥學(xué)上可接受的化合物。
同時(shí)得到了數(shù)據(jù)來證明GSSG，GSSG鹽或GSSG衍生物單獨(dú)給藥或與能延長氧化型谷胱甘肽在生物培養(yǎng)基中的半衰期或能增強(qiáng)/調(diào)節(jié)其作用的藥學(xué)上可接受的化合物結(jié)合給藥的直接抗腫瘤作用。另外，GSSG或GSSG衍生物對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞的作用被證明是不同的。我們利用正常和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的體外研究顯示單獨(dú)的GSSG或其衍生物，或它們的含有增量劑和/或增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑的藥學(xué)上可接受的結(jié)合物以編程性細(xì)胞死亡樣方式激發(fā)了腫瘤細(xì)胞的死亡。在正常細(xì)胞的情況下，它們沒有受到破壞。因此，這些發(fā)現(xiàn)反映了GSSG和其鹽或衍生物的雙功能方式的作用(特別是與肌苷結(jié)合時(shí))在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的活化，和正常細(xì)胞的增殖與分化的刺激。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供治療腫瘤，感染，血液和其他疾病的方法，其中刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生是有利的。該方法包含GSSG和/或其衍生物作為藥劑以可注射的藥物劑型胃腸外給藥，給藥量為0.01-0.5mg GSSG基/kg體重，或?qū)τ贕SSG衍生物來說為0.01-1.0mg/kg，一天一次或多次，一日或多日快速或連續(xù)給藥直到已得到預(yù)期的治療作用。作為藥劑的GSSG或其藥物劑型和/或藥物組合物必需嚴(yán)格地胃腸外給藥以便防止或?qū)⑵淇诜o藥后在胃腸道中發(fā)生的調(diào)節(jié)或還原(為GSH)作用將至最小。不過，所提出的任何藥學(xué)上可接受的成分如增量劑，增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑也可利用任何其他藥學(xué)上可接受的劑型以及劑量組和給藥途徑與GSSG和/或其衍生物分開給藥。若這樣，有或沒有增量劑和/或增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑的GSSG和/或其衍生物也可以與胃腸外給藥一致的劑量局部應(yīng)用到機(jī)體，例如0.01-0.5mg GSSG基/m2所治療的皮膚或機(jī)體的局部區(qū)域(對(duì)于GSSG衍生物來說是0.01-1.0mg/m2)。
若將GSSG或其衍生物分子保護(hù)起來使其免受蛋白酶解和/或還原為GSH的作用，該試劑口服和/或病灶內(nèi)(原位) (創(chuàng)傷，腫瘤等)給藥將是有利的。
下面所給出的實(shí)施例證明GSSG和/或其衍生物的胃腸外使用(腹腔、靜脈、肌內(nèi)、皮下給藥等)誘導(dǎo)了特別是TNF-a，IFN-a和IFN-g，IL-1，IL-2，IL-6，IL-10，紅細(xì)胞生成素，和GM-CSF在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性產(chǎn)生，這對(duì)患有腫瘤或傳染病，血細(xì)胞生成和不同起因的免疫抑制，和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生將是有益的疾病的動(dòng)物和人產(chǎn)生了顯著的治療作用。
從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)(參見實(shí)施例)以前不知道的GSSG能誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生并對(duì)各種疾病發(fā)揮有益作用的能力與GSH濃度的增加無關(guān)，因?yàn)樵谳^寬劑量和濃度范圍內(nèi)的GSH實(shí)驗(yàn)沒有顯示出對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生的刺激和/或調(diào)節(jié)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了以前不知道的GSSG(特別是與肌苷結(jié)合時(shí))在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中激發(fā)編程性細(xì)胞死亡的能力，這可解釋GSSG、其鹽和衍生物的藥劑在癌癥患者的治療中的治療作用。GSSG、其鹽和衍生物的這種獨(dú)特作用與GSH含量的增加無關(guān)，因?yàn)槭褂酶鞣N劑量的GSH和/或其與增量劑/有益調(diào)節(jié)劑的結(jié)合物都沒有產(chǎn)生對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。
GSSG可以與不會(huì)在機(jī)體中引起不希望的相互作用的其他藥劑一起使用。例如用已知的藥物如鋰、布洛芬、氨茶堿、抗生素、AZT、鈣阻斷劑、他莫昔芬、激素、干擾素以及其他藥物進(jìn)行治療的患者可以同時(shí)用GSSG進(jìn)行治療。
本文中所用的術(shù)語“治療作用”是指按照本發(fā)明方法進(jìn)行治療的患者或動(dòng)物的病情的任何改善，包括得到防止或預(yù)防作用，或疾病及其后遺癥的體征和癥狀的嚴(yán)重程度的任何緩解，包括由其他治療方法引起的那些(例如化學(xué)和X射線療法)，它們可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用體檢、實(shí)驗(yàn)室或儀器法進(jìn)行檢測(cè)并認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和/或臨床上顯著。
本文中所用的術(shù)語“預(yù)防作用”是指防止用按照本發(fā)明方法進(jìn)行治療的患者的病情任何惡化，以及防止疾病及其后遺癥的體征和癥狀的嚴(yán)重程度的任何惡化，包括由其他治療方法引起的那些(例如化學(xué)和X射線療法)，它們可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用體檢、實(shí)驗(yàn)室或儀器法進(jìn)行檢測(cè)并認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和/或臨床上顯著。
本文中所用的術(shù)語“腫瘤和傳染病”、“血細(xì)胞生成和各種起因的免疫抑制”以及“其他疾病”是指任何腫瘤和傳染病，任何由紅血球或骨髓抑制引起或伴隨的病情，或定量或功能性免疫參數(shù)的下降，以及任何其他疾病或病理情況，其中刺激和/或調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞因子和/或造血因子包括但不限于TNFa，IFNa，和IFNg，IL-1，IL-2，Il-6，IL-10，紅細(xì)胞生成素和GM-CSF的產(chǎn)生將被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是有益的。對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激和僅激活轉(zhuǎn)化細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的獨(dú)特能力可解釋GSSG、其鹽和衍生物在治療癌癥患者中的有益作用。另外，可以說GSSG和其劑型在實(shí)驗(yàn)和臨床環(huán)境中顯示出的多數(shù)治療作用與以前不知道的GSSG和其劑型能刺激和/或調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞產(chǎn)生，或當(dāng)刺激正常細(xì)胞的增殖和分化時(shí)可再現(xiàn)它們的作用，以及同時(shí)專門激活轉(zhuǎn)化細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的性能有關(guān)。
下面所給出的非限制性實(shí)施例證明了本發(fā)明的可行性。
活性成分，能刺激和/或調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生，以及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的GSSG肽可以利用常規(guī)肽合成技術(shù)得到41。
隨后將由此得到的肽(GSSG)作為GSSG基，或作為藥學(xué)上可接受的GSSG鹽，或作為藥學(xué)上就接受的GSSG衍生物，以可注射的藥物劑型用于動(dòng)物和人(體內(nèi))，這些藥物劑型是通過將主體物質(zhì)溶于可注射用水，或溶于任何藥學(xué)上可接受的溶劑而制得的，所得活性化合物的濃度對(duì)于GSSG和其鹽來說，以GSSG基計(jì)為0.01-2.0％(重量)(對(duì)于GSSG衍生物來說為0.01-4.0％重量)。
用于體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，GSSG或其衍生物可以溶于生物學(xué)上可接受的溶劑如培養(yǎng)基，等滲鹽溶液，葡萄糖溶液等。盡管也可使用生理以及其他載體或溶劑，但優(yōu)選使用含水載體或溶劑。對(duì)于局部應(yīng)用來說，也可使用有機(jī)溶劑或載體，以油膏、糊劑、乳劑或栓劑的形式應(yīng)用于有機(jī)體上的孔。
用于人和動(dòng)物的藥物劑型應(yīng)在無菌和無熱原的條件下制備，同時(shí)盡一切努力防止化學(xué)或細(xì)菌污染，從而提供無菌、無熱原的治療劑或藥物劑型。
GSSG或其衍生物的可注射的藥物劑型已進(jìn)行了動(dòng)物研究和小規(guī)模人體試驗(yàn)測(cè)試。
使用GSSG在可注射用水(或在生理鹽水，或在0.003％過氧化氫，或在0.1％胱胺)中的鈉鹽溶液(10.0％，100mg/mL)的可達(dá)到的最大濃度，和對(duì)小鼠給藥的最大耐受體積腹腔(IP，2.0mL)，靜脈(IV，0.5mL)，和肌內(nèi)(IM，0.05mL)，使得要達(dá)到GSSG劑量濃度5000mg/kg(IP)，1350mg/kg(IV)，和135mg/kg(IM)是可行的，即分別是推薦的最大人體用量0.5mg/kg的1000、270和27倍。沒有觀察到動(dòng)物死亡或任何毒性體征的情況，表明可注射藥物劑型的GSSG是無毒的。
GSSG，以及其有或沒有0.003％過氧化氫、或0.1％肌苷、或0.1％胱胺的藥物劑型的生物學(xué)、藥理學(xué)和治療性能的非臨床評(píng)估結(jié)果見實(shí)施例#1-8。實(shí)施例#1GSSG及其藥物劑型對(duì)體外人外周血單核白細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響用人外周血單核白細(xì)胞在體外評(píng)定氧化型谷胱甘肽(GSSG)及其含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥物劑型對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用。
加入測(cè)試物質(zhì)后立即向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入促分裂原，伴刀豆球蛋白A(ConA)以觸發(fā)白細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在細(xì)胞接觸ConA和測(cè)試品的24小時(shí)內(nèi)，從培養(yǎng)基上清液取樣并儲(chǔ)存于-70℃直到進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定。
為了評(píng)定在測(cè)試品的存在下在每種濃度水平，細(xì)胞的功能狀況和它們相對(duì)于促分裂原的容量，將含有相同濃度測(cè)試品的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)基從開始同時(shí)加入ConA和測(cè)試物質(zhì)后培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前16小時(shí)，加入3H-胸苷，結(jié)合到DNA中的標(biāo)記率被解釋為細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng)功能狀態(tài)的判據(jù)。
采集男性健康志愿者的靜脈血加入到肝素化塑料管中(內(nèi)毒素測(cè)試的)。以菲可和泛影酸鈉(Histopaque-1070；Sigma)的密度梯度通過離心分離出PMNL部分。
將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×106/mL“完全”培養(yǎng)基(RPMI 1640，Sigma)，該培養(yǎng)基含有HEPES(20mM)；L-谷氨酸(2mM)；慶大霉素(50mg/mL)；胎牛血清(10％)。所用的所有試劑是“細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試”級(jí)的，Sigma。利用臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定細(xì)胞的生存力并將100mL細(xì)胞懸液(200,000細(xì)胞)加入到平底96孔無菌微量滴定板的各孔中用于組織培養(yǎng)物。將各受試者的細(xì)胞加入到不少于39孔中。
對(duì)五種下列終濃度的測(cè)試品(GSSG，以及其含有0.003％H2O2，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥物劑型)進(jìn)行評(píng)估5000mg/mL；500mg/mL；50mg/mL；5mg/mL；和0.5mg/mL。每種濃度用至少6孔通過加入50mL含有合適量的預(yù)先溶解的測(cè)試品的“完全”培養(yǎng)基進(jìn)行確定。另6孔用于對(duì)照培養(yǎng)基并且不含GSSG加入50mL“完全”培養(yǎng)基，或相應(yīng)的含有0.003％H2O2，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的“完全”培養(yǎng)基。
當(dāng)測(cè)試品加入到培養(yǎng)基中后，立即將50mL含有對(duì)終濃度4.0mg/mL來說所需量的ConA(Sigma，細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的)的“完全”培養(yǎng)基加入到各組除了3個(gè)孔外的所有孔中，這3個(gè)孔用于自發(fā)的3H-胸苷攝取的評(píng)定(沒有ConA)。
在37℃和5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)后，將3個(gè)孔(來自每六個(gè)一組的相同孔)的內(nèi)容物取出，離心，并將上清液冷凍，保持在-70℃下，直到用于細(xì)胞因子測(cè)定。將在(每六個(gè)一組的)另3個(gè)孔中的培養(yǎng)物在上述條件下進(jìn)一步培養(yǎng)。
培養(yǎng)開始56小時(shí)后，向所有剩余培養(yǎng)物中加入1.0mCi的3H-胸苷，將這些板再培養(yǎng)16小時(shí)，然后收獲各孔的內(nèi)容物并轉(zhuǎn)移到玻璃纖維濾紙上，隨后用5％三氯乙酸和乙醇處理。將該濾紙干燥，利用液體閃爍計(jì)數(shù)儀Betaplate 1205(LKB)測(cè)定它們的放射性(每分鐘數(shù)量，cpm)。
用三份相同培養(yǎng)物的平均放射性值來計(jì)算促細(xì)胞分裂原刺激的指數(shù)ConA刺激的培養(yǎng)物的平均cpm值與未刺激的培養(yǎng)物(沒有ConA的三個(gè)孔)的平均cpm值的比例。用存在各種濃度測(cè)試品的孔中的刺激指數(shù)作為細(xì)胞功能狀態(tài)和細(xì)胞對(duì)促細(xì)胞分裂原刺激的響應(yīng)能力的判據(jù)。
隨后用一式三份的24小時(shí)培養(yǎng)物的上清液來測(cè)定細(xì)胞因子含量，條件是它們對(duì)應(yīng)的72小時(shí)對(duì)照培養(yǎng)物二或三份顯示的對(duì)ConA產(chǎn)生促細(xì)胞分裂的響應(yīng)，刺激指數(shù)值在15-50的范圍內(nèi)。
白細(xì)胞介素-1b(IL-1b)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子a(TNFa)和干擾素a(IFNa)的濃度通過ELISA利用商品試劑組(Medgenix，Belgium)進(jìn)行測(cè)定并表示為pg/mL培養(yǎng)物上清液。
表1-4中給出了這些突出的發(fā)現(xiàn)。從表1和2中可看出，向培養(yǎng)基中加入GSSG對(duì)人單核白細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的和劑量依賴性刺激作用。另外，過氧化氫的存在使得IL-6和TNF-a的對(duì)照濃度(沒有GSSG)增加。除此以外，與過氧化氫結(jié)合使用使得GSSG對(duì)研究中細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮了更顯著(1.5-2倍)的刺激作用對(duì)于IL-1b，在5.0-5000mg/mL濃度水平；對(duì)于IL-6和TNF-a，在整個(gè)濃度范圍；對(duì)于IFN-a，在500和5000mg/mL。
GSSG在0.1％肌苷溶液和0.1％胱胺溶液中的應(yīng)用使細(xì)胞因子的產(chǎn)生有顯著的和劑量依賴性的增加，特別是對(duì)于IL-6和TNF-a(表3和4)。
因此，GSSG對(duì)體外人外周血單核白細(xì)胞的作用表現(xiàn)為顯著刺激了細(xì)胞因子釋放到培養(yǎng)基中，由此確證了GSSG對(duì)人血細(xì)胞的天然產(chǎn)生細(xì)胞因子能力的刺激作用。GSSG與過氧化氫、肌苷，以及胱胺結(jié)合使用對(duì)誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生有更顯著的作用。實(shí)施例#2GSSG及其藥物劑型對(duì)細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生以及對(duì)血細(xì)胞生成和環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的血液和免疫抑制中的免疫參數(shù)的影響用通過環(huán)磷酰胺(CP)單獨(dú)給藥而誘導(dǎo)的血液和免疫抑制的小鼠模型來評(píng)定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)以及含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥物劑型。
該研究設(shè)計(jì)用來評(píng)定測(cè)試品給藥5天對(duì)體外CP處理的鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF的能力的作用。另外，在CP給藥后8天測(cè)定血液白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量以及骨髓細(xì)胞構(gòu)成(有核細(xì)胞數(shù))。然后一些接受CP的動(dòng)物用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)進(jìn)行激發(fā)，評(píng)定響應(yīng)抗原的體液免疫。
給雄性CBA鼠(體重18-20克)單一腹腔注射劑量為50mg/kg的CP。動(dòng)物分成5組(每組不少于15只鼠)。各組含義如下所示對(duì)照組·#1-單一注射生理鹽水(NS)而不是CP的整體動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用測(cè)試品賦形劑(生理鹽水)處理；
·#2-接受單一CP注射的空白動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用測(cè)試品賦形劑(生理鹽水)處理；·#3-接受單一CP注射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的對(duì)照品(溶于生理鹽水的GSH)處理；測(cè)試組·#4-接受單一CP注射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品(溶于生理鹽水的GSSG)處理；·#5-接受單一CP注射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.003％H2O2的生理鹽水)處理；·#6-接受單一CP注射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#7-接受單一CP注射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；CP注射后24小時(shí)，將每組的5只動(dòng)物用SRBC進(jìn)行免疫接種(0.5mLNS中107個(gè)細(xì)胞，腹腔注射)。
CP注射后第3天(免疫接種后24小時(shí))開始腹腔注射測(cè)試或?qū)φ掌?如上所述的)。注射在5天內(nèi)完成每天，一天一次。
5天的處理過程結(jié)束后24小時(shí)(CP注射后第8天)，將小鼠處死并無菌制備脾細(xì)胞培養(yǎng)物用于評(píng)定體外脾淋巴細(xì)胞中IL-2和GM-CSF的自發(fā)產(chǎn)生。
同時(shí)采集血液和骨髓樣品用于血液白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，以及骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。
測(cè)定免疫接種的動(dòng)物的血清樣品的SRBC凝集素的濃度(CP注射后第8天，和免疫接種后第7天)。
表#5顯示了脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF的參數(shù)，骨髓和血細(xì)胞指數(shù)，以及接受測(cè)試品的小鼠中以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的血液和免疫抑制為背景的對(duì)綿羊紅細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
從數(shù)據(jù)可看出GSSG以及GSSG在過氧化氫中的溶液的使用使脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2和GM-CSF幾乎恢復(fù)到正常，而GSH沒有顯示出這樣的作用。而且GSSG及其過氧化氫溶液發(fā)揮了顯著的對(duì)骨髓和血液參數(shù)以及對(duì)SRBC的免疫應(yīng)答的促恢復(fù)作用。
表#6和7給出的數(shù)據(jù)是關(guān)于含有GSSG(與0.1％肌苷，或0.1％胱胺結(jié)合)的藥理學(xué)活性組合物對(duì)CP誘導(dǎo)的血液和免疫抑制的小鼠所測(cè)試的參數(shù)變量的作用。結(jié)果表明相對(duì)于IL-2b和GM-CSF產(chǎn)生的刺激和骨髓和血液細(xì)胞構(gòu)成的恢復(fù)來說，肌苷和胱胺成分顯著增強(qiáng)了GSSG作用。正如可看到的那樣，GSH沒有顯示出這樣的刺激作用。最大刺激是GSSG和0.1％肌苷的結(jié)合物達(dá)到的。
因此，本發(fā)明方法在CP誘導(dǎo)的血液和免疫抑制動(dòng)物中的使用顯著刺激了IL-2和GM-CSF的內(nèi)源性產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)了骨髓和血液細(xì)胞指數(shù)以及對(duì)綿羊紅細(xì)胞的免疫應(yīng)答的恢復(fù)。實(shí)施例#3GSSG及其藥物劑型對(duì)細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生以及對(duì)血細(xì)胞生成和輻射導(dǎo)致的血液和免疫抑制中的免疫參數(shù)的影響用1Gy的總劑量單一照射而誘導(dǎo)的血液和免疫抑制的小鼠模型來評(píng)定氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)以及含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的GSSG的藥物劑型。
該研究設(shè)計(jì)用來評(píng)定測(cè)試品每天給藥共7天(照射后2小時(shí)開始給藥)對(duì)受到照射的小鼠的脾細(xì)胞體外產(chǎn)生IL-2和GM-CSF的能力的作用。另外，在照射后第8天測(cè)定血液白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量和脾及骨髓細(xì)胞構(gòu)成(有核細(xì)胞數(shù))，以及脾和骨髓的集落刺激能力。
雄性CBA鼠(體重18-20克)用經(jīng)0.5mm Cu過濾的單劑量為180kV的X射線進(jìn)行照射(15mA，距離70cm，持續(xù)時(shí)間2分鐘和28秒)?？偟奈談┝考s1Gy。
動(dòng)物分成5組(每組不少于12只鼠)。各組含義如下所示對(duì)照組·#1-接受假照射過程以再現(xiàn)應(yīng)激效果的整體動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用測(cè)試品賦形劑(生理鹽水)處理；·#2-以1Gy劑量照射的空白動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用測(cè)試品賦形劑(生理鹽水)處理；
·#3-以1Gy劑量照射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的對(duì)照品(溶于生理鹽水的GSH)處理；測(cè)試組·#4-以1Gy劑量照射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品(溶于生理鹽水的GSSG)處理；·#5-以1Gy劑量照射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.003％H2O2的生理鹽水)處理；·#6-以1Gy劑量照射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#7-以1Gy劑量照射的動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；照射后2小時(shí)開始腹腔注射測(cè)試或?qū)φ掌?如上所述的)。注射在7天內(nèi)完成每天，一天一次。
7天的處理過程結(jié)束后24小時(shí)(照射后第8天)，將小鼠處死并無菌制備脾細(xì)胞培養(yǎng)物用于評(píng)定體外脾細(xì)胞中IL-2和GM-CSF的自發(fā)產(chǎn)生。
同時(shí)采集血液、脾和骨髓樣品用于血液白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，以及脾和骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。
另外，通過對(duì)靜脈接受從對(duì)照或測(cè)試組的動(dòng)物得到的脾或骨髓細(xì)胞的經(jīng)照射的CBA小鼠的脾中的集落形成單位(CFU)進(jìn)行直接計(jì)數(shù)的方法來評(píng)定脾和骨髓細(xì)胞的造血集落形成能力。
表8，9，10中概括了照射后8天經(jīng)照射的動(dòng)物的脾細(xì)胞的IL-2和GM-CSF濃度，血液、骨髓和脾細(xì)胞指數(shù)，以及骨髓和脾中的集落刺激容量數(shù)(集落形成單位，CFU)。
從表中的數(shù)據(jù)可明顯看出，給予GSSG，或其含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥物劑型使得脾細(xì)胞中IL-2和GM-CSF的產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地恢復(fù)，而GSH沒有產(chǎn)生顯著作用。
另外，單獨(dú)的GSSG和其藥理學(xué)活性組合物對(duì)血液、脾和骨髓細(xì)胞構(gòu)成發(fā)揮了顯著的正常化作用。在幾種情況下發(fā)現(xiàn)溶于過氧化氫的GSSG的作用是更顯著的。例如，當(dāng)GSSG本身對(duì)IL-2的脾細(xì)胞產(chǎn)生，血液白細(xì)胞，骨髓細(xì)胞構(gòu)成和骨髓集落沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著作用時(shí)(與對(duì)照組比較)，溶于過氧化氫的GSSG產(chǎn)生了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的作用。如果與過氧化氫對(duì)比，肌苷和胱胺能更顯著地增強(qiáng)GSSG的作用，最大作用是在GSSG與肌苷的活性組合物情況下得到的。
因此，本發(fā)明方法在輻射誘導(dǎo)的血液和免疫抑制動(dòng)物中的使用顯著刺激了IL-2和GM-CSF的內(nèi)源性產(chǎn)生，并促進(jìn)了血液、淋巴和造血器官的細(xì)胞組成的恢復(fù)以及骨髓和脾的集落形成活性。實(shí)施例#4GSSG及其藥物劑型對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞的增殖和編程性細(xì)胞死亡進(jìn)程的影響利用正?；蚰[瘤細(xì)胞來評(píng)定氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及其含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥物劑型影響細(xì)胞增殖和/或進(jìn)程的能力。為此，用骨髓細(xì)胞系HL-60細(xì)胞和從健康志愿者的外周血分離出的正常人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)GSSG或其藥物劑型24小時(shí)。隨后利用下述細(xì)胞熒光測(cè)定技術(shù)來評(píng)定細(xì)胞循環(huán)參數(shù)。
將健康志愿者的靜脈血采集到已進(jìn)行了內(nèi)毒素測(cè)試的肝素化試管中。以菲可-metrizoat(Histopaque，Sigma)的梯度離心得到血液白細(xì)胞的單核部分。將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×106細(xì)胞/mL“完全”細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI1640)，該培養(yǎng)基含有20mM HEPES，2mM谷氨酸，50mg/mL慶大霉素和10％胎牛血清。利用臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定細(xì)胞的生存力，然后將該細(xì)胞懸液加入到96孔微量滴定板的各孔中-每孔200,000個(gè)細(xì)胞。
HL-60細(xì)胞在加有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)在封閉燒瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為12mL，每4天通過離心更換一次。細(xì)胞生長的性質(zhì)是懸浮。GSSG的測(cè)試溶液(5000mg/mL)，以及含有0.003％過氧化氫，或0.1％胱胺的GSSG溶液的評(píng)定是每種測(cè)試溶液利用正常淋巴細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的6份細(xì)胞樣品進(jìn)行的。
將每種測(cè)試溶液各50mL加入某一細(xì)胞培養(yǎng)基中，之后細(xì)胞培養(yǎng)24-96小時(shí)。然后利用流動(dòng)細(xì)胞熒光測(cè)試法進(jìn)行測(cè)試以測(cè)定細(xì)胞核中DNA的含量。在編程性細(xì)胞死亡樣的細(xì)胞死亡情況下，DNA含量正常的細(xì)胞核部分變小了，而含有異常小量DNA的細(xì)胞核部分變大了。
分析過程如下培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞離心并轉(zhuǎn)移到pH7.4的含有RNA酶A(20mg/mL)、溴化乙錠(雙鏈核酸的熒光指示劑，10mg/mL)和MgCl2(5mM)的標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽等滲緩沖液中。之后細(xì)胞用非離子型去污劑Triton X-100進(jìn)行離解(終濃度0.1％)。由此得到的細(xì)胞核懸液用流動(dòng)細(xì)胞熒光測(cè)定法以氬激光作為光源(波長488nm)進(jìn)行分析。用DNA與溴化乙錠結(jié)合產(chǎn)生的紅色熒光來測(cè)量細(xì)胞核中的DNA含量。另外，用相應(yīng)的樣品進(jìn)行顯微研究以顯示細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面產(chǎn)生的變化。
研究結(jié)果見表11，12和圖1)。表11顯示GSSG或其藥物劑型的存在促進(jìn)了健康志愿者正常淋巴細(xì)胞的增殖，這使得它們的數(shù)量增加，而流動(dòng)細(xì)胞熒光測(cè)定分析對(duì)編程性細(xì)胞死亡樣細(xì)胞死亡的特征沒有顯示出任何改變(圖1c-d)。
對(duì)骨髓細(xì)胞系HL-60的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的觀測(cè)顯示了GSSG(以及其藥物劑型)慢化轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖的能力。表12顯示GSSG與過氧化氫、肌苷和胱胺的組合物對(duì)細(xì)胞HL-60增殖的抑制好于單獨(dú)的GSSG。流動(dòng)細(xì)胞熒光測(cè)定分析證明HL-60細(xì)胞系的細(xì)胞生長的慢化與編程性細(xì)胞死亡樣死亡的形態(tài)學(xué)特征指標(biāo)有關(guān)球狀細(xì)胞變成多片段的，帶有多個(gè)截?cái)?，DNA含量正常的細(xì)胞核的數(shù)量下降了，而DNA含量異常低的細(xì)胞核部分增加了(圖1a-1b)。
因此，所得到的結(jié)果可表明GSSG及其藥物劑型的雙功能特性，它們可選擇性地導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖慢化和編程性細(xì)胞死亡樣死亡，而相當(dāng)大地促進(jìn)了正常人細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)的增殖，它們沒有任何編程性細(xì)胞死亡的跡象。GSSG與肌苷結(jié)合應(yīng)用使GSSG對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生了最顯著的作用。實(shí)施例#5GSSG及其藥物劑型對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性腫瘤發(fā)展的影響用通過腹腔接種白血病P388和白血病L1210細(xì)胞而誘導(dǎo)腫瘤過程的兩種鼠模型來評(píng)定GSSG，以及其含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥物劑型的抗腫瘤活性。用測(cè)試品每天給藥共7天的影響來研究血清細(xì)胞因子濃度的變化(IL-1，IL-2，IL-6，IFNa，TNF)。同時(shí)，利用兩種內(nèi)在指數(shù)小鼠由于腹水累積而體重增加的速度，和接種后動(dòng)物的平均存活時(shí)間來評(píng)價(jià)腫瘤的發(fā)展。
該研究用重18-21克的DBA/2小鼠進(jìn)行。首先，每個(gè)細(xì)胞系用6只動(dòng)物來進(jìn)行腫瘤細(xì)胞傳代。為此，將保持在液氮溫度下的細(xì)胞解凍并用無菌Hanks溶液將濃度調(diào)整到5×106細(xì)胞/mL。然后給6只小鼠腹腔接種0.2mL各系細(xì)胞的懸液。
用L1210細(xì)胞接種6天后收集腹水，用P388細(xì)胞接種8天后收集腹水。將由此得到的傳代腫瘤細(xì)胞的樣品用于主要實(shí)驗(yàn)。將流動(dòng)液體用無菌Hanks溶液溶解以使P388細(xì)胞的濃度為5×106細(xì)胞/mL，L1210細(xì)胞的濃度為5×105細(xì)胞/mL。
將動(dòng)物分成9組，每組不少于15只鼠，用于兩種腫瘤細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)。給每只小鼠接種0.2mL所得細(xì)胞懸液(106P388細(xì)胞/鼠，105L1210細(xì)胞/鼠)。腫瘤細(xì)胞系接種后24小時(shí)，給動(dòng)物首次注射測(cè)試品或賦型劑。測(cè)試品注射每天進(jìn)行直到實(shí)驗(yàn)的第14天或直到動(dòng)物死亡。注射的溶液的體積為0.01mL/g體重。
用于兩種腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物分成9組，各組含義如下。
對(duì)照組·#1-接受假腫瘤細(xì)胞接種的整體動(dòng)物(注射生理鹽水)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中它們?cè)龠M(jìn)一步用生理鹽水處理；·#2-接種腫瘤細(xì)胞的空白動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用測(cè)試品賦形劑(生理鹽水)處理；對(duì)照組·#3-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品(溶于生理鹽水的GSSG)處理；·#4-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.003％H2O2的生理鹽水)處理；·#5-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#6-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用GSSG劑量為5mg/kg的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG溶于含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；
·#7-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有0.03％H2O2的生理鹽水)處理；·#8-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#9-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；表13和14含有測(cè)試品對(duì)各種細(xì)胞因子內(nèi)源性產(chǎn)生的功效的評(píng)定結(jié)果，以及有關(guān)腫瘤發(fā)展過程的綜合參數(shù)的數(shù)據(jù)。所得結(jié)果顯示GSSG及其藥物劑型具有細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用，(如果與對(duì)照組相比)確實(shí)延遲了腹水的積累并增加了平均存活時(shí)間。單獨(dú)的GSSG和與0.003％過氧化氫一起的GSSG更顯著地增加了IL-1和IFN的血清濃度，而與0.1％肌苷和0.1％胱胺結(jié)合的GSSG使IL-2，IL-6，TNFa的血清濃度增加更多。
對(duì)于兩種腫瘤模型(P388和L1210白血病)來說，在慢化腹水累積和延長平均存活時(shí)間方面，最顯著的抗腫瘤作用是用與0.1％胱胺結(jié)合的GSSG得到的。
因此，按照本發(fā)明處理動(dòng)物使得IL-2，IL-6，INFa和TNFa的內(nèi)源性產(chǎn)生顯著增加；可靠地抑制了實(shí)驗(yàn)性腫瘤的發(fā)展并延長了平均存活時(shí)間。實(shí)施例#6GSSG的鋰鹽，S-硫乙胺-GGSG以及它們的藥物劑型對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡過程的影響利用正常或腫瘤細(xì)胞來評(píng)定S-硫乙胺-GGSG和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的鋰鹽以及它們的含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺，或7％二甲基亞砜(DMSO)的藥物劑型影響細(xì)胞死亡過程和調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡的能力。為此，用大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(REF)和相同細(xì)胞培養(yǎng)這些物質(zhì)72小時(shí)，并用與ras-癌基因(e-ras細(xì)胞系)互補(bǔ)的腺病毒E1 A基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。隨后通過對(duì)每毫升細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)(對(duì)REF細(xì)胞系)或?qū)ζ矫笾械目寺?shù)計(jì)數(shù)(對(duì)e-ras細(xì)胞系)來評(píng)定實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞構(gòu)成。
細(xì)胞在添加有10％胎牛血清和50mg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中進(jìn)行。
REF細(xì)胞以800000細(xì)胞/mL的初始密度培養(yǎng)，在測(cè)試品接種的0、24、48和72小時(shí)時(shí)評(píng)定細(xì)胞構(gòu)成。
E-ras細(xì)胞以300細(xì)胞/5cm皿的密度種植。e-ras細(xì)胞已開始生長7天后評(píng)定克隆數(shù)量并將測(cè)試品加入各皿中。
GSSG鋰鹽和S-硫乙胺-GSSG的測(cè)試溶液(5000mg/mL)，以及含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺，或7％DMSO的GSSG鋰鹽和S-硫乙胺-GSSG溶液的評(píng)定是每種測(cè)試溶液用6份細(xì)胞樣品進(jìn)行。
將每種測(cè)試溶液各50mcL加入某一細(xì)胞培養(yǎng)基中，之后細(xì)胞培養(yǎng)24-72小時(shí)。對(duì)于評(píng)價(jià)編程性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的測(cè)試系統(tǒng)，以4Dj的劑量引發(fā)UV誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。照射后立即加入測(cè)試品。然后每24小時(shí)監(jiān)測(cè)每毫升細(xì)胞的數(shù)量(對(duì)REF細(xì)胞系)或皿中的克隆量(對(duì)e-ras細(xì)胞系)。為了測(cè)定DNA斷裂，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下使用瓊脂糖凝膠中的電泳。
研究結(jié)果見表15-18。表15和16顯示GSSG鋰鹽或S-硫乙胺-GSSG或它們的藥物劑型的存在沒有促進(jìn)正常細(xì)胞(REF細(xì)胞系)的編程性細(xì)胞死亡。對(duì)e-ras細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行的觀測(cè)顯示了GSSG鋰鹽或S-硫乙胺-GSSG(以及它們的藥物劑型)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞死亡的能力。
表17和18顯示GSSG鋰鹽或S-硫乙胺-GSSG或它們的藥物劑型的存在沒有促進(jìn)UV照射誘導(dǎo)的正常細(xì)胞(REF細(xì)胞系)的編程性細(xì)胞死亡。對(duì)e-ras細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的觀測(cè)顯示了GSSG鋰鹽或S-硫乙胺-GSSG(以及它們的藥物劑型)加強(qiáng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞死亡的能力。
因此，所得到的結(jié)果可表明GSSG鋰鹽或S-硫乙胺-GSSG以及它們的藥物劑型的功能的二重性，它們可選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡樣死亡，而正常細(xì)胞沒有任何編程性細(xì)胞死亡的跡象。另外，所有測(cè)試品都能減弱UV照射誘導(dǎo)的正常細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡進(jìn)程，而能加強(qiáng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的這些進(jìn)程。對(duì)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，S-硫乙胺-GSSG與DMSO結(jié)合應(yīng)用比GSSG鋰鹽產(chǎn)生了更顯著的作用。實(shí)施例#7GSSG的鋰鹽，S-硫乙胺-GGSG以及它們的藥物劑型對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性腫瘤發(fā)展的影響用通過腹腔接種白血病P388，白血病L1210細(xì)胞和Erlich腺癌細(xì)胞而誘導(dǎo)腫瘤過程的三種鼠模型來評(píng)定GSSG鋰鹽和S-硫乙胺-GGSG，以及它們的含有0.003％過氧化氫，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺，或7％二甲基亞砜(DMSO)的藥物劑型的抗腫瘤活性。用測(cè)試品每天給藥共7天的影響來研究腫瘤的發(fā)展，利用兩種內(nèi)在指數(shù)來評(píng)價(jià)小鼠由于腹水累積而體重增加的速度，和接種后動(dòng)物的平均存活時(shí)間。
該研究用重18-21克的DBA/2小鼠進(jìn)行。首先，每個(gè)細(xì)胞系用6只動(dòng)物來進(jìn)行腫瘤細(xì)胞傳代。為此，將保持在液氮溫度下的細(xì)胞解凍并用無菌Hanks溶液將濃度調(diào)整到5×106細(xì)胞/mL。然后給6只小鼠腹腔接種0.2mL各系細(xì)胞的懸液。
用L1210細(xì)胞接種6天后收集腹水，用P388細(xì)胞接種8天后收集腹水，用Erlich腺癌細(xì)胞接種18天后收集腹水。將由此得到的傳代腫瘤細(xì)胞的樣品用于主要實(shí)驗(yàn)。將流動(dòng)液體用無菌Hanks溶液溶解以使P388細(xì)胞和Erlich腺癌細(xì)胞的濃度為5×106細(xì)胞/mL，L1210細(xì)胞的濃度為5×105細(xì)胞/mL。
將動(dòng)物分成11組，每組不少于15只鼠，用于各種腫瘤細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)。給每只小鼠接種0.2mL所得細(xì)胞懸液(106P388和Erlich腺癌細(xì)胞/鼠，105L1210細(xì)胞/鼠)。腫瘤細(xì)胞系接種后24小時(shí)，給動(dòng)物首次注射測(cè)試品或賦型劑。測(cè)試品注射每天進(jìn)行直到實(shí)驗(yàn)的第14天或直到動(dòng)物死亡。注射的溶液的體積為0.01mL/g體重。
用于各種腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物分成9組，各組含義如下。
對(duì)照組·#1-接受假腫瘤細(xì)胞接種的整體動(dòng)物(注射生理鹽水)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中它們?cè)龠M(jìn)一步用生理鹽水處理；·#2-接種腫瘤細(xì)胞的空白動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用測(cè)試品賦形劑(生理鹽水)處理；實(shí)驗(yàn)組·#3-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品(溶于生理鹽水的S-硫乙胺-GSSG)處理；·#4-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(S-硫乙胺-GSSG溶于含有0.003％H2O2的生理鹽水)處理；·#5-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(S-硫乙胺-GSSG溶于含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#6-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(S-硫乙胺-GSSG溶于含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；·#7-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(S-硫乙胺-GSSG溶于含有7％DMSO的生理鹽水)處理；·#8-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品(溶于生理鹽水的GSSG鋰鹽)處理；·#9-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG鋰鹽溶于含有0.003％H2O2的生理鹽水)處理；·#10-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG鋰鹽溶于含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#11-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG鋰鹽溶于含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；·#12-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用5mg/kg劑量的測(cè)試品藥物劑型的變體(GSSG鋰鹽溶于含有7％DMSO的生理鹽水)處理；·#13-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有0.003％H2O2的生理鹽水)處理；·#14-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有0.1％肌苷的生理鹽水)處理；·#15-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有0.1％胱胺的生理鹽水)處理；·#16-接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，它們?cè)龠M(jìn)一步用不含GSSG的藥物劑型成分的變體(含有7％DMSO的生理鹽水)處理；
表19-21含有測(cè)試品對(duì)腫瘤發(fā)展過程的綜合參數(shù)的功效評(píng)定結(jié)果。
對(duì)于各種腫瘤模型(P388，L1210白血病和Erlich腺癌)來說，在慢化腹水累積和延長平均存活時(shí)間方面，最顯著的抗腫瘤作用是用與0.1％肌苷和7％DMSO結(jié)合的S-硫乙胺-GSSG得到的。實(shí)施例#8GSSG的鋅鹽和S-硫乙胺-GSSG以及它們的藥物劑型對(duì)多發(fā)性硬化癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?shí)驗(yàn)性變態(tài)性腦炎(EAE)的進(jìn)程的影響用EAE的模型評(píng)價(jià)與S-硫乙胺-GSSG結(jié)合的GSSG鋅鹽的0.003％H2O2溶液(1ml中有10mg GSSG和100mg S-腺苷-甲硫氨酸)和S-硫乙胺-GSSG的5％抗壞血酸溶液的作用。
在該研究的框架中，評(píng)價(jià)指定的結(jié)合物對(duì)血液的細(xì)胞含量(白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞數(shù))的10天過程的影響。為了評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)髓鞘堿性蛋白和神經(jīng)元膜抗原的高敏性，研究在這些抗原存在下外周血中的白細(xì)胞的體外遷移活性。我們還使用了白細(xì)胞遷移抑制的反應(yīng)的毛細(xì)管方法(RILM)。還進(jìn)行了神經(jīng)學(xué)評(píng)定。
該研究是用體重400-500克的雄性豚鼠進(jìn)行的。
利用柱色譜法從公牛的脊髓得到腦炎誘導(dǎo)物質(zhì)-髓鞘堿性蛋白(MBP)并用弗氏完全佐劑乳化。動(dòng)物的免疫接種是將腦炎誘導(dǎo)混合物(MBP+弗氏完全佐劑)經(jīng)皮下接種到前爪而完成的。臨床表達(dá)的EAE平均潛伏期約14-15天，最少12天。
對(duì)照組·#1-使用生理溶液的整體動(dòng)物；·#2-接觸腦炎誘導(dǎo)混合物的動(dòng)物，之后它們?cè)俳邮苌砣芤骸?br>
實(shí)驗(yàn)組·#3-接觸腦炎誘導(dǎo)混合物的動(dòng)物，之后它們?cè)俳邮芘cS-腺苷-甲硫氨酸結(jié)合的谷胱甘肽鋅鹽(GSSG-Zn)的0.003％H2O2溶液，5mg GSSG基/kg體重。
·#4-接觸腦炎誘導(dǎo)混合物的動(dòng)物，之后它們?cè)俳邮躍-硫乙胺-GSSG的5％抗壞血酸溶液，5mg GSSG基/kg體重。
神經(jīng)學(xué)評(píng)定(評(píng)分)
1肌肉無力，行動(dòng)不協(xié)調(diào)；2爪輕癱，膀胱缺乏張力，排尿異常；3運(yùn)動(dòng)及功能性麻痹(骨盆器官)；4血液循環(huán)和溫度調(diào)節(jié)異常；5劇痛，切-斯二氏呼吸。
細(xì)胞免疫評(píng)定方法1.白細(xì)胞遷移抑制反應(yīng)(RILM)-是體外延遲型超敏反應(yīng)的變體。方法基礎(chǔ)在毛細(xì)玻璃管中與MB接觸期間外周血白細(xì)胞的遷移活性的改變。用顯微鏡的目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量遷移區(qū)。遷移指數(shù)計(jì)算為有抗原的細(xì)胞的遷移程度與自發(fā)遷移(無抗原)的比。指數(shù)變化大于0.2是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，遷移指數(shù)小于0.8被認(rèn)為是抑制。
2.血液白細(xì)胞與MBP接觸期間的自發(fā)粘著及其變化。
血細(xì)胞經(jīng)血管內(nèi)皮的遷移是EAE的炎性損害發(fā)展中的關(guān)鍵階段。這一過程可通過在白細(xì)胞和內(nèi)皮上表達(dá)的粘著分子的結(jié)合作用來測(cè)定。白細(xì)胞的粘著性能被抗原抑制表示了免疫動(dòng)物的特異性致敏；抑制過程中該參數(shù)的變化表示藥物對(duì)細(xì)胞免疫的促免疫特性。
3.細(xì)胞的粘著活性是利用對(duì)微量板Falkon Plastic 3034的粘著試驗(yàn)來進(jìn)行研究的，結(jié)果進(jìn)行熒光評(píng)估并表示為自發(fā)或與抗原接觸后粘著到板上的細(xì)胞數(shù)。
粘著指數(shù)的計(jì)算(1-有抗原/自發(fā)的粘著)×100粘著指數(shù)＞30表明自發(fā)粘著抑制反應(yīng)。
用測(cè)試品處理完成后24小時(shí)，將仍活著的動(dòng)物處死并在無菌條件下對(duì)脾細(xì)胞計(jì)數(shù)。同時(shí)用血液樣品評(píng)估細(xì)胞計(jì)數(shù)。
反映測(cè)試品對(duì)存活動(dòng)物的作用和神經(jīng)學(xué)狀況的數(shù)據(jù)列于表22和23。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，GSSG-Zn和甲硫氨酸制劑的使用幫助了動(dòng)物存活的增加并顯著減少了EAE的神經(jīng)學(xué)癥狀(參見表22和23)。
表24和25中顯示了測(cè)試品對(duì)EAE免疫學(xué)參數(shù)的影響結(jié)果。這些數(shù)據(jù)證明了測(cè)試品對(duì)血液淋巴細(xì)胞對(duì)腦抗原致敏的參數(shù)的顯著作用。同時(shí)在RILA(表24)和RILM(表25)中淋巴細(xì)胞的致敏顯著下降。
因此，在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)的已知物質(zhì)-氧化型谷胱甘肽(GSSG)及其含有0.003％過氧化物，或0.1％肌苷，或0.1％胱胺的藥理學(xué)活性組合物的新性能被認(rèn)為足以表明GSSG及其藥理學(xué)制劑具有顯著的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，以及治療作用。這證明應(yīng)用單獨(dú)的GSSG和與能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的藥學(xué)上可接受的成分結(jié)合的GSSG的相應(yīng)藥物劑型來預(yù)防和治療其中對(duì)細(xì)胞因子和造血因子的內(nèi)源性產(chǎn)生的刺激是有利的并被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是有益的疾病的做法是正確的。
下述有關(guān)GSSG藥物劑型臨床應(yīng)用的實(shí)施例(#9-26)支持了利用GSSG作為人體內(nèi)內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)物的想法，并提供了基于上述GSSG性能的疾病治療方法。實(shí)施例#9GSSG藥物劑型對(duì)患有腫瘤疾病的患者的內(nèi)源性和紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的影響該實(shí)施例中的數(shù)據(jù)證明了GSSG對(duì)癌癥患者的內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生的刺激作用。GSSG溶液(5mg/mL)緩慢地靜脈給藥，每?jī)商煲淮?，每次注?mg。利用首次給藥前(給藥前24小時(shí)采集的血液)和第三次及第七次注射后細(xì)胞因子的血液濃度來測(cè)定細(xì)胞因子的內(nèi)源性產(chǎn)生。細(xì)胞因子濃度利用商業(yè)上可得到的試劑組(Medgenix，Belgium)通過免疫酶技術(shù)進(jìn)行評(píng)估并表示為pg/ml培養(yǎng)基。
從表26中的數(shù)據(jù)可看出，GSSG注射三次后立即記錄到了對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞因子(IL-1b，IL-6，TNF-a，IFN-a)和紅細(xì)胞生成素的顯著刺激。在大多數(shù)情況下，第七次注射后(治療的第14天)觀測(cè)到細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素的血液濃度升高了許多倍。實(shí)施例#10患有結(jié)腸直腸癌并發(fā)化療導(dǎo)致的血液抑制的患者的內(nèi)源性和紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的刺激患者，女，44歲，對(duì)穿過卵巢生長的結(jié)腸直腸塊和在腸系膜和網(wǎng)膜淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)移瘤(T4N3M1)進(jìn)行了手術(shù)。手術(shù)后用5-氟尿嘧啶進(jìn)行化療(總劑量5.5g)，產(chǎn)生了嚴(yán)重的血液毒性。
化療后一個(gè)月患者進(jìn)行復(fù)查，腹膜超聲波檢查和肝臟計(jì)算機(jī)X線體層照相顯示在肝左葉中有一個(gè)卵圓形13×10mm的單個(gè)轉(zhuǎn)移瘤。重復(fù)血液計(jì)數(shù)顯示血液指數(shù)未完全恢復(fù)(記錄到不同嚴(yán)重程度的白細(xì)胞減少，淋巴細(xì)胞減少，貧血和血小板減少)，因此不可能進(jìn)一步進(jìn)行化療。
使用氧化型谷胱甘肽藥物劑型(5mg GSSG在1mL 0.003％過氧化氫中)前的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)列于表27。按照本發(fā)明方法的治療是從靜脈注射GSSG7天，每天一次，一次5mg開始的。間隔3天后，再繼續(xù)治療10天，IV，每日劑量15mg。這一過程后休息7天，之后繼續(xù)用GSSG治療，每?jī)商旒∽⒁淮?，每?5mg(共注射20次)。
治療開始后50天患者重新進(jìn)行評(píng)估，腹膜超聲波檢查和肝臟的計(jì)算機(jī)X線體層照相顯示單個(gè)的肝轉(zhuǎn)移瘤有相當(dāng)大的減小(超過治療前尺寸的50％)。治療后的免疫學(xué)指數(shù)列于表27。
從這些數(shù)據(jù)可看出，紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著改善，血小板幾乎完全恢復(fù)，ESR下降，CD4+，CD8+，NK細(xì)胞數(shù)增加，內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生有較大的刺激，TNF(與增加的天然殺傷劑一起)可能是肝轉(zhuǎn)移瘤消退的原因。這些變化同時(shí)伴隨有患者全身性狀況的改善。
該臨床情況明顯地表明了本發(fā)明方法的療效。所給予的治療顯著刺激了內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子的產(chǎn)生，減小了肝轉(zhuǎn)移瘤的尺寸，使免疫參數(shù)正?；⑹够颊叩臓顩r總體改善。實(shí)施例#11患有隱球菌腦膜炎的AIDS患者的內(nèi)源性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的刺激患者，男，28歲，之前確診為AIDS而住院，3/4C期(WHO分期系統(tǒng))，中度病情。該患者表現(xiàn)有陣發(fā)性頭痛，頭暈和嘔吐。體重47kg，Karnofsky評(píng)分60，遲鈍，發(fā)熱到39℃，靜止時(shí)呼吸困難。
神經(jīng)學(xué)檢查顯示頸背強(qiáng)直，膝，踝，二頭肌和三頭肌反射減小。腦脊液培養(yǎng)對(duì)新型隱球菌為陽性，這是進(jìn)行腦膜腦炎隱球菌診斷的基礎(chǔ)，AIDS期精確為4C。
開始強(qiáng)輸注治療。除了緩和治療外，患者還接受二性霉素(兩性霉素B)治療，但沒有陽性結(jié)果。神經(jīng)癥狀學(xué)和患者的一般狀況繼續(xù)惡化。持續(xù)低到中度發(fā)熱(37.5-38.5℃)。
開始氧化型谷胱甘肽治療時(shí)(5mg/mL)，患者的CD4+和CD8+外周血計(jì)數(shù)已顯著下降，并有貧血和總體淋巴細(xì)胞減少(參見表28)。
患者接受本發(fā)明方法治療3個(gè)月(每次給予1mL GSSG溶液)。在治療的第一個(gè)月期間，患者每?jī)商旖o藥一次(前10天靜脈給藥，之后是肌注)；第二個(gè)月期間，患者每三天給藥一次(頭10天IV，之后皮下注射)。
到治療的第一個(gè)月中期，患者的狀況顯著改善，神經(jīng)學(xué)體征減輕，低度發(fā)熱不超過37.5℃。在治療過程中，對(duì)患者的腦脊液進(jìn)行兩次真菌學(xué)檢查(細(xì)胞學(xué)，培養(yǎng)物，對(duì)隱球菌抗原的乳汁凝集試驗(yàn))。到治療的第一個(gè)月的末期，活新型隱球菌數(shù)顯著減少。第二個(gè)月末期，細(xì)胞學(xué)、培養(yǎng)以及免疫學(xué)試驗(yàn)顯示腦脊液中已沒有病原體。由于患者的狀況有較大改善，在第三個(gè)月期間，每周給藥一次，IM。
治療結(jié)束后的血液學(xué)/免疫學(xué)結(jié)果列于表28。從表中可明顯看出，貧血癥狀減輕了，淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)使AIDS分期從4C轉(zhuǎn)為4B。
值得注意的是在對(duì)抗致病霉菌的宿主防御中起關(guān)鍵作用的、有IL-2，Il-6和IFN-g的細(xì)胞因子血液濃度有較大的升高。
出院時(shí)，患者的狀況是令人滿意的，體重為60kg(比入院時(shí)增加了21.7％)，體溫正常，Karnofsky評(píng)分90，沒有神經(jīng)學(xué)癥狀。實(shí)施例#12并發(fā)等孢子球蟲病的AIDS患者的內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激和治療作用患者，男，38歲，診斷為AIDS已兩年，3C期(WHO分期系統(tǒng))。在前一年中，反復(fù)發(fā)作口腔及食管念珠菌病，并有慢性腸道等孢子球蟲病表現(xiàn)食欲不振，惡心，經(jīng)常嘔吐和含有血及粘液的水樣糞便。反復(fù)使用cotrimoxazole(甲氧芐氨嘧啶加磺胺甲基異噁唑，TMP-SMX)已產(chǎn)生了不穩(wěn)定的緩解，癥狀會(huì)迅速復(fù)發(fā)。在入院前最后一個(gè)月內(nèi)，再次復(fù)發(fā)等孢子球蟲病。用cotrimoxazole，emodium(洛哌丁胺)治療沒有效果。患者病情已逐漸惡化頑固性發(fā)熱38℃以上，一天排6-7次出血性和粘液性糞，嘔吐，前進(jìn)性失重(一年中發(fā)病前體重的15％)?；颊咭岩蚱洳∏槌掷m(xù)惡化而入院。
入院時(shí)，患者表現(xiàn)為中等嚴(yán)重的病情，Karnofsky評(píng)分50，發(fā)熱38.2℃，消瘦(體重42kg)，皮下脂肪總體缺乏，皮膚蒼白，口腔及食管念珠菌病癥狀。糞便檢查顯示有大量貝氏等孢子球蟲卵囊。
開始按照本發(fā)明方法進(jìn)行治療時(shí)，患者的淋巴細(xì)胞減少，CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞顯著下降，血蛋白過少(見表29)。
患者接受氧化型谷胱甘肽藥物劑型(5mg GSSG在1mL 0.003％過氧化氫中)2個(gè)月(每次給予1mL GSSG溶液)。在治療的第一個(gè)月期間，患者每?jī)商旖o藥一次(前10天靜脈給藥，之后是肌注)；第二個(gè)月期間，患者每三天給藥一次(頭10天IV，之后皮下注射)。
治療兩周后，患者的病情開始顯著改善。到第一個(gè)月治療結(jié)束時(shí)，患者每天大便不超過102次，糞便無血；體溫僅偶爾超過37℃。第二個(gè)月結(jié)束時(shí)，糞便復(fù)查顯示對(duì)貝氏等孢子球蟲是陰性的。由于患者的狀況有較大改善，在第三個(gè)月期間，僅預(yù)防性每周給藥一次，IM。疾病再?zèng)]有復(fù)發(fā)。
治療結(jié)束后的血液學(xué)/血液化學(xué)評(píng)定結(jié)果列于表29。從表中可看出，血蛋白減少已減輕，淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)顯著增加，按照WHO分期系統(tǒng)AIDS重新分期為3B。
值得注意的是細(xì)胞因子的血液濃度顯著升高，其中包括已知在對(duì)抗原蟲感染的宿主防御中起重要作用的IL-2和IFN-g。
治療的結(jié)果使患者的病情顯著改善，疲勞緩解，食欲恢復(fù)。體重比入院時(shí)增加了30％，Karnofsky評(píng)分90。物理檢查對(duì)患者病情的評(píng)定是令人滿意的。在1.5個(gè)月的跟蹤隨訪中沒有再復(fù)發(fā)腹瀉。實(shí)施例#13再生不良性貧血和各類血細(xì)胞減少癥患者的內(nèi)源性紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的刺激和治療作用患者，男，37歲，已觀測(cè)到不知起點(diǎn)的貧血約1年，其嚴(yán)重程度已逐漸增加。已有10個(gè)月易疲勞，頭暈，經(jīng)常鼻出血，對(duì)呼吸感染異常敏感，肺炎發(fā)作三次，其中一次是格魯布性肺炎，患者為此很苦惱。在這一年中，患者的體重減輕了10％。反復(fù)在門診用口服和靜脈注射鐵制劑，葉酸，維生素B包括B12進(jìn)行治療，沒有產(chǎn)生效果。入院時(shí)患者表現(xiàn)有中等嚴(yán)重度的病情，中度呼吸困難，青腫和分離的瘀點(diǎn)。連續(xù)血液學(xué)分析顯示出中度到重度低色性(顏色指數(shù)0.7-0.9)正常紅細(xì)胞性貧血(1.5-2.5×1012/L)，紅細(xì)胞不均和異形紅細(xì)胞癥，中度白細(xì)胞減少，和血小板減少50-80×109/L。
用鐵制劑，葉酸，維生素B12，維生素，潑尼松進(jìn)行主動(dòng)輸注治療并反復(fù)輸入紅細(xì)胞僅使病情勉強(qiáng)緩解。
骨髓鑒別(鉆取活組織檢查)顯示細(xì)胞明顯過少，骨髓腔中占主要的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。骨髓和紅細(xì)胞譜系受到顯著減小的紅細(xì)胞/骨髓比較大抑制。巨核細(xì)胞數(shù)量不足，而相對(duì)的分化細(xì)胞，血漿細(xì)胞和胚細(xì)胞增加。鐵儲(chǔ)存增加。診斷不知起端的再生不良性貧血，各類血細(xì)胞減少。
開始用氧化型谷胱甘肽藥物劑型(5mg GSSG在1mL 0.003％過氧化氫中)治療時(shí)的完全血液計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞生成素濃度列于表30。從表中可明顯看出，實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與再生不良性貧血的特征是一致的，不過紅細(xì)胞生成素血液濃度沒有典型的增加。另外，紅細(xì)胞生成素的濃度低于正常低限很多(9.2pg/mL，參考范圍是30-170pg/mL，相應(yīng)為3-17mIU/mL)。
用氧化型谷胱甘肽制劑治療是從肌內(nèi)注射1mg GSSG，一天兩次，共三天開始的。之后劑量逐步上升到5mg，每日兩次，共7天。血液計(jì)數(shù)顯示貧血程度降低。從這時(shí)起，藥物劑型以10mg的劑量給藥，IM，一天一次，共10天，此時(shí)RBC計(jì)數(shù)穩(wěn)定恢復(fù)，治療轉(zhuǎn)換為GSSG IV給藥，每三天一次，共30天。同時(shí)口服維生素和鐵制劑。
開始用本發(fā)明方法治療后50天得到的血液學(xué)結(jié)果和紅細(xì)胞生成素濃度列于表#30。從這些數(shù)據(jù)可明顯看出，RBS和WBC計(jì)數(shù)顯著改善，血小板計(jì)數(shù)也顯著改善，ESR減小，紅細(xì)胞生成素濃度超過了正常上限。臨床上，疲勞、頭暈和呼吸困難消失。進(jìn)行檢查，沒有發(fā)現(xiàn)瘀點(diǎn)或青腫，也沒有觀察到或記錄到鼻出血。體重增加5.5kg(發(fā)病前的8％)。
骨髓復(fù)查(治療結(jié)束鉆取貸組織檢查)發(fā)現(xiàn)骨髓組織占骨髓腔的60％，骨髓組織島中的紅細(xì)胞/骨髓比超過標(biāo)準(zhǔn)。有正成紅細(xì)胞增生跡象，在正成紅細(xì)胞集合中發(fā)現(xiàn)了類巨成紅細(xì)胞。偶爾有肥大細(xì)胞，巨核細(xì)胞豐富。鐵儲(chǔ)存稍有增加。
該臨床情形表明了藥物劑型的清楚的療效。給予的治療使開始時(shí)受抑制的內(nèi)源性紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生有效增加。結(jié)果，血液學(xué)參數(shù)實(shí)際恢復(fù)，貧血臨床跡象消除?；颊咭粤钊藵M意的狀況出院。實(shí)施例#14胃癌，腹膜轉(zhuǎn)移瘤，腹水，脾腫大和膽汁郁積性肝炎患者的內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激和治療作用患者，33歲，診斷有胃腫瘤2年以上(中等分化程度的腺癌)。1993年，患者因惡性胃潰瘍進(jìn)行了手術(shù)，在肝門發(fā)現(xiàn)了無數(shù)稠淋巴結(jié)，它們被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移瘤。
1994年1月，化療(5FU)過程中并發(fā)了嚴(yán)重膽汁郁積，進(jìn)行了左右肝管的經(jīng)皮引流，6個(gè)月后接受膽總管空腸吻合術(shù)，利用Beown’s吻合術(shù)進(jìn)行可變的經(jīng)肝引流。
1995年11月，患者的情況惡化。根據(jù)檢查，患者出現(xiàn)了活動(dòng)性繼發(fā)性肝炎。肝臟擴(kuò)大并疼痛，突出肋弓5-6sm。血液化學(xué)指數(shù)證明有持續(xù)異常因是間接的，膽紅素-40.0(直到31.0)；轉(zhuǎn)氨酶活性-是正常上限的約6倍，血蛋白減少到26％；還有血丙種球蛋白過多；血膽甾醇過多直到10.2mmol/l。
在纖維胃照相時(shí)(1995年11月)，確定腫瘤位于胃體的中部且延長了約8cm。腫瘤是固體樣的。胃壁僵硬。組織學(xué)檢查確定該腫瘤為中度剖腹術(shù)的腺癌。發(fā)現(xiàn)腹水，且有許多轉(zhuǎn)移瘤遍布腹膜，脾腫大。患者鑒定為不宜手術(shù)。
決定應(yīng)用含有0.1％肌苷的GSSG藥物劑型。藥物胃腸外注射(肌內(nèi)和靜脈注射)，另外，藥物在內(nèi)窺鏡的幫助下圍繞腫瘤組織進(jìn)行局部注射。肌內(nèi)和靜脈注射的平均劑量是0.1-0.5mg/kg；局部注射的劑量在原位不超過50mg。藥物的胃腸外注射每?jī)商爝M(jìn)行一次，每日兩次(早晨靜脈注射，晚上肌內(nèi)注射)，進(jìn)行三周，之后一周兩次，進(jìn)行四周。開始用藥物進(jìn)行治療后兩個(gè)月，纖維胃十二指腸鏡檢查顯示食管可通行，粘膜為粉紅色，賁門絲球部分閉合。空胃時(shí)其中有中等量的泡沫分泌物，膽汁使它們的顏色加深了。腫瘤長度5cm。同時(shí)，血液學(xué)和血液化學(xué)指數(shù)有實(shí)質(zhì)改善。
四個(gè)月后，肝臟突出肋弓1cm。觸診肝臟不疼。超聲波檢查顯示先前被腫瘤組織侵襲的某些區(qū)域上出現(xiàn)了纖維組織。1996年5月進(jìn)行纖維胃十二指腸鏡檢查顯示食管部分閉合。胃中有稍混濁的液體，包含唾液。粘膜為粉紅色。腫瘤長度3.6cm，胃壁是彈性的。十二指腸可通行。
與用所提到的GSSG藥物劑型治療前(1995年11月)進(jìn)行的檢查結(jié)果相比，腫瘤收縮了55％。同時(shí)肝臟試驗(yàn)、血液學(xué)和免疫學(xué)指數(shù)也有顯著有益的變化(見表31)。
因此，按照本發(fā)明的治療使得腫瘤進(jìn)程部分消退，同時(shí)血液學(xué)、血液化學(xué)和免疫學(xué)參數(shù)有明顯的有益變化，生命質(zhì)量顯著改善。實(shí)施例#15皮膚癌(墨克爾細(xì)胞癌)，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤和化療導(dǎo)致的血液和免疫抑制患者的內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激和治療作用患者，男，64歲，從1995年8月起，因在肩胛區(qū)出現(xiàn)大小逐漸增長的充血性無痛團(tuán)塊而一直處于醫(yī)療監(jiān)督下。一個(gè)月后，團(tuán)塊延續(xù)到腋窩，繼續(xù)增長，并開始疼痛。出現(xiàn)發(fā)熱(38.9℃)。1995年10月進(jìn)行組織學(xué)和免疫學(xué)檢查確診為神經(jīng)內(nèi)分泌型皮癌(墨克爾細(xì)胞癌)III期。
1995年12月，患者進(jìn)行CMF化療(環(huán)磷酰胺+甲氨喋呤+氟尿嘧啶)，沒有明顯療效。同時(shí)發(fā)生了明顯的血細(xì)胞生成抑制(白細(xì)胞2.4×109/L)，并伴有與皮膚局部充血有關(guān)的頸和鎖骨上淋巴結(jié)的生長。
1996年1月-2月，改變了化療方案順鉑(cysplatine)+環(huán)磷酰胺(CP代替CMF)?；熞鹆讼铝胁l(fā)癥—血細(xì)胞減少癥(白細(xì)胞1.4×109/L)，局部缺血惡化形式的心臟毒性。第二期化療后，觀察到實(shí)質(zhì)的腫瘤進(jìn)展左腋下區(qū)內(nèi)壞死，并有瘺形成；左臂浮腫；在左肩和左腋下組織區(qū)域內(nèi)滲入生長到軟組織中；中毒；持續(xù)發(fā)熱(38.8℃)。由于化療無效且腫瘤明顯發(fā)展，決定與化療(CMF)一起給予與0.1％胱胺結(jié)合的GSSG藥物劑型。
注射GSSG藥物劑型10天后(靜脈注射和肌注，每次注射劑量為0.1-0.5mg/kg)，注意到患者狀態(tài)出現(xiàn)了下列變化生命質(zhì)量改善(食欲佳，移動(dòng)性佳)；潰瘍干燥；排膿消失；瘺愈合，腫瘤收縮30％；體溫正常；充血面積限制；血液學(xué)指數(shù)改善。
進(jìn)行第3和第4期化療(CMF)，同時(shí)給予GSSG藥物劑型(靜脈和肌內(nèi)注射，一天兩次，靜脈注射劑量0.5mg/kg；肌注劑量0.2mg/kg)。制劑的胃腸外給藥是一周三次，利用內(nèi)窺鏡在腫瘤周圍兩處進(jìn)行局部注射，一周一次(每處不超過25mg)。得到下列結(jié)果腫瘤發(fā)展消退；良好的化療耐受性，疼痛綜合征消失，生命質(zhì)量不斷改善，免疫及血細(xì)胞生成恢復(fù)，細(xì)胞因子和造血因子濃度增加(見表32)。
在用本發(fā)明進(jìn)行治療的兩個(gè)月中，有穩(wěn)定的細(xì)胞因子和造血因子的內(nèi)源性產(chǎn)生；左頸和鎖骨上淋巴結(jié)減?。荒[瘤大小收縮兩個(gè)尺度，70％；免疫學(xué)指數(shù)正向移動(dòng)；沒有化療導(dǎo)致的血液抑制。
該臨床研究證明了按照本發(fā)明治療的清楚療效明顯刺激了細(xì)胞因子和造血因子的內(nèi)源性產(chǎn)生，腫瘤大小實(shí)質(zhì)下降，生命質(zhì)量改善，血液學(xué)、血液化學(xué)和免疫學(xué)參數(shù)有益變化。實(shí)施例#16GSSG系列制劑對(duì)重型急性病毒性肝炎的治療作用患者，男，32歲，在傳染病門診住院，有色素代謝異常癥狀皮膚及粘膜黃疸；暗色尿；輕微有色糞便，高濃度的尿膽素原?；颊叩纳眢w狀況非常嚴(yán)重體溫38.8℃，流感樣和關(guān)節(jié)痛綜合征。患者的肝臟擴(kuò)大了4-5cm以上。診斷為急性病毒性肝炎。詳細(xì)診斷為急性病毒性肝炎“B”。重度病情，帶有急性肝機(jī)能不全。
利用GSSG系列制劑治療的第一個(gè)階段包括靜脈注射在0.1％葉酸溶液中的GSSG-Na2，每天一次，共7天，劑量為0.1-0.5mg/kg體重。
治療的第二個(gè)階段包括靜脈注射在0.1％肌苷溶液中的GSSG-Zn，每天一次，共7天，劑量為0.1mg/kg體重。
第三階段包括靜脈注射在5％抗壞血酸溶液中的GSSG-Na2，每?jī)商煲淮?，?天，劑量為0.1-0.5mg/kg體重。同時(shí)用相同的制劑以相同的劑量每天肌內(nèi)注射一次。
表33中的數(shù)據(jù)顯示了血液學(xué)/免疫學(xué)參數(shù)的有益變化，肝炎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)下降(或/和正常化)。因此，病理學(xué)過程消除且患者的恢復(fù)時(shí)間與急性病毒性肝炎患者的通?；謴?fù)時(shí)間相比早1.5-2個(gè)月。實(shí)施例#17GSSG系列制劑對(duì)惡化期的慢性病毒性肝炎患者的治療作用患者，女，56歲，在傳染病門診住院，主訴身體狀況惡化。虛弱，疲勞，易怒，厭食，惡心。她還有一些GIT癥狀，右肋下區(qū)疼痛，體溫到38.5℃。
檢查患者的一般狀況為中等嚴(yán)重度。觸診顯示脾腫大和肝腫大。肝從肋弓下突出3cm。鞏膜和粘膜輕度黃疸。
超聲波檢查肝顯著增大，門靜脈15mm，膽囊壁增厚，胰腺結(jié)構(gòu)正常，脾增大(578×168mm)并增厚。腎的結(jié)構(gòu)沒有顯著改變。
在兩周期間內(nèi)，患者接受解毒和抗病毒治療(Roferon-A，重組α2-干擾素)。由于病情進(jìn)一步發(fā)展且使用的治療無效，決定試用GSSG系列制劑進(jìn)行治療。
靜脈注射在10％膽堿-氯化物溶液中的GSSG-Na2，共進(jìn)行7天(每日一次，劑量為0.1-0.5mg/kg體重)。
隨后的10天中，靜脈注射在5％抗壞血酸溶液中的雙-甲硫氨酸-GSSG(每日一次，劑量為0.1-0.5mg/kg體重)。在這10天中同時(shí)肌內(nèi)注射在0.1％肌苷溶液中的GSSG-Na2(每日一次，劑量為0.1-0.5mg/kg體重)。
上述用GSSG系列制劑進(jìn)行治療后一個(gè)月，患者的身體狀況顯著改善。主訴僅余虛弱和疲勞。疼痛和消化不良綜合征顯著減少，體溫正常。實(shí)驗(yàn)室指數(shù)出現(xiàn)了一些有益的變化(見表34)。超聲波檢查顯示脾腫大和肝腫大程度未變。
由于患者的狀況有一定改善，但仍有肝損傷跡象，決定再用GSSG系列制劑治療一個(gè)療程。進(jìn)行了完全相同的第二療程治療后，患者不再有主訴癥狀。疼痛和消化不良征消失。超聲波檢查顯示脾和肝的尺寸減小。觸診顯示肝從肋弓下突出1.5cm(實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)見表34)。
因此，采用GSSG系列制劑的結(jié)合療法產(chǎn)生了顯著的治療作用，改善了患者的身體狀況和生命質(zhì)量，穩(wěn)定并逆轉(zhuǎn)了病理過程，產(chǎn)生了有益的實(shí)驗(yàn)室變化。實(shí)施例#18GSSG系列制劑對(duì)急性腹膜炎患者的治療作用1.患者，女，78歲，診斷為箝閉性腹壁疝，急性腸梗阻并小腸壞死，和急性腹膜炎毒性發(fā)作期而住院。外科手術(shù)時(shí)在腹腔中發(fā)現(xiàn)并從中除去了約800ml帶有鱗片和纖維蛋白血塊的污穢的滲出物。小腸的箝閉部分已壞死。
小腸部分切除并制造吻合。探針通過食管和胃進(jìn)入小腸并置于回盲腸角。術(shù)后階段每天將腸內(nèi)容物排空一次。之后向小腸中滴注150ml 0.1％葉酸的二甲基亞砜(DMSO)溶液，其中包含10ml 1％GSSG二鈉鹽溶液。同時(shí)靜脈注射0.1％葉酸溶液和1％GSSG二鈉鹽溶液，劑量為0.01-0.1mg/kg，每日一次，注射4天。
手術(shù)后第二天足夠的蠕動(dòng)恢復(fù)。第8天取出探針。第19天患者出院。
2.患者，男，16歲，診斷為急性縫合導(dǎo)致的小腸梗阻并發(fā)作腹膜炎；毒性期而住院。手術(shù)時(shí)在腹腔中發(fā)現(xiàn)并從中除去了約600ml帶有鱗片和纖維蛋白血塊的污穢的滲出物?；颊哂酗@著的連合過程。進(jìn)行連合部切開術(shù)。探針通過食管和胃進(jìn)入小腸并置于回盲腸角。
術(shù)后階段每天將腸內(nèi)容物排空一次。之后向小腸中注射150ml 0.1％葉酸的二甲基亞砜(DMSO)溶液，其中包含10ml 1％GSSG二鈉鹽溶液。同時(shí)靜脈注射0.1％葉酸溶液和1％GSSG二鈉鹽溶液，劑量為0.01-0.1mg/kg，每日一次，注射4天。
手術(shù)后第二天足夠的蠕動(dòng)恢復(fù)，第8天取出探針。第11天患者出院。實(shí)施例#19GSSG系列制劑對(duì)前列腺癌患者的治療作用患者，男，63歲，在泌尿科住院，懷疑為前列腺癌。觸診顯示前列腺增大，質(zhì)地稠密。胸廓的X線檢查顯示在IV-VII肋的前部以及在顱、脊椎、骨盆和股骨中有轉(zhuǎn)移瘤。診斷為有大量骨轉(zhuǎn)移瘤的前列腺癌(T2N2M1)。
按照下述方案進(jìn)行30天的療程1.靜脈注射在1％肌苷溶液中的GSSG-Zn，注射10天，每天一次，劑量為0.01-0.5mg/kg體重。
2.接著的在10天期間內(nèi)淋巴注射S-硫乙胺-GSSG，每天一次，劑量為0.1-1.0mg/kg體重。
3.再10天靜脈注射在1％肌苷溶液中的GSSG-Zn，每?jī)商熳⑸湟淮危瑒┝繛?.01-0.5mg/kg體重。
療程過后，患者的狀況顯著改善，腹股溝疼痛強(qiáng)度變得很弱，頻繁排尿減少到一晚2-3次，下肢浮腫減輕。血液學(xué)檢查顯示出某些有益的改變(表35)。
出院后，患者肌內(nèi)注射在1％肌苷溶液中的GSSG-Zn，一周兩次，劑量為0.01-0.5mg/kg體重。
一年多后，患者再次住進(jìn)同一泌尿科進(jìn)行檢查并用GSSG系列制劑重復(fù)治療。采用GSSG系列制劑的治療方案是相同的。在第二此治療過程結(jié)束3個(gè)月，主要的治療作用是生命質(zhì)量改善；下肢浮腫消失；增大的淋巴結(jié)消退；disury表現(xiàn)消失；前列腺減?。挥幸娴腦線動(dòng)態(tài)(肋和脊椎中的某些特殊轉(zhuǎn)移瘤鈣化)；血液學(xué)及免疫學(xué)指數(shù)恢復(fù)。實(shí)施例#20GSSG系列制劑對(duì)胰腺癌患者的治療作用1996年5月，一名56歲男性患者住進(jìn)N122醫(yī)院的II外科。入院時(shí)患者的病情嚴(yán)重。患者主訴上腹部持續(xù)帶狀疼痛，當(dāng)患者仰臥時(shí)加重，沒有食欲，惡心，嘔吐，氣脹，腹瀉。Karnofsky指數(shù)40。觸診胰腺投影部位的腹肌疼痛且緊張(Kerte’s癥狀)。胰腺堅(jiān)硬，表面粗糙，增大。肝堅(jiān)硬，低于下肋4cm。
超聲波檢查胰腺增大(頭7cm，體4cm，尾2.5cm)邊緣不齊，堅(jiān)硬。Virsung導(dǎo)管增大0.7cm。肝增大，右葉18cm，左葉10cm。下邊緣是圓的。其邊緣不齊，結(jié)構(gòu)是非均勻性的，在主質(zhì)(轉(zhuǎn)移瘤)中有大量回波過強(qiáng)的病灶。診斷為有肝轉(zhuǎn)移瘤的胰腺癌(T3N2M1)。
治療解毒，蛋白酶抑制劑，麻醉止痛。
由于患者的病情有致命危險(xiǎn)，且沒有任何可替代的療法，決定使用GSSG系列制劑進(jìn)行治療。
治療方案靜脈注射GSSG的鋅鹽(0.01-0.5mg/kg)(每日兩次，注射10天)。接下來的10天靜脈注射GSSG的鋅鹽(0.01-0.5mg/kg/天)，每?jī)商煲淮尾?nèi)淋巴注射在7％二甲基亞砜中的GSSG鋅鹽(1.0mg/kg/天)。再接下來的10天(第三個(gè)十天)靜脈注射GSSG的鋅鹽(0.01-0.5mg/kg/天)，一周兩次。
治療一個(gè)月后，患者的病情是中等嚴(yán)重的；左肋下部位周期性中度疼痛。Karnofsky指數(shù)60。停止麻醉止痛，食欲增加。血液參數(shù)有改善的趨勢(shì)。
靜脈注射療程結(jié)束后3周內(nèi)，患者接受GSSG的鋅鹽(0.01-0.5mg/kg)，一周一次，肌內(nèi)注射。
1996年6月患者再次住進(jìn)122醫(yī)院的II外科進(jìn)行檢查并用GSSG系列制劑開始新的療程。
檢查患者的臨床狀況和血液參數(shù)顯著改善(見表36)?；颊叩牟∏閹缀跏橇钊藵M意的。主訴在左肋下區(qū)周期性微疼。觸診在胰腺的頭和體部投影的部位有一些觸痛；該器官不再那么堅(jiān)硬，表面光滑。
超聲波檢查胰腺的大小有一些減小(頭6.3cm，體3.2cm，尾2.1cm)。Virsung導(dǎo)管0.4cm。肝增大，右葉16.5cm，左葉9.5cm。肝的輪廓是參差不齊的，結(jié)構(gòu)是非均勻性的。肝門纖維化。在肝主質(zhì)中有大量發(fā)生回波過強(qiáng)的陰影。
用GSSG系列制劑進(jìn)行第二次治療的方案如下頭10天，每天經(jīng)導(dǎo)管向肝動(dòng)脈中輸注S-硫乙胺-GSSG(0.1-0.5mg/kg/天)。
之后，每天靜脈注射GSSG鋅鹽(0.1-0.5mg/kg)，注射10天?；颊叱鲈?，并接受支持性治療，靜脈注射GSSG鋅鹽(0.1-0.5mg/kg/天)，一周一次，注射1個(gè)月。
1996年9月，患者再次住進(jìn)N122醫(yī)院進(jìn)行檢查并開始第三個(gè)療程。這時(shí)臨床狀況沒有變化。血液參數(shù)的改變見表36。
超聲波檢查胰腺的特征與前相同。肝輕微擴(kuò)大，右葉15cm，左葉8cm，下邊緣為圓形，邊緣明確且光滑，由于有發(fā)生回波過少和過多的病灶，主質(zhì)是非均勻性的(纖維化和鈣化)。
因此下列臨床作用被認(rèn)為是明顯和顯著的生命質(zhì)量改善；腫瘤發(fā)展得到控制；某些轉(zhuǎn)移瘤消退；免疫學(xué)和血液學(xué)指數(shù)恢復(fù)；超聲波檢查結(jié)果有改善。實(shí)施例#21GSSG系列制劑對(duì)糖尿病患者的治療作用患者，女，18歲，在N16醫(yī)院的內(nèi)分泌科住院。診斷胰島素依賴性糖尿病(I型)。嚴(yán)重的胰島素抗性，IV級(jí)糖尿病血管視網(wǎng)膜炎，從14歲起有糖尿病多神經(jīng)病III的初期癥狀。疾病開始為前驅(qū)昏迷狀態(tài)，血糖從18.4變?yōu)?8.0mmol/l，酮尿(丙酮)，葡糖尿達(dá)12％。疾病開始時(shí)總胰島素劑量SU-胰島素68單位，“ICS”269單位。以前已數(shù)次住院。1994-1996年間胰島素劑量達(dá)到500單位。這時(shí)血糖為19.6-24.3mmol/l，葡糖尿?yàn)?-6％，尿中陽性酮。
1996年9月，患者住院，考慮改變治療劑量為ICS胰島素500單位，ICS-A 100單位，SU-胰島素5單位。入院時(shí)胰島素劑量為B-胰島素480單位，SU胰島素22單位。
血糖·9 A.M. 11.4mmol/l·中午11.1mmol/l·2 P.M. 13.9mmol/l·5 P.M. 16.7mmol/l·6 A.M. 10.7mmol/l葡糖尿-直到670mmol，酮+++。
由于患者的胰島素抗性嚴(yán)重，在征得患者同意后決定使用GSSG系列制劑。
治療方案靜脈注射在0.5％硫辛酸溶液中的GSSG-Na2(0.1-0.5mg/kg/天)，每日一次，注射10天。
接下來的10天，靜脈注射，每?jī)商煲淮?，注射?.5％硫辛酸溶液中的GSSG鋅鹽(0.1-0.5mg/kg/天)。
再10天(第三個(gè)10天)，肌內(nèi)注射在5％抗壞血酸溶液中的GSSG-Na2，每日一次，注射20天(0.1-0.5mg/kg/天)。
該療程過后，修改胰島素治療。開始用SU胰島素，每小時(shí)注射數(shù)次，取消持續(xù)釋放的胰島素。
逐漸減少胰島素劑量，患者履行下列胰島素治療方案6 A.M. 4單位SU胰島素9 P.M. 50單位2 P.M. 36單位7 P.M. 36單位11 P.M.8單位(總劑量134單位)。
血糖趨向正常，即使是就餐后也沒有超過8mmol/l。之后患者出院，她作為門診病人接受GSSG系列制劑治療一個(gè)月。治療方案如下在一個(gè)月中，每?jī)商旒?nèi)注射一次在0.5％硫辛酸溶液中的GSSG鈉鹽(0.01-0.5mg/kg)。
在接連的兩個(gè)月中，患者發(fā)作了兩次低血糖(1.8-2.2mmol/l)，這迫使減少胰島素的劑量。因此，之后按照下述胰島素方案治療兩個(gè)月6 A.M.4單位SU-胰島素9 P.M.36單位2 P.M.12單位7 P.M.12單位11 P.M. 4單位(總劑量68單位)。
患者病情是令人滿意的，沒有主訴癥狀。血液參數(shù)的變化見表37。因此下述臨床作用似乎是實(shí)在的胰島素抗性終止；胰島素劑量減少，生命質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)改善。實(shí)施例#22GSSG系列制劑對(duì)肺癌患者的治療作用診斷右肺上葉癌癥(T3N2M0)，已擴(kuò)散到上腔靜脈和肺動(dòng)脈。轉(zhuǎn)移到縱隔淋巴結(jié)。
1995年9月，一名59歲的男性患者住進(jìn)肺病研究所的外科，假定為肺部腫瘤。入院時(shí)患者主訴有周期性發(fā)熱至38.4℃，食欲下降，體重減輕8公斤，活動(dòng)后呼吸困難。
幾次胸部CT掃描(29，08，96)，右肺的大小因上葉的肺換氣不足而減小。右側(cè)的肺樹顯示不相同。右上葉支氣管狹窄且變形，病灶陰影4.0×5.0×6.0cm。很可能縱隔旁淋巴結(jié)增大。胸膜腔中沒有液體。
支氣管鏡檢查氣管下1/3的側(cè)壁有淋巴管炎，右主支氣管側(cè)壁的淋巴管炎和浸潤，右上葉支氣管(側(cè)壁)1-2度緊縮和滲入性狹窄。
胸廓切開術(shù)診斷(14，09，95)右肺上葉有粗糙的稠密塊形成，4.0×5.0×6.0cm，生長到上胸膜壁層中。手術(shù)中檢查，心包打開后它變得明顯了，腫瘤擴(kuò)散到了上腔靜脈和肺動(dòng)脈。組織學(xué)檢查，腫瘤被確定為低分化(小細(xì)胞)癌。這種情況被認(rèn)為是不宜手術(shù)的。
患者的狀況持續(xù)惡化右鎖骨上結(jié)增大(3.5×4.0cm)。患者轉(zhuǎn)移到腫瘤學(xué)研究所進(jìn)行化療。當(dāng)用順鉑結(jié)合依托帕甙治療一個(gè)療程后，患者的病情顯著惡化惡心并嘔吐，脫發(fā)，轉(zhuǎn)氨酶，肌酸酐增高，白細(xì)胞減少。
由于患者的病情嚴(yán)重且沒有任何替代療法，決定用GSSG的鋰鹽進(jìn)行同情治療。
從首次注射GSSG-Li(0.01-0.5mg/kg/天，靜脈注射/肌內(nèi)注射交替進(jìn)行14天)開始，生命質(zhì)量顯著改善(Karnofsky指數(shù)80(60)，食欲增加，呼吸困難減輕。
用在0.003％H2O2溶液中的GSSG鋰鹽治療2周后，血液指數(shù)確實(shí)改善(白細(xì)胞數(shù)，紅細(xì)胞數(shù)，肌酸酐，轉(zhuǎn)氨酶)，并允許試行另一個(gè)化療過程(順鉑結(jié)合依托帕甙)。與第一個(gè)療程相比，當(dāng)患者接受Li-GSSG時(shí)在第二個(gè)療程中沒有出現(xiàn)并發(fā)癥沒有惡心，嘔吐，食欲增加(體重增加5公斤)；臨床及生化血液化驗(yàn)結(jié)果在正常限度內(nèi)。
第二個(gè)化療療程后，重新開始用GSSG系列制劑治療在3％二甲基亞砜中的GSSG鋰鹽(0.01-0.5mg/kg/天，靜脈/肌內(nèi)注射，一周三次，共14天)。
然后患者在腫瘤學(xué)研究所接受又一個(gè)化療過程。在第三次化療期間，沒有出現(xiàn)并發(fā)癥。血液化驗(yàn)結(jié)果在正常限度內(nèi)。增大的右鎖骨上淋巴結(jié)完全消退，X線檢查證明初級(jí)損害改善；沒有肺不張的跡象，在縱隔和氣管旁都沒有發(fā)現(xiàn)其他陰影；氣管在正常位置；沒有殘留腔。
因此結(jié)合使用GSSG系列制劑(GSSG鋰鹽)的2個(gè)化療過程產(chǎn)生了令人滿意的生命質(zhì)量，腫瘤系統(tǒng)性消退，與細(xì)胞因子和造血因子的內(nèi)源性產(chǎn)生的穩(wěn)定增加有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)恢復(fù)(見表38)。后來的一年中，患者接受GSSG鋰鹽，劑量為0.01-0.5mg/kg，每?jī)商煲淮?，一個(gè)月進(jìn)行14天。一年后(14，10，96)胸部CT掃描，在右上葉支氣管中有一個(gè)纖維性改變的部位1.5×1.5×2.0cm。在肺組織中沒有新的滲入或纖維性改變。兩個(gè)肺的氣管和支氣管腔即不狹窄也未變形。沒有縱隔和肺根的淋巴結(jié)增大。胸膜腔中沒有液體。
結(jié)論化療與GSSG-Li2的結(jié)合治療對(duì)化療效果產(chǎn)生了顯著的增強(qiáng)作用，并有可接受的化療耐受性?？偟膩碚f，結(jié)合治療的作用使腫瘤消退，消滅了轉(zhuǎn)移瘤，免疫和造血系統(tǒng)恢復(fù)，生命質(zhì)量提高。實(shí)施例#23GSSG系列制劑對(duì)乙狀結(jié)腸癌患者的治療作用診斷結(jié)腸的直腸乙狀結(jié)腸區(qū)癌(未分化的腺癌)(T4N0M0)。并發(fā)右側(cè)附件腫瘤，右側(cè)輸卵管卵巢膿腫，彌散性蜂窩織炎-膿性腹膜炎。
1996年6月，一名48歲的女患者因上述診斷而緊急住進(jìn)N122中心醫(yī)院的第II外科。
手術(shù)將乙狀結(jié)腸口打環(huán)，腹腔清洗并引流。患者的病情嚴(yán)重Karnofsky30，發(fā)熱39-40℃。盡管強(qiáng)化治療但臨床狀況繼續(xù)惡化且并發(fā)雙側(cè)肺炎。用抗菌素進(jìn)行的其他加強(qiáng)治療(頭孢菌素和青霉素-頭孢氨噻6g/天，氨芐青霉素/苯唑表霉素2g/天)沒有產(chǎn)生預(yù)期效果。
由于治療無效決定用GSSG的鋅鹽進(jìn)行同情治療。
在接受以前的復(fù)合治療同時(shí)，患者接受在0.1％胱胺溶液中的GSSG-Zn2，0.01-0.5mg/kg/天，IV和IM，注射一周。治療一周后，患者的身體狀態(tài)顯著改善，食欲增加，虛弱消失，睡眠正常，傷口的局部愈合加速。血液參數(shù)趨向正常(見表39)，沒有肺炎的X0射線跡象。
這些陽性作用允許進(jìn)行第二階段外科治療-重復(fù)剖腹術(shù)，切除結(jié)腸的直腸乙狀結(jié)腸區(qū)和帶卵巢的右附件。手術(shù)后期間，特征為右側(cè)下葉胸膜肺炎。再次在治療中加入0.1％胱胺溶液中的GSSG-Zn2(0.01-0.5mg/kg/天，靜脈和肌內(nèi)注射，注射一周)。肺炎的臨床和放射學(xué)跡象在3天內(nèi)消除。沒有手術(shù)后傷口并發(fā)癥。第七天拆線?；颊咭粤钊藵M意的狀況出院，繼續(xù)作為門診病人治療。
總體效果可概括如下生命質(zhì)量改善；抗菌治療加強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)室指數(shù)恢復(fù)；傷口愈合加速；根除性外科治療成為可能。實(shí)施例#24GSSG系列制劑對(duì)胰腺/十二指腸癌患者的治療作用診斷擴(kuò)散到十二指腸的胰腺癌(T3N2M1)。
1996年1月，一名67歲的男患者因阻塞性黃疸住進(jìn)N122醫(yī)院的II外科。診斷總膽管滲入性狹窄。手術(shù)經(jīng)皮-經(jīng)肝外部-體內(nèi)引流法。
1996年2月-膽囊切除術(shù)，膽總管-十二指腸肛門口裂(choledocho-dnodenoanostomosis)(Jurash方法)?；颊叩挠依吖窍聟^(qū)劇痛并輻射到背部，處方采用麻醉止痛。沒有食欲。每月體重減輕13公斤。Karnofsky，指數(shù)40。周期性惡心，嘔吐，脂肪痢。血清中的淀粉酶和脂肪酶增加，尿中有淀粉酶，貧血。在胰腺頭的投影部位可觸摸到腫瘤體。纖維胃十二指腸鏡檢查十二指腸粘膜向下滲入到Fater’s乳頭。
由于患者病情嚴(yán)重，繼續(xù)惡化且沒有任何可替代的療法，決定使用在二甲基亞砜(DMSO)中的GSSG-Zn2進(jìn)行同情治療。
治療兩周后患者的狀況明顯改善。Karnofsky指數(shù)80。盡管患者仍有周期性中度疼痛，但持續(xù)疼痛減少，取消麻醉劑。沒有惡心或嘔吐；體重增加4公斤；血液參數(shù)改善(見表40)。
臨床及實(shí)驗(yàn)室改善允許用高劑量化療(5-氟尿嘧啶-10g/期)與GSSG-Zn2結(jié)合治療。在三天中，患者通過內(nèi)淋巴接受氟尿嘧啶(第1天3g，第二天3g，第三天4g)和高劑量的在DMSO中的GSSG-Zn2(0.1-1.0mg/kg/天)。
患者可耐受此治療，沒有血液學(xué)和其他毒性并發(fā)癥。(血液參數(shù)見表40)。連續(xù)3個(gè)月(2月-4月)患者接受支持劑量的在DMSO中的GSSG-Zn2(0.01-0.3mg/天，靜脈和肌內(nèi)注射，一周兩次)。患者的狀況相當(dāng)好，Karnofsky指數(shù)90。沒有疼痛；食欲佳；體重增加8公斤。
3個(gè)月后(1996年5月)，進(jìn)行3天高劑量化療與GSSG-Zn2的結(jié)合治療(氟尿嘧啶總劑量10g；GSSG-Zn20.1-1.0mg/kg/天)，沒有出現(xiàn)并發(fā)癥。患者以令人滿意的狀況出院，作為門診病人繼續(xù)接受治療。用GSSG-Zn2連續(xù)治療3個(gè)月(0.01-0.5mg/kg，靜脈和肌內(nèi)注射，一周兩次)。
6個(gè)月后(1996年9月)按照前述方案進(jìn)行第三期高劑量化療，沒有并發(fā)癥。患者的狀況是令人滿意的，Karnofsky指數(shù)90。食欲良好；沒有惡心或嘔吐；從進(jìn)行觀測(cè)起體重增加了12公斤。胃十二指腸鏡檢查十二指腸粘膜的滲入顯著減少，腫瘤穩(wěn)定未發(fā)展。
因此可得出下列GSSG-Zn2與化療結(jié)合治療的作用生命質(zhì)量改善；疼痛消除；有益的實(shí)驗(yàn)室變化；腫瘤穩(wěn)定；良好的化療耐受性。實(shí)施例#25GSSG系列制劑對(duì)嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥患者的治療作用診斷氣管插管后瘢痕狹窄，氣管食管瘺，右胸膜腔術(shù)后積膿。
患者，男，22歲，1996年3月住進(jìn)俄羅斯聯(lián)邦衛(wèi)生部的肺科學(xué)國家科學(xué)中心外科，之后氣管放入線形斯坦特固定模。當(dāng)其取出后，復(fù)發(fā)氣管狹窄并出現(xiàn)氣管食管瘺跡象。因此于1996年4月進(jìn)行手術(shù)氣管環(huán)狀切除，TE瘺閉合，網(wǎng)膜成形術(shù)。
術(shù)后發(fā)生右側(cè)胸腔積膿。盡管用大量抗菌素治療，解毒和胸膜腔引流，但患者的狀態(tài)仍非常嚴(yán)重?；颊呱n白，脈搏120/分，節(jié)律的，血壓90/50mmHg，呼吸頻率28/分，極輕微的體力勞動(dòng)即導(dǎo)致呼吸困難，體溫38.8-39.6℃。
胸腔X射線左肺由于彌散浸潤(浮腫)而密度降低。在沿肋廓的后部的肋旁和后面的小葉間裂中有許多液體。上部正中陰影增大。
顯著白細(xì)胞增多(30×109/l)，中性白細(xì)胞數(shù)增加，ESR增加(58mm/h)，高轉(zhuǎn)氨酶血癥(見表41)。
由于患者病情嚴(yán)重，肺機(jī)能不全，且沒有任何替代的治療，決定用GSSG的鋰鹽(GSSG-Li2)采用復(fù)合療法進(jìn)行同情治療。
僅第一次注射GSSG-Li2(0.01-0.5mg/kg/天)后就有了一定的陽性效果-中毒減輕(體溫降至37.3℃)，脈搏88/分，肺機(jī)能不全消除。在進(jìn)行了后面的注射(0.01-0.5mg/kg/天，靜脈注射，注射5天)后這種治療產(chǎn)生的陽性效果變得更強(qiáng)。
又用GSSG-Li2(0.01-0.5mg/kg/天)與抗菌素(頭孢氨噻6g/天，氨芐青霉素加苯唑表霉素2g/天)結(jié)合治療一周后，患者的狀態(tài)是令人滿意的。沒有主訴癥狀，脈搏80/分，血壓115/70mmHg，在右邊，在所有區(qū)域，呼吸稍有下降。
胸廓切開術(shù)后沒有局部炎癥。在后來的胸廓切開術(shù)部位的粗糙傷口沒有分泌物。支氣管鏡檢查顯示寬吻合沒有肉芽長出。胸腔X線檢查結(jié)果正常。
用GSSG-Li2(0.01-0.5mg/kg，每?jī)商煲淮?，IV和IM，注射3周)治療一個(gè)月后，患者狀況是令人滿意的。血液參數(shù)在正常限度內(nèi)(表41)。
作用概述化膿過程迅速消退，抗菌治療的作用加強(qiáng)，有益的血液變化，解毒作用，實(shí)驗(yàn)室參數(shù)恢復(fù)。實(shí)施例#26GSSG系列制劑對(duì)多發(fā)性硬化癥患者的治療作用我們檢查并治療了19名年齡在23-52歲間的胸脊椎型多發(fā)性硬化癥(MS)患者(見表42)。所有患者在病情惡化期間住院。按照國際MS研究協(xié)會(huì)推薦的方法(1992)進(jìn)行確診。進(jìn)行性MS患者易復(fù)發(fā)。其中有5個(gè)病人復(fù)發(fā)時(shí)間是一個(gè)月，7個(gè)病人是1-3個(gè)月，7個(gè)病人在3個(gè)月以上。
按照下述方法治療90天1.靜脈注射在10％S-腺苷-甲硫氨酸溶液中的GSSG-Na，每日一次，注射10天，日劑量0.01-0.5mg/kg2.中斷2周3.靜脈注射在10％S-腺苷-甲硫氨酸溶液中的GSSG-Zn，每?jī)商煲淮?，注?0天，日劑量0.01-0.5mg/kg4.中斷2周5.靜脈和肌內(nèi)注射在5％抗壞血酸(維生素C)溶液中的雙-甲硫氨酸-GSSG，兩種給藥途徑交替進(jìn)行(每種一天)，日劑量0.01-0.5mg/kg，注射30天。
在治療前，開始治療和1個(gè)月，開始治療后3和6個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行觀測(cè)。利用單克隆抗體用免疫熒光測(cè)定法測(cè)量外周血中的CD3+，CD4+，CD8+，CD20+淋巴細(xì)胞數(shù)；計(jì)算CD4+/CD8+比值(表43)。利用在神經(jīng)特異性抗原S-100蛋白質(zhì)，神經(jīng)細(xì)胞膜抗原，髓鞘堿性蛋白存在下白細(xì)胞粘著抑制反應(yīng)評(píng)定細(xì)胞免疫(表44)。用25個(gè)血液供體和神經(jīng)根病患者作為對(duì)照組。
免疫系統(tǒng)的初始狀態(tài)以總CD3+數(shù)下降，CD4+數(shù)顯著下降，CD8+數(shù)增加，輔助細(xì)胞的亞群和抑制因子間平衡失調(diào)，CD20+數(shù)增加為特征。
治療后細(xì)胞免疫參數(shù)有顯著改善CD3+(總T細(xì)胞)，CD4+(T輔助細(xì)胞)，CD8+(T抑制因子)細(xì)胞數(shù)正常化。同時(shí)，淋巴細(xì)胞對(duì)一種或多種腦組織抗原的敏感性下降。還有S-100和髓鞘堿性蛋白濃度的免疫學(xué)倒位現(xiàn)象(表44)。84％的患者中，免疫系統(tǒng)的恢復(fù)伴隨有神經(jīng)學(xué)癥狀的消除。
測(cè)定患者血清和腦脊液(CSF)中的IFNα和γ以及TNF的內(nèi)源性濃度(表45)。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是患者治療期間，IFNα增加了。通過Kurtzke評(píng)分測(cè)定與神經(jīng)喪失有關(guān)的TNF濃度。
利用下列參數(shù)評(píng)定體液免疫通過在免疫熒光試驗(yàn)中測(cè)定表面免疫球蛋白來計(jì)算B-淋巴細(xì)胞數(shù)，用在凝膠中的自由基免疫擴(kuò)散測(cè)定IgA，IgM，IgG濃度，循環(huán)免疫復(fù)合體在聚乙二醇(polyethilenglycole)中沉淀(表46)。治療前所有患者的循環(huán)免疫復(fù)合體和IgM顯著增加，IgG減少。IgG濃度顯著低于對(duì)照組。
在這一治療期間，所有患者的神經(jīng)學(xué)狀況都有或多或少的改善，Hauzer的運(yùn)動(dòng)指數(shù)下降，生命質(zhì)量改善。
盡管已顯示和描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但仍可能做許多改進(jìn)。例如，其他不會(huì)影響GSSG衍生物和/或二者的增量劑，和/或增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑作用的成分也可與單獨(dú)的GSSG混合或與其增量劑，和增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑結(jié)合應(yīng)用于機(jī)體?？蓪┬团c任何類型的注射器或涂藥器一起包裝成套。優(yōu)選將對(duì)特定疾病的使用說明包括在任何成套品中，包括治療劑。我們?cè)谙旅嬷赋隽擞谢驔]有增量劑，和增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑的GSSG或/和其衍生物的優(yōu)選應(yīng)用，對(duì)于GSSG和其鹽來說，劑型為0.01-0.5mg GSSG基/kg體重(對(duì)于GSSG衍生物來說為0.01-1.0mg/kg)，靜脈、肌內(nèi)、內(nèi)淋巴、表皮或腔內(nèi)應(yīng)用一天或多天，直到6個(gè)月已發(fā)現(xiàn)下列對(duì)疾病的效果本發(fā)明方法和治療劑的預(yù)防、治療用途可用于個(gè)體因接觸放射性和在意外情況下的化學(xué)損害如核災(zāi)難而導(dǎo)致的免疫缺陷狀態(tài)。
此處已提到了多種增量劑和多種增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑，也可使用其他能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的特定增量劑，或/和其他能有益地改變GSSG/衍生物作用的特定增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑。在某些情況下，一種或多種不同的增量劑和不同的增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑可結(jié)合使用。
胃腸外使用的藥物優(yōu)選用溶液形式，在某些情況下可使用膠體懸液等。與此相似，局部應(yīng)用可以包括使用藥學(xué)上可接受的油膏，霜和其他不會(huì)與GSSG/衍生物以及與增量劑和增強(qiáng)劑/調(diào)節(jié)劑相互作用的基質(zhì)如凡士林基質(zhì)。這樣的基質(zhì)是本領(lǐng)域中已知的(凡士林，羊毛脂，鯨蠟，特別是乙酰水楊酸)。
傳染性和免疫病理學(xué)疾病注意下面給出的給藥方案中的所有劑量是以GSSG和其鹽作為“GSSG基”表示的。因?yàn)椤癎SSG基”的概念對(duì)于GSSG衍生物來說并不完全正確，因此合適的定義是一般對(duì)應(yīng)的GSSG衍生物的劑量應(yīng)該是在GSSG較低濃度到GSSG和其鹽的上限2-3倍的濃度之間。
AIDS給藥量—5-30mg/天，整個(gè)過程持續(xù)6個(gè)月，每個(gè)月后中斷兩周；—第1周的給藥方案是每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射；—第二周一天兩次一次靜脈注射(早晨)，另一次肌內(nèi)注射(晚上)；—第三和第四周一周三次第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；在腦病的情況下，推薦用藥劑進(jìn)行腰部注射，一周一次，注射三周。
肝炎給藥量—5-10mg/天，整個(gè)過程1-2個(gè)月；—頭三周每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射；—之后一周注射2-3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；皰疹給藥過程與肝炎的相同。
結(jié)核病非活動(dòng)期給藥量—5-10mg/天，整個(gè)過程6個(gè)月，每個(gè)月后中斷兩周，給藥三個(gè)月后中斷一個(gè)月?！^三周每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射；—第四周一周注射2-3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；活動(dòng)期給藥量—5-10mg/天，整個(gè)過程6個(gè)月，活動(dòng)期的給藥方案與非活動(dòng)期相同。
腦膜炎給藥量—5-90mg/天，整個(gè)過程2個(gè)月；—頭兩周一天兩次一次靜脈注射(早晨)，另一次肌內(nèi)注射(晚上)；—之后一周注射2-3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；藥劑腰部注射-推薦一天注射一次，注射3天。
腹膜炎給藥過程與腦膜炎的相同(除了腰部注射)。
膿毒癥給藥量—5-60mg/天，整個(gè)過程不少于1個(gè)月，直到臨床狀態(tài)和血液數(shù)據(jù)完全正?；?；—頭2或3周一天兩次一次靜脈注射(早晨)，另一次肌內(nèi)注射(晚上)；—之后一周注射2-3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；化膿性術(shù)后感染并發(fā)癥給藥過程與膿毒癥相同。
免疫抑制給藥量—5-20mg/天，整個(gè)過程持續(xù)6個(gè)月，每個(gè)月后中斷兩周；—頭三周每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射；—第四周一周注射2-3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；感染、輻射或毒性起因的免疫缺陷給藥量—5-30mg/天，給藥過程與免疫抑制相同。
多發(fā)性硬化癥給藥量—5-20mg/天，整個(gè)過程持續(xù)3個(gè)月，每個(gè)月后中斷兩周，第6個(gè)月中斷后重復(fù)整個(gè)過程；—整個(gè)過程的第1個(gè)月每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射；—整個(gè)過程的第2個(gè)月一周注射3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；—整個(gè)過程的第3個(gè)月一周兩次肌內(nèi)注射，劑量為5-10mg。
神經(jīng)變性疾病給藥過程與多發(fā)性硬化癥相同。
Alzheimer’s硬化癥給藥過程與多發(fā)性硬化癥相同。
肌萎縮性側(cè)索硬化癥給藥過程與多發(fā)性硬化癥相同。
腎小球性腎炎給藥量—5-30mg/天，整個(gè)過程持續(xù)1-3個(gè)月，每個(gè)月后中斷兩周，—頭兩周每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射；—之后一周注射2-3次，第一次靜脈注射，第二和第三次肌內(nèi)注射；膠原性疾病給藥過程與腎小球性腎炎相同。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎給藥過程與腎小球性腎炎相同。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡給藥過程與腎小球性腎炎相同。
過敏性疾病給藥過程與腎小球性腎炎相同，同時(shí)局部應(yīng)用油膏(含有1-3％活性化合物)-用兩周，每日一次，之后一周用兩次。
牛皮癬給藥過程與腎小球性腎炎相同，同時(shí)局部應(yīng)用油膏(含有1-3％活性化合物)—用兩周，每日一次，之后一周用兩次。
腫瘤給藥量—5-90mg/天，整個(gè)過程持續(xù)1-6個(gè)月，每個(gè)月后中斷2-4周；—每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射，不進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行內(nèi)淋巴應(yīng)用(給藥量—30-90mg/天)10天，和利用導(dǎo)管插入術(shù)局部應(yīng)用(區(qū)域灌注) (給藥量—30-90mg/天)7天，每周3或4次；—推薦治療方案與綜合化學(xué)治療一起進(jìn)行。
轉(zhuǎn)移瘤發(fā)展和生血組織增生給藥量—5-90mg/天，整個(gè)過程持續(xù)1-6個(gè)月，每個(gè)月后中斷2-4周；—每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射，同時(shí)利用導(dǎo)管插入術(shù)局部應(yīng)用(區(qū)域灌注) (給藥量—30-90mg/天)7天，每周3或4次。
淋巴組織增生疾病(淋巴肉芽腫病和淋巴瘤)給藥量—5-90mg/天，整個(gè)過程持續(xù)1-6個(gè)月，每個(gè)月后中斷2-4周；—頭三周每日注射一次，交替進(jìn)行一天靜脈注射，每隔一天肌內(nèi)注射，同時(shí)頭10天進(jìn)行內(nèi)淋巴應(yīng)用(給藥量—30-90mg/天)；—之后相同的治療方案結(jié)合糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞生長抑制劑。參考文獻(xiàn)1.Holmlund J.T.細(xì)胞因子。癌癥化療生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物1993.14P150-206。
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表1.體外GSSG對(duì)人單核白細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響(M±m(xù))
與對(duì)照相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.01)。
表2.體外與0.003％過氧化氫結(jié)合的GSSG對(duì)人單核白細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響(M±m(xù))
與對(duì)照相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.01)。
表3.體外與0.1％肌苷結(jié)合的GSSG對(duì)人單核白細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響(M±m(xù))
(*)-與對(duì)照相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.01)。
表4.體外與0.1％胱胺結(jié)合的GSSG對(duì)人單核白細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響(M±m(xù))
(*)-與對(duì)照相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.01)。表5.測(cè)試品對(duì)環(huán)磷酰胺處理過的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF，骨髓和血細(xì)胞指數(shù)，以及對(duì)SRBC的免疫應(yīng)答的影響(M±m(xù))
與(*)-整體動(dòng)物組；(#)-對(duì)照組(CP+生理鹽水)；(@)-用GSH處理的動(dòng)物組，相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。表6.與0.1％肌苷結(jié)合的GSSG對(duì)環(huán)磷酰胺處理過的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF，骨髓和血細(xì)胞指數(shù)，以及對(duì)SRBC的免疫應(yīng)答的影響(M±m(xù))
與(*)-整體動(dòng)物組；(#)-對(duì)照組(CP+生理鹽水)；(@)-用GSH處理的動(dòng)物組，相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。表7.與0.1％胱胺結(jié)合的GSSG對(duì)環(huán)磷酰胺處理過的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF，骨髓和血細(xì)胞指數(shù)，以及對(duì)SRBC的免疫應(yīng)答的影響(M±m(xù))
與(*)-整體動(dòng)物組；(#)-對(duì)照組(CP+生理鹽水)；(@)-用GSH處理的動(dòng)物組，相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。表8.測(cè)試品對(duì)照射過的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF，骨髓、脾和血細(xì)胞指數(shù)，以及骨髓和脾的連血集落形成能力的影響(M±m(xù))
與(*)-整體動(dòng)物組；(#)-對(duì)照組(CP+生理鹽水)；(@)-用GSH處理的動(dòng)物組，相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。
表9.與0.1％胱胺結(jié)合的GSSG對(duì)照射過的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF，骨髓、脾和血細(xì)胞指數(shù)，以及骨髓和脾的造血集落形成能力的影響(M±m(xù))
與(*)-整體動(dòng)物組；(#)-對(duì)照組(CP+生理鹽水)；(@)-用GSH處理的動(dòng)物組，相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。表10.與0.1％肌苷結(jié)合的GSSG對(duì)照射過的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和GM-CSF，骨髓、脾和血細(xì)胞指數(shù)，以及骨髓和脾的造血集落形成能力的影響(M±m(xù))
與(*)-整體動(dòng)物組；(#)-對(duì)照組(CP+生理鹽水)；(@)-用GSH處理的動(dòng)物組，相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。
表11.測(cè)試品在96小時(shí)培養(yǎng)過程中對(duì)每孔中正常淋巴細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞)的影響(M±m(xù))
與10％胎牛血清相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。
表12.測(cè)試品在96小時(shí)培養(yǎng)過程中對(duì)每孔中HL-60細(xì)胞數(shù)(×104細(xì)胞)的影響(M±m(xù)
與10％胎牛血清相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.05)。
表13.測(cè)試品對(duì)用白血病L1210細(xì)胞接種的小鼠的細(xì)胞因子血清濃度，腹水的積累以及平均存活時(shí)間的影響(M±m(xù))
與對(duì)照組相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.05)
表13(續(xù))
與對(duì)照組相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.05)
表14.測(cè)試品對(duì)用白血病P388細(xì)胞接種的小鼠的細(xì)胞因子血清濃度，腹水的積累以及平均存活時(shí)間的影響(M±m(xù))
與對(duì)照組相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.05)
表14(續(xù)
與對(duì)照組相比差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.05)
表15.測(cè)試品對(duì)72小時(shí)培養(yǎng)期間REF細(xì)胞數(shù)(×103細(xì)胞)的影響(M+m)
表16.測(cè)試品對(duì)72小時(shí)培養(yǎng)過程中e-ras細(xì)胞的克隆數(shù)的影響(M+m)
相對(duì)強(qiáng)度 相對(duì)強(qiáng)度相對(duì)強(qiáng)度表17.測(cè)試品對(duì)UV-照射后72小時(shí)培養(yǎng)過程中REF細(xì)胞(×103細(xì)胞)數(shù)的影響(M+m)
表18.測(cè)試品對(duì)UV-照射后72小時(shí)培養(yǎng)過程中e-ras細(xì)胞的克隆數(shù)的影響(M+m)
<p>表19.測(cè)試品對(duì)用白血病L1210細(xì)胞接種的小鼠的腹水積累和平均存活時(shí)間的影響(M+m)
表20.測(cè)試品對(duì)用Erlich腺癌細(xì)胞接種的小鼠的腹水積累和平均存活時(shí)間的影響(M+m
<p>表21.測(cè)試品對(duì)用白血病P388細(xì)胞接種的小鼠的腹水積累和平均存活時(shí)間的影響(M±m(xù))
表22.實(shí)驗(yàn)過程中的動(dòng)物死亡率
表23.神經(jīng)學(xué)癥狀的程度(評(píng)分)
表24.EAE豚鼠的血液淋巴細(xì)胞在RILA中對(duì)腦抗原的致敏參數(shù)(％，用測(cè)試品治療前/后)
表25.EAE豚鼠的血淋巴細(xì)胞在RILM中對(duì)腦抗原的致敏的參數(shù)(遷移指數(shù)，用測(cè)試品治療前/后)
表26.GSSG靜脈給藥對(duì)癌癥患者的細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素血清濃度的影響
表27.GSSG對(duì)結(jié)腸直腸癌和化療導(dǎo)致血液抑制的患者的血液指數(shù)，細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素血清濃度和免疫學(xué)參數(shù)的影響
<p>表28.GSSG對(duì)AIDS和隱球菌腦膜炎患者的血液指數(shù)，細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素血清濃度，和免疫學(xué)參數(shù)的影響
表29.GSSG對(duì)AIDS和等孢子球蟲病患者的血液指數(shù)，細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素血清濃度，和免疫學(xué)參數(shù)的影響
<p>表30.GSSG對(duì)再生不良性貧血和各類血細(xì)胞減少患者的血液指數(shù)，紅細(xì)胞生成素血清濃度的影響
表31.Glutamed MF-R-30對(duì)胃癌、腹膜轉(zhuǎn)移癌、腹水和脾腫大患者的血液和免疫學(xué)指數(shù)以及細(xì)胞因子濃度的影響
表32.GSSG對(duì)皮膚癌(默克爾細(xì)胞癌)，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和化療導(dǎo)致血液及免疫抑制患者的血液和免疫學(xué)及細(xì)胞因子濃度的影響
表33.開始用GSSG系列制劑進(jìn)行治療后24天中的血液學(xué)，免疫學(xué)，血清學(xué)和生化參數(shù)的變化
表34.用GSSG系列制劑治療1個(gè)和2個(gè)療程后的血液學(xué)，免疫學(xué)，血清學(xué)和生化參數(shù)的變化
表35.血液學(xué)和血液化學(xué)指數(shù)的變化
<p>表36.胰腺癌患者在整個(gè)觀測(cè)期間的實(shí)驗(yàn)室指數(shù)
表37.青少年糖尿病患者的血液學(xué)，血液化學(xué)和免疫學(xué)參數(shù)
表38.肺癌患者在整個(gè)觀測(cè)期間的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)
表39.乙狀結(jié)腸癌患者在整個(gè)觀測(cè)期間的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)<
<p>表40.胰腺/十二指腸癌患者在整個(gè)觀測(cè)期間的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)
表41.嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥患者的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)
表43.MS患者用GSSG系列制劑進(jìn)行治療期間T和B淋巴細(xì)胞數(shù)的平均值變化<
表44.MS患者的血液淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞的粘著抑制反應(yīng)中對(duì)腦組織抗原的致敏的參數(shù)(％)
權(quán)利要求
1.刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的方法，包含向需要刺激細(xì)胞因子或造血因子或二者都需要的哺乳動(dòng)物體內(nèi)加入有效量的選自下列成員的氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽，藥學(xué)上可接受的氧化型谷胱甘肽鹽，藥學(xué)上可接受的谷胱甘肽衍生物或其混合物，持續(xù)一段時(shí)間以刺激所述內(nèi)源性產(chǎn)生從而得到治療作用。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述谷胱甘肽是胃腸外加入的。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述谷胱甘肽是局部加入的。
4.按照權(quán)利要求1的方法。其中所述谷胱甘肽是與所述氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽形式、和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物的半衰期的增量劑一起加入的。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述谷胱甘肽是與所述谷胱甘肽的生物學(xué)或治療作用的增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑一起加入的。
6.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述增量劑選自下列成員助氧劑化合物，能形成穩(wěn)定氧化型谷胱甘肽分子的弱離子鍵或配位鍵的試劑，作為由谷胱甘肽還原酶催化的氧化型谷胱甘肽的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-依賴性還原為還原型谷胱甘肽的還原型競(jìng)爭(zhēng)劑的物質(zhì)，能對(duì)葡糖-6-磷酸脫氫酶或其他還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-依賴性酶催化的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸產(chǎn)生可逆抑制的化合物，或其混合物。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述增量劑是過氧化物。
8.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述增量劑是抗壞血酸。
9.按照權(quán)利要求9的方法，其中所述增量劑是二甲基亞砜。
10.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述增量劑是肌苷。
11.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述胱胺。
12.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑選自下列成員甲基供體，和典型的胞內(nèi)氧還-氧化對(duì)，或其混合物。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是膽堿-氯化物。
14.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是S-腺苷-甲硫氨酸。
15.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是硫辛酸。
16.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是葉酸。
17.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述谷胱甘肽劑型是以對(duì)氧化型谷胱甘肽基和氧化型谷胱甘肽鹽來說0.01-0.5mg氧化型谷胱甘肽基/kg體重(對(duì)氧化型谷胱甘肽衍生物來說0.01-1.0mg/kg)的劑量加入的，至少每24小時(shí)一次，直到得到所述的治療作用。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述谷胱甘肽劑型是以對(duì)氧化型谷胱甘肽基和氧化型谷胱甘肽鹽來說0.01-2.0％重量氧化型谷胱甘肽基(對(duì)氧化型谷胱甘肽衍生物來說0.01-4.0％重量)濃度的藥學(xué)上可接受的溶液胃腸外給予的。
19.按照權(quán)利要求18的方法，其中所述溶液進(jìn)一步包括，或與選自下列成員的增量劑結(jié)合給藥0.03-0.0003％(w/v)過氧化氫，0.1-10％(w/v)抗壞血酸，0.1-30％(v/v)二甲基亞砜，0.1-5％(w/v)肌苷，0.1-3％(w/v)胱胺，或其混合物。
20.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物需要刺激細(xì)胞因子或造血因子產(chǎn)生以治療選自下列成員的病情腫瘤，感染，血液學(xué)、免疫學(xué)(局部缺血的，營養(yǎng)不良的，變性的)以及其他疾病。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病是感染。
22.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病是血液病。
23.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病是免疫病。
24.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病是腫瘤。
25.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病選自下列成員AIDS，肝炎，皰疹，結(jié)核病，胸膜炎，腹膜炎，膿毒癥，和感染導(dǎo)致的化膿性術(shù)后并發(fā)癥。
26.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病選自下列成員免疫抑制，多發(fā)性硬化癥，Alzheimer硬化癥，神經(jīng)變性疾病，肌萎縮性側(cè)索硬化癥，腎小球性腎炎，膠原性疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡，牛皮癬，糖尿病和過敏性疾病。
27.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病選自下列成員轉(zhuǎn)移瘤擴(kuò)散，生血組織增殖，惡性腫瘤，淋巴肉芽腫和淋巴瘤，放射性或化學(xué)原因?qū)е碌拿庖呷毕荨?br>
28.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述氧化型谷胱甘肽是鹽形式的。
29.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽是二鈉鹽。
30.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽是二鋰鹽。
31.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽含有一個(gè)或多個(gè)鉀原子。
32.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽含有一個(gè)或多個(gè)鈣原子。
33.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽含有一個(gè)或多個(gè)鋅原子。
34.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽含有一個(gè)或多個(gè)鉬原子。
35.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽含有一個(gè)或多個(gè)釩原子。
36.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽含有一個(gè)或多個(gè)氟原子。
37.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中將氧化型谷胱甘肽的藥學(xué)上可接受的衍生物加入需要刺激細(xì)胞因子或造血因子或二者的哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
38.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化型谷胱甘肽衍生物是與半胱胺共價(jià)結(jié)合的氧化型谷胱甘肽(S-硫乙胺-二硫化谷胱甘肽)。
39.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化型谷胱甘肽衍生物是與硫辛酸共價(jià)結(jié)合的氧化型谷胱甘肽(雙-[6，8-硫辛基]二硫化谷胱甘肽)。
40.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化型谷胱甘肽衍生物是與肌肽共價(jià)結(jié)合的([b-丙氨酰-組氨酸]二硫化谷胱甘肽)和與腺苷共價(jià)結(jié)合的([9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤]二硫化谷胱甘肽)。
41.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化型谷胱甘肽衍生物是與甲硫氨酸共價(jià)結(jié)合的(雙-[2-氨基-4-[甲硫基]丁酰]二硫化谷胱甘肽)。
42.用于治療腫瘤、感染、血液學(xué)、免疫學(xué)和其他疾病的治療劑，在這些疾病的治療中刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生被認(rèn)為是有益的，所述治療劑包含有效量的作為活性物質(zhì)的氧化型谷胱甘肽，和/或藥學(xué)上可接受的鹽，和/或藥學(xué)上可接受的衍生物，所述氧化型谷胱甘肽，三肽，y-谷氨?；?半胱氨酰-甘氨酸，其中兩個(gè)三肽分子是經(jīng)半胱氨酸殘基間的共價(jià)二硫鍵連接的，和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
43.按照權(quán)利要求42的治療劑，其中所述物質(zhì)用藥學(xué)上可接受的溶劑配制成氧化型谷胱甘肽，和/或藥學(xué)上可接受的鹽，和/或藥學(xué)上可接受的衍生物的無菌可注射溶液的形式。
44.按照權(quán)利要求43的治療劑，其與能通過延長氧化型谷胱甘肽的半衰期而增強(qiáng)和延長所述制劑的治療作用的藥學(xué)上可接受的增量劑結(jié)合。
45.按照權(quán)利要求44的治療劑，其中所述增量劑是過氧化氫。
46.按照權(quán)利要求44的治療劑，其中所述增量劑是抗壞血酸。
47.按照權(quán)利要求44的治療劑，其中所述增量劑是二甲基亞砜。
48.按照權(quán)利要求44的治療劑，其中所述增量劑是肌苷。
49.按照權(quán)利要求44的治療劑，其中所述增量劑是胱胺。
50.按照權(quán)利要求43的治療劑，其與能利用除延長氧化型谷胱甘肽半衰期外的其他機(jī)理來增強(qiáng)和/或有益改變所述制劑的治療作用的藥學(xué)上可接受的增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑結(jié)合。
51.按照權(quán)利要求50的治療劑，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是膽堿-氯化物。
52.按照權(quán)利要求50的治療劑，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是S-腺苷-甲硫氨酸。
53.按照權(quán)利要求50的治療劑，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是硫辛酸。
54.按照權(quán)利要求50的治療劑，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是葉酸。
55.增強(qiáng)和延長氧化型谷胱甘肽，和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物的能力來刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的方法，其中氧化型谷胱甘肽，和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物是以含有至少一種其他藥學(xué)上可接受的成分的藥物組合物形式使用的，或者與這樣的成分結(jié)合給藥，所述方法包括得到氧化型谷胱甘肽，和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物的溶液，將其與增量劑混合，所述增量劑選自下列成員活性氧中間體供體，能形成使氧化型谷胱甘肽分子穩(wěn)定的弱離子鍵和/或配位鍵的試劑，次黃嘌呤衍生物，葡萄糖氧化的戊糖磷酸途徑的可逆抑制劑，或其混合物。
56.按照權(quán)利要求55的方法，其中所述增量劑是過氧化氫。
57.按照權(quán)利要求55的方法，其中所述增量劑是抗壞血酸。
58.按照權(quán)利要求55的方法，其中所述增量劑是二甲基亞砜。
59.按照權(quán)利要求55的方法，其中所述增量劑是肌苷。
60.按照權(quán)利要求55的方法，其中所述增量劑是胱胺。
61.增強(qiáng)和/或有益調(diào)節(jié)氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物的能力來刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的方法，其中氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物是以含有至少一種除了能延長氧化型谷胱甘肽半衰期的成分以外的其他藥學(xué)上可接受的成分的藥物組合物形式使用的，或者與這樣的成分結(jié)合給藥，所述方法包括得到氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物的溶液，并將其與增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑混合或結(jié)合給藥，所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑選自下列成員甲基供體，典型的胞內(nèi)氧還-氧化對(duì)，或其混合物。
62.按照權(quán)利要求61的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是膽堿-氯化物。
63.按照權(quán)利要求61的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是S-腺苷-甲硫氨酸。
64.按照權(quán)利要求61的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是硫辛酸。
65.按照權(quán)利要求61的方法，其中所述增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是葉酸。
66.利用氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物，所述氧化型谷胱甘肽是還原型谷胱甘肽的遮蔽物，結(jié)構(gòu)為y-谷氨?；?半胱氨酰-甘氨酸的三肽，其中該三肽的兩個(gè)分子是經(jīng)半胱氨酸殘基間的共價(jià)二硫鍵連接的，作為細(xì)胞因子和/或造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的激活劑來制備用于治療腫瘤，感染，血液學(xué)，免疫學(xué)和其他疾病的藥劑的方法，在這些疾病的治療中刺激內(nèi)源性細(xì)胞因子和/或造血因子產(chǎn)生被認(rèn)為是有益的。
67.刺激細(xì)胞因子和造血因子產(chǎn)生的方法，包括向需要刺激細(xì)胞因子或造血因子或二者的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中加入有效量的氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物，持續(xù)一段時(shí)間以刺激所述內(nèi)源性產(chǎn)生從而得到治療作用。
68.按照權(quán)利要求67的方法，其中所述細(xì)胞在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所述氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物加入所述機(jī)體的劑量為對(duì)氧化型谷胱甘肽基和氧化型谷胱甘肽鹽來說為0.01-0.5mg氧化型谷胱甘肽基/kg體重(對(duì)氧化型谷胱甘肽衍生物來說0.01-1.0mg/kg)，一天至少一次，至少給予一天。
69.按照權(quán)利要求68的方法，其中所述藥物是以可注射溶液形式加入所述機(jī)體的，其中所述氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物是以對(duì)氧化型谷胱甘肽基和氧化型谷胱甘肽鹽來說0.01-2.0％氧化型谷胱甘肽基重量(對(duì)氧化型谷胱甘肽衍生物來說0.01-4.0％)的濃度存在于這樣的溶液中的。
70.按照權(quán)利要求69的方法，其中所述可注射藥物溶液包含選自下列成員的增量劑過氧化氫，抗壞血酸，二甲基亞砜，肌苷和胱胺；或者這樣的增量劑是分開給藥的。
71.按照權(quán)利要求69的方法，其中所述可注射藥物溶液包含選自下列成員的增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑膽堿-氯化物，S-腺苷-甲硫氨酸，硫辛酸或葉酸；或者這樣的增強(qiáng)劑/有益調(diào)節(jié)劑是分開給藥的。
72.按照權(quán)利要求67的方法，其中所述細(xì)胞在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，所述氧化型谷胱甘肽和/或其藥學(xué)上可接受的鹽，和/或其藥學(xué)上可接受的衍生物是以對(duì)氧化型谷胱甘肽基和其鹽來說0.01-0.5mg氧化型谷胱甘肽基/m2局部面積(對(duì)氧化型谷胱甘肽衍生物來說0.01-1.0mg/m2)的劑量局部應(yīng)用到局部面積上的。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué),特別是藥理學(xué)和治療方法。按照本發(fā)明,刺激細(xì)胞因子和造血因子內(nèi)源性產(chǎn)生的方法包括向需要刺激細(xì)胞因子或造血因子或兩者都需要的哺乳動(dòng)物體內(nèi)加入有效量的氧化型谷胱甘肽,其藥學(xué)上可接受的鹽形式,或/和其藥學(xué)上可接受的衍生物,持續(xù)一段時(shí)間以刺激所述內(nèi)源性產(chǎn)生,從而得到治療作用,其中所述氧化型谷胱甘肽,或/和其藥學(xué)上可接受的鹽形式,或/和其藥學(xué)上可接受的衍生物是胃腸外或局部加入的。按照本發(fā)明,氧化型谷胱甘肽,或/和其藥學(xué)上可接受的鹽形式,或/和其藥學(xué)上可接受的衍生物是與所述氧化型谷胱甘肽或/和其藥學(xué)上可接受的鹽形式、或/和其藥學(xué)上可接受的衍生物的半衰期的增量劑一起加入的。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1207683SQ96199640
公開日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1996年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月14日
發(fā)明者M·B·巴拉佐夫斯基, L·A·科茲密亞金 申請(qǐng)人:M·B·巴拉佐夫斯基, L·A·科茲密亞金