專利名稱：具有造血刺激和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子ck－h(huán)a及其變異體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的細(xì)胞因子及其變異體的核酸編碼序列及氨基酸序列，攜帶這種細(xì)胞因子核酸序列的載體，表達(dá)該細(xì)胞因子的宿主細(xì)胞，含有該細(xì)胞因子的藥物組合物，以及細(xì)胞因子在制備治療造血系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病的藥物組合物中的用途。
細(xì)胞因子是由機(jī)體內(nèi)細(xì)胞合成并分泌的、參與多種細(xì)胞的增殖分化，在機(jī)體的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用的小分子多肽的總稱。細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素、集落刺激因子、干擾素、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子等。細(xì)胞因子具有等多種生理功能它們可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，參與刺激造血干細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管生成、在抗腫瘤和抗微生物感染方面也具有重要意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對細(xì)胞因子及其受體的結(jié)構(gòu)功能，細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)和表達(dá)調(diào)控有了更深入的了解，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組的細(xì)胞因子或其拮抗劑已經(jīng)作為藥物用于臨床，并取得良好療效。例如髓樣造血祖細(xì)胞抑制因子(MPIF-1)作為造血保護(hù)劑被用于腫瘤的大劑量放、化療中，有望成為新一代的生物工程藥物(Marshall A，HGS Launches“first”genomics product in clinic.NatBiotechnol 1998，16129)。這提示細(xì)胞因子在腫瘤、造血功能障礙性疾病、自身免疫性疾病等疑難病癥的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
細(xì)胞因子CK-HA(Chemokine Homologue 1，簡稱CK-HA)基因與已知基因的核苷酸序列無明顯的同源性。本發(fā)明人在原核和真核細(xì)胞中成功地表達(dá)了該多核苷酸編碼的的CK-HA、B多肽。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供編碼細(xì)胞因子CK-HA、B的多核苷酸序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供帶有CK-HA、B核酸序列的載體。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供經(jīng)攜帶CK-HA、B核酸序列的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)過的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供用基因工程手段生產(chǎn)CK-HA、B成熟多肽的方法。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供細(xì)胞因子CK-HA、B的氨基酸序列。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供含有CK-HA、B的藥物組合物。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供CK-HA、B在制備具有造血刺激活性和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明人從cDNA文庫中得到的核酸序列，通過表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression Sequence Tag，簡稱EST)分析(ttp//www.tigenm.it)，得到了全長的cDNA序列，通過設(shè)計(jì)上、下游引物P1(5’-GCG ATC CAA AGA GCG CGT-3’)和P2(5’-TCT CGA TAA AAG CAG CAG CCC-3’)從正常成人的cDNA文庫中擴(kuò)增，分離并克隆出細(xì)胞因子CK-HA、B的基因(Chemokine Homologue A、B，以下簡稱CK-HA、B)。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明公開了CK-HA的和CK-HB的核酸序列。CK-HA與CK-HB分別編碼具有149個(gè)氨基酸和94個(gè)氨基酸的成熟多肽，分別如SEQ ID NO2與SEQ ID NO4所示。
CK-HA的核酸序列如SEQ ID NO1所示，全長603個(gè)核苷酸，編碼區(qū)為第1-450位核苷酸。CK-HB的核酸序列如SEQ ID NO3所示，全長587個(gè)核苷酸，編碼區(qū)為第1-285位核苷酸。除缺失16個(gè)核苷酸外，CK-HB的其它序列(SEQ ID NO3)與CK-HA的序列(SEQ ID NO1)完全相同，缺失的16個(gè)核苷酸相當(dāng)于SEQ ID NO1的第280-295位，缺失的出現(xiàn)導(dǎo)致SEQ ID NO3中提前出現(xiàn)終止密碼子。故SEQ ID NO3可視作SEQ ID NO1的變異體，差別的產(chǎn)生可能是不同的mRNA剪切造成的。
本發(fā)明所述的核酸序列可以是RNA、cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈。
細(xì)胞因子CK-HA、B的核酸序列最好以分離形式提供，分離的核酸序列可以只包括成熟多肽的編碼序列，也可以包括成熟多肽的編碼序列和附加編碼序列，還可以包括成熟多肽的編碼序列和非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5′或3′端的非編碼序列等。CK-HA、B的編碼序列可以完全相同于SEQ ID NO1或SEQ IDNO3所示的編碼序列。此外由于遺傳密碼的簡并性，它可以不同于SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼與SEQ ID NO2所示之多肽具有相同氨基酸序列的核酸片段、類似物及衍生物、及變異體。變異體可以是天然存在的等位基因變異體、mRNA不同剪切變異體或非天然存在的變異體。變異體也可以是編碼與SEQID NO2所示多肽有相同或相似生物學(xué)活性的多肽的缺失變異體、取代變異體及加入(插入)變異體。所說的等位變異體可以帶有核苷酸取代、插入或加入，但實(shí)質(zhì)上沒有改變所編碼之多肽的功能的多核苷酸的可替代形式。核酸變異變異體的編碼產(chǎn)物可以在功能上與本發(fā)明的CK-HA相同、相似或不同。
本發(fā)明全長基因的小片段可以作為雜交探針，從cDNA文庫中分離全長序列及與本發(fā)明CK-HA、B基因有高度同源性的核酸序列。探針一般至少有30個(gè)堿基，也可含有50個(gè)以上的堿基。可以用探針鑒定相當(dāng)于全長度轉(zhuǎn)導(dǎo)物和含有完整基因之基因組克隆的cDNA克隆。方法包括根據(jù)已知DNA序列合成寡核苷酸探針，并在雜交條件下使用含有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)之DNA序列的標(biāo)記的寡核苷酸與人cDNA基因組DNA或RNA庫雜交，從中分離出文庫中與探針雜交所需要的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及與CK-HA、B的基因序列至少有80％，較好90％，最好95％同源性的多核苷酸序列。特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述CK-HA、B基因雜交的多核苷酸，所說的“嚴(yán)格條件”意指發(fā)生雜交的前提是序列間至少具備95％的同源性。這樣的序列可以是天然存在或人工產(chǎn)生的，可以包括CK-HA、B核酸序列的等位基因變異體、也可以包括CKLFH1核酸序列中堿基的缺失、插入及置換。這樣的序列編碼的多肽可以在功能上與本發(fā)明的CK-HA、B相同、相似、或不同，但最好是編碼與CK-HA、B生物學(xué)活性基本相同的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，本發(fā)明公開了攜帶上述多核苷酸的載體，可將所說的多核苷酸插入到各種用于表達(dá)該多肽的適當(dāng)表達(dá)載體中。這樣的載體包括染色體、非染色體來源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、噬菌體(由質(zhì)粒和噬菌體DNA組合體衍生的載體)、以及病毒(如桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，條件是這些載體能夠在所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制并存活。
可用各種已知的方法將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入到載體的適當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)中。插入到表達(dá)載體中的DNA序列被可操作地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列即啟動(dòng)子，以指導(dǎo)mRNA合成。這樣的啟動(dòng)子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體λPL啟動(dòng)子及在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的其他啟動(dòng)子。
此外，表達(dá)載體可含有啟動(dòng)翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止子，并含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)志基因，以提供被轉(zhuǎn)化之宿主細(xì)胞的可選擇表型特征，如適用于真核細(xì)胞的新霉素抗性或二氫葉酸還原酶基因，或適用于大腸桿菌中的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性基因。
必要時(shí)，為了提高編碼本發(fā)明多肽的DNA在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄效率，可在載體中插入增強(qiáng)子序列。增強(qiáng)子一般是約含10-300個(gè)堿基對并作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)DNA轉(zhuǎn)錄的順式作用元件。另外，必要時(shí)也可在啟動(dòng)子和下游結(jié)構(gòu)序列之間插入一個(gè)能指導(dǎo)翻譯產(chǎn)物向周質(zhì)或細(xì)胞外培養(yǎng)基中分泌的前導(dǎo)序列(分泌信號(hào))?；蛘撸筛鶕?jù)需要導(dǎo)入編碼融合蛋白質(zhì)的異源DNA序列，所說的融合蛋白可包括一個(gè)賦予所需特征，如用于穩(wěn)定被表達(dá)之產(chǎn)物的或簡化其純化步驟的N未端識(shí)別肽。
具體地說，適用于原核細(xì)胞的市售表達(dá)載體一般均帶有可選擇標(biāo)志和細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)，帶有l(wèi)acI、T7、λPL和trp等細(xì)菌啟動(dòng)子，以及已知克隆載體pBR322(ATCC37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根據(jù)所選用的適當(dāng)啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因序列來選擇衍生于pBR322的適當(dāng)載體。適用于真核細(xì)胞的載體帶有真核細(xì)胞啟動(dòng)子如CMV、SV40等，這樣的載體包括pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。
總之，本發(fā)明涉及包括CK-HA和CK-HB核酸序列的重組體，重組體包括正向或反向插入了本發(fā)明所述核酸序列的各種載體，如質(zhì)粒、病毒顆?；蚴删w，并且在所說的多核苷酸序列的上游可操作地連接了適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可含有復(fù)制原點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列，及5’側(cè)翼非編碼序列。可使用衍生于SV40的剪切和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列來提供必要的遺傳元件。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了經(jīng)攜帶本發(fā)明多核苷酸的克隆載體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，本領(lǐng)域已知的方法包括氯化鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法或微粒轟擊法等。為了活化啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增所需的CK-HA、B基因，可以在適當(dāng)修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)中所使用的溫度、pH等培養(yǎng)條件一般都是由所選用的表達(dá)特定蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞決定的，并且這些條件都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
可使用任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸，適當(dāng)宿主的例子有細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等；低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅和中國家蠶細(xì)胞；高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS細(xì)胞。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括人細(xì)胞系，如Hela、293和U937細(xì)胞系，以及COS、CHO和BHK細(xì)胞系。
本發(fā)明第四個(gè)方面公開了用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明具有免疫調(diào)節(jié)活性和造血細(xì)胞刺激活性的多肽的方法。在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動(dòng)或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培養(yǎng)之。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞?？梢杂酶鞣N已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的CK-HA、B及其變異體多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。
可按常規(guī)的生物工程方法由宿主細(xì)胞中的重組DNA序列編碼產(chǎn)生多肽產(chǎn)物。也可使用常規(guī)的肽合成儀化學(xué)合成本發(fā)明的多肽?；蛘呖墒褂醚苌诒景l(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了CK-HA、B成熟多肽的氨基酸序列，CK-HA、B具有不同形式的成熟多肽，如SEQ ID NO2和SEQ ID NO4分別具有149個(gè)Aa和94個(gè)Aa。
利用RT-PCR技術(shù)檢測CK-HA、B在不同組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CK-HA、B有特殊的表達(dá)譜，在多種細(xì)胞中均有低豐度表達(dá)，但在人睪丸文庫中特異高表達(dá)，并有不同的變異體形式，如CK-HB。對變異體基因的克隆和序列分析證明它編碼94個(gè)氨基酸，命名為CKLF-HB，這種變異體很可能是CK-HA基因的不同剪切形式。
氨基酸序列分析表明CK-HA、B與其它已知細(xì)胞因子沒有同源性。用Prosite計(jì)算機(jī)軟件分析推測的氨基酸序列，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的穿膜區(qū)序列，沒有DNA結(jié)合位點(diǎn)及N-糖基化位點(diǎn)。SignalP V2.0軟件分析證明CK-HA的N端的22-23位氨基酸含天然信號(hào)肽切割位點(diǎn)。真核細(xì)胞表達(dá)上清液的活性分析證明CK-HA、B蛋白可以分泌到細(xì)胞外，屬于分泌性蛋白。SEQ ID NO2的氨基酸結(jié)構(gòu)中含Cys-Cys(CC結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)特征，而SEQ ID NO4無CC結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的多肽可以是天然產(chǎn)生、化學(xué)合成、或用DNA重組技術(shù)由原核或真核細(xì)胞產(chǎn)生的。優(yōu)選重組產(chǎn)生的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)方面，本發(fā)明的CK-HA、B及其活性成分可以與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑相混合以制備藥物組合物?？梢愿鶕?jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成多種劑型，例如溶液劑、脂質(zhì)體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑。載體或賦形劑的例子包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合?？筛鶕?jù)需要在組合物中添加輔助成例如與本發(fā)明CK-HA、B有協(xié)同作用的化合物；又如人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或賴氨酸)和金屬陽離子(如Zn2+，Mn2+，Mg2+和Ca2+)等蛋白保護(hù)劑；聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽等穩(wěn)定劑；蛋白酶抑制劑及自由基清除劑；以及在粘膜或皮膚局部給藥的情況下，添加二甲基亞砜或月桂氮卓酮等皮膚滲透劑。
為了使用上的方便和便于維持組合物各成分特別基本活性成分的生物學(xué)活性，可將本發(fā)明的藥物組合特制作成藥盒的包裝形式，這樣的藥盒可包括一個(gè)或多個(gè)裝有本發(fā)明藥物組合物之一種或多種成分的容器，并在每個(gè)容器上按政府制藥管理機(jī)構(gòu)指定的形式注明有關(guān)藥物的使用或銷售的批號(hào)及相關(guān)信息。
可通過常規(guī)途徑，特別是胃腸道外途徑使用本發(fā)明給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾微克到幾毫克/公斤體重/天，但針對每個(gè)特定病人的具體用藥劑量應(yīng)根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、一般健康狀況給藥方式等因素由臨床醫(yī)生來確定。
也可以根據(jù)本發(fā)明在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的多肽，即以所謂的“基因治療”方法使用這些多肽。例如，可以用編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸于體外基因工程化處理病人的細(xì)胞，然后再將工程化改造的細(xì)胞導(dǎo)入欲用所說的多肽治療的病人體內(nèi)。例如可使用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒來轉(zhuǎn)染并工程化改造所說的在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞?？砂匆阎椒▽a(chǎn)生含有編碼本發(fā)明多肽之反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞投用于病人體內(nèi)，以在體內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行基因工程化改造并在體內(nèi)表達(dá)所說的多肽。
上述這些方法以及用于這些方法的反轉(zhuǎn)錄病毒、包含在載體內(nèi)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、包括啟動(dòng)子和處于適當(dāng)啟動(dòng)子控制下之多核苷酸編碼序列的載體、用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體，以及適當(dāng)?shù)目杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞都是基因治療領(lǐng)域中已知的。
可借助各種已知的方法用攜帶本發(fā)明多肽之核酸編碼序列的載體體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞或靶細(xì)胞。這些方法包括但不只限于電穿孔、微粒轟擊(例如使用Biolistic裝置)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，以及確磷酸鈣沉淀法或這些方法的聯(lián)合使用。另外，也可以將反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裹在脂質(zhì)體中，或者偶聯(lián)到脂質(zhì)體上，然后再運(yùn)送到宿主體的適當(dāng)靶細(xì)胞內(nèi)。
總之，可由生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生包含本發(fā)明多肽之核酸編碼序列的感染性反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，然后使用這樣的載體顆粒于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所說多肽的核酸序列。可被轉(zhuǎn)的真核細(xì)胞包括但不只限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞和成人癌細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞及表皮細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的多核苷酸作為診斷試劑，檢測突變形式的基因以診斷因體內(nèi)CK-HA、B表達(dá)不足或表達(dá)過量所導(dǎo)致的疾病或病理狀態(tài)。
可用各種技術(shù)在DNA水平上檢測攜帶CK-HA、B基因突變的個(gè)體?？蓮牟∪说捏w液中，如血液、尿液、唾液或活體或尸檢材料中得到用于診斷試驗(yàn)的核酸?？梢允褂没駾NA或RNA直接進(jìn)行檢測，也可以使用PCR方法(Saiki et al.，Nature 324163-166，1986)擴(kuò)增DNA后再進(jìn)行檢測。例如，可使用與編碼本發(fā)明多肽的核酸互補(bǔ)的PCR引物鑒定和分析待檢材料中相應(yīng)基因的突變，如可與正常基因型相比較并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小改變來確定待檢基因的缺失或插入?？蓪U(kuò)增的DNA與放射標(biāo)記的CK-HA、B及其變異體RNA或反義DNA序列雜交，以鑒定點(diǎn)突變。
可用直接DNA測序法分析參考基因和突變基因之間的序列差異。另外，也可利用克隆的DNA片段作為探針并結(jié)合PCR方法，以高敏感性和特異性來檢測特定的DNA片段，例如可聯(lián)合使用測序引物和由擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的單鏈PCR產(chǎn)物或單鏈模板分子。
可以在含有或不含變性劑的凝膠，特別是高分辨率凝膠中檢測DNA的電泳遷移率來完成基于DNA序列差異的遺傳學(xué)試驗(yàn)?？稍谧冃约柞０诽荻饶z上區(qū)分不同序列的DNA片段(如參見Myers et al.，Science 2301242，1985)。另外，也可用核酸酶保護(hù)檢測法或化學(xué)裂解法(如參見Cotton et al.，PNAS，USA，854397-4401，1985)揭示特定部位的序列改變。
本發(fā)明還涉及檢測各種組織中CK-HA、B及其變異體蛋白質(zhì)水平改變的診斷試驗(yàn)法。用于檢測得自宿主體內(nèi)之樣品中的CK-HA、B及其變異體蛋白質(zhì)水平的檢測法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并包括放射免疫法、競爭性結(jié)合法、Western印跡分析法及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。其中優(yōu)選的方法是ELISA法。
本發(fā)明的多核苷酸序列對于染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列可特異地定位于個(gè)別人染色體的特定位置并可與之雜交。按照本發(fā)明，對本明的DNA進(jìn)行染色體作圖將這些序列與疾病相關(guān)基因聯(lián)系起來的第一個(gè)重要步驟。
可從cDNA制備PCR引物以進(jìn)行序列的染色體作圖。對基因的3’翻譯區(qū)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以迅速選擇出跨越基因組DNA中一個(gè)以上外顯子并從而加入擴(kuò)增過程中的引物。然后使用這些引物以PCR法篩選含有個(gè)別人染色體的體細(xì)胞雜種。只有那些含有對應(yīng)于引物之人類基因的雜種才產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。對體細(xì)胞雜種進(jìn)行PCR作圖是一種指定特定DNA在特定染色體上的位置的便利方法。在按照本發(fā)明使用同樣的寡核苷酸引物的情況下，可用一組得自特定染色體的片段或大的基因組克隆群體按相似方法完成亞定位。然后再用螢光原位雜交法(FISH)對cDNA克隆進(jìn)行精確的染色體定位(參見Verma et al.，HumanchromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NY(1988)).
一旦完成了序列的精確染色體定位作圖，即可將該序列的物理位置與遺傳圖數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)來鑒定作圖定位于同一染色體區(qū)域上的基因與疾病之間的關(guān)系。然后，可確定受損或未受損個(gè)體間的cDNA或基因組DNA的差異。如果在某些或全部受損個(gè)體中觀察到突變，而正常個(gè)體中沒有觀察到這種突變，則該突變便很可能是致病因素。
根據(jù)本發(fā)明的第七個(gè)方面，本發(fā)明公開了細(xì)胞因子CK-HA、B在制備治療造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病的藥物組合物中的用途。生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的CK-HA、B多肽作為一種分泌性小分子物質(zhì)，對人和小鼠骨髓細(xì)胞有明顯促增殖作用，對小鼠胸腺和脾細(xì)胞也有明顯刺激作用，詳見實(shí)施例六。
為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，現(xiàn)參照下列附圖和實(shí)施例對其進(jìn)行解釋，附圖和實(shí)施例的目的只是為了解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。


圖1是原核表達(dá)載體pMTY4-CKHA、B的構(gòu)建示意圖。
圖2是CK-HA在原核細(xì)胞中表達(dá)的結(jié)果。
圖3顯示了CK-HA、B的轉(zhuǎn)染上清對胎兒骨髓細(xì)胞的增殖作用。
圖4顯示了CK-HA、B轉(zhuǎn)染上清對小鼠胸腺細(xì)胞的促增殖作用。
圖5顯示了CK-HA、B的轉(zhuǎn)染上清對小鼠脾細(xì)胞的增殖作用。
實(shí)施例一、CK-HA、B全長cDNA克隆化1.生物信息分析利用CKLF-1序列對人的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression Sequence Tag，簡稱EST)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索和同源性比較，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)有低同源性的人EST序列，通過ESTAssemBly machine(網(wǎng)址為http//www.tigenm.it)進(jìn)行EST拼接，形成重疊群(contig)再次進(jìn)行BLAST拼接，找到完整的編碼框架。
2.CK-HA、B全長cDNA克隆化引物設(shè)計(jì)根據(jù)EST拼接得到的CK-HA、B全長cDNA序列，設(shè)計(jì)特異的引物如下上游引物P15’-GCG ATC CAA AGA GCG CGT-3’，下游引物P25’-TCTCGA TAA AAG CAG CAG CCC-3’PCR擴(kuò)增用人的睪丸單鏈cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)TAE配制的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下PCR條帶，加3倍體積的NaI(6M)45℃-55℃洗脫，加玻璃珠混懸溶液10μl，短暫離心沉淀玻璃珠-DNA復(fù)合物，用洗液洗3次，加H2O 45℃-50℃洗脫DNA。
3.PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T Easy載體PGEM-Teasy載體，購于Promega公司。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-1 Blue菌，用藍(lán)白斑顏色反應(yīng)篩選陽性克隆。
4.質(zhì)粒的提取和純化測序質(zhì)粒用Qiagen公司的Tip-20 Mini-preparation試劑盒進(jìn)行純化，測序試劑盒購自Pharmacia公司，依照公司提供的說明書(詳見StandardAnnealing of Primer to DouBle-Strand Template)利用ALF Express II DNA序列分析儀進(jìn)行序列測定。
結(jié)果利用CKLF-1序列對人EST數(shù)據(jù)庫檢索拼接得到CK-HA、B全長700Bp的人cDNA序列。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增其編碼區(qū)和序列分析，發(fā)現(xiàn)其編碼部分為新序列，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示。SEQ ID NO3(全長587個(gè)核苷酸)比SEQ ID NO1(全長603個(gè)核苷酸)少16個(gè)核苷酸，它是SEQ ID NO1的特殊形式。經(jīng)檢索CK-HA、B的起始子ATG周邊序列基本符合Kozak規(guī)律(GCGATGG)，除16個(gè)核苷酸的差異外，SEQ ID NO3與SEQ ID NO1的序列完全相同。這種差別可能是同一組織中不同的剪切過程形成的。
SEQ ID NO1與SEQ ID NO3分別編碼具有149個(gè)氨基酸和94個(gè)氨基酸的成熟多肽，分別如SEQ ID NO2與SEQ ID NO4所示。氨基酸序列進(jìn)行分析表明CK-HA、B與其它已知細(xì)胞因子沒有同源性。用Prosite計(jì)算機(jī)軟件分析推測的氨基酸序列，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的穿膜區(qū)序列，沒有DNA結(jié)合位點(diǎn)及N-糖基化位點(diǎn)。SignalP V2.0軟件分析證明CK-HA的N端22-23位氨基酸含天然信號(hào)肽切割位點(diǎn)。SEQ ID NO2的氨基酸結(jié)構(gòu)中含Cys-Cys(簡稱CC結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)特征，而SEQ ID NO4則不具備CC結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例二、原核表達(dá)載體的構(gòu)建如
圖1所示，挑選CK-HA、B片段正向插入的pGEM-T質(zhì)粒，用CK-HA、B的上、下游引物擴(kuò)增CK-HA、B片段，擴(kuò)增條件同前。用于擴(kuò)增SEQ ID NO1。先用Klenow片段去除PCR產(chǎn)物3’端多余的腺嘌呤“A”，再用NotI酶切，回收純化后克隆入經(jīng)StuI-NotI酶切的pMTY4載體(由本室構(gòu)建)中，構(gòu)建的質(zhì)粒pMTY4-CK-HA、B能夠在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)MS2與CK-HA、B的融合蛋白，兩者間由帶凝血酶切點(diǎn)的多肽連接。pMTY4-CKHA、B經(jīng)EcoR I酶切釋放出CK-HA、B片段，同上所述進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果完全正確。
實(shí)施例三、CK-HA在原核細(xì)胞中的表達(dá)大腸桿菌pop2136(C1857 endA，thi，hsdR)為C600衍生菌，編碼溫度敏感的λ阻遏蛋白，購自德國寶靈曼公司。pMTY4-CK-HA在pop2136菌株中30℃正常培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)表達(dá)。離心收獲誘導(dǎo)菌，用約1/10原體積的超聲緩沖液重懸細(xì)菌，超聲裂解細(xì)菌，融合蛋白MS2-CK-HA以包涵體形式表達(dá)，離心收獲包涵體。包涵體在8M尿素，14mM β-ME，50mM Tris-HCl(pH8.0)中37℃變性30分鐘。按1∶10稀釋復(fù)性，4℃過夜，復(fù)性同時(shí)進(jìn)行凝血酶切。利用肝素親和層析柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。
如圖2所示，融合蛋白表達(dá)載體pMTY4-CK-HA的融合蛋白MS2-CK-HA在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白的20％，蛋白經(jīng)變性復(fù)性凝血酶切肝素親和層析柱純化，純度可達(dá)90％以上(圖2)。
實(shí)施例四、真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pCI購自Promega公司，pcDNA3購自Invitrogen公司，質(zhì)粒pcDI為本室構(gòu)建，是將pcDNA3的BglI-KpnI片段與pCI的BglI-KpnI片段置換后得到的一個(gè)真核表達(dá)載體。如圖3所示，用EcoR I酶切釋放出CK-HA、B片段，將之連接至經(jīng)EcoR I酶切后并用CIP處理后的pCDI載體中，構(gòu)建了pCDI-CK-HA、B載體。
實(shí)施例五、CK-HA、B轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞293是人胚腎細(xì)胞，COS-7是SV40轉(zhuǎn)化的綠猴腎細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPM1 1640培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)利用SuperFect(Qiagen公司)高效轉(zhuǎn)染試劑，將純化的pCDI，pCDI-CK-HA、B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，在六孔板中以1×105/1.5ml培養(yǎng)基種植細(xì)胞。37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，取2.0μg質(zhì)粒加至100μl 1640培養(yǎng)基中，取10μl SuperFect轉(zhuǎn)染試劑，加入DNA混合液中，混勻。取600μl完全1640，加入轉(zhuǎn)染反應(yīng)混合物中。將上述混合物加到細(xì)胞中，培養(yǎng)2-3小時(shí)。吸出轉(zhuǎn)染反應(yīng)混合物。加入完全1640 1.5ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)48-72小時(shí)。
穩(wěn)定表達(dá)克隆的獲得穩(wěn)定表達(dá)克隆是在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后72小時(shí)，在培養(yǎng)基中加入G418，G418含量從低濃度逐漸升至高濃度，至500μg/ml，兩周后長出細(xì)胞克隆。
實(shí)施例六、CK-HA、B對細(xì)胞的增殖作用1.CK-HA、B對小鼠骨髓細(xì)胞的促增殖作用將溶解紅細(xì)胞后的小鼠骨髓細(xì)胞鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對照組加10μl正常培養(yǎng)72小時(shí)的COS-7細(xì)胞上清，實(shí)驗(yàn)組各加CK-HA、B和pCDI相應(yīng)量的原濃度轉(zhuǎn)染上清，每組各做6個(gè)復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)2周后，在培養(yǎng)孔中加入10μl 10mg/ml的MTT，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后加入裂解液后過夜。第二天用酶標(biāo)儀測定570nm波長的光吸收值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK-HA、B轉(zhuǎn)染上清能明顯促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞的增殖，pCDI對照無明顯作用。
2.CK-HA、B對人低密度骨髓細(xì)胞的促增殖作用將分離純化后的低密度骨髓細(xì)胞調(diào)整為2×106/ml，取90μl鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，陰性對照組加10μl正常培養(yǎng)的29 3細(xì)胞上清，實(shí)驗(yàn)組加10μl 293細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清，37℃5％CO2培養(yǎng)2周在培養(yǎng)孔中加入10μl 10mg/ml的MTT，6小時(shí)后加入裂解液過夜，第二天測570nm波長的光吸收值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK-HA、B能明顯促進(jìn)人胎兒骨髓細(xì)胞的增殖。
3.CK-HA、B對小鼠胸腺細(xì)胞及脾細(xì)胞的作用檢測取正常BALB/C小鼠20g，分別取脾、胸腺，得到小鼠胸腺和脾細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×106/ml，取90μl鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，陰性對照組加10μl正常培養(yǎng)的293細(xì)胞培養(yǎng)上清或10μl Tris-HCl(50mM pH8.0)；陽性組各加相應(yīng)量的轉(zhuǎn)染上清，pCDI空載體，pCDI-CK-HA，pCDI-CK-HB及純化的原核表達(dá)蛋白pMTY-CK-HA，37℃5％CO2培養(yǎng)2周，在培養(yǎng)液中加10μl 10mg/ml MTT，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后加入裂解液后過夜，第二天用酶標(biāo)儀測定570波長的光吸收值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK-HA、B能促進(jìn)小鼠胸腺細(xì)胞及脾細(xì)胞的增殖。
序列表SEQ ID NO 1的信息(i)序列特征(A)長度603個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO13 9 15 21 27 33 39 45| | | | | | | |1 ATG TTG AAG ATC CTG AGA CTG AGT CTT ATC TTA GGA GCA TTA GCT46 TGT TTC ATC ATC ACC CAA GCC AAT GAG TCA TTT ATA ACA ATC ACA91 AGT CTG GAA ATC TGC ATT GTC GTT TTT TTT ATT CTA ATA TAT GTG136 CTA ACC CTT CAC CAC TTG CTG ACC TAT TTA CAT TGG CCC TTA CTT181 GAT CTT ACC AAC AGT ATC ATT ACA GCT GTG TTC CTT TCA GTA GTT226 GCC ATC TTG GCC ATG CAA GAA AAG AAA AGA AGG CAT TTA CTC TAT271 GTC GGG GGG TCC CTG TGT CTC ACA GCG GTA ATC GTG TGT TGC ATC316 GAT GCG TTT GTG GTC ACC ACG AAG ATG AGG ACC AAC TTG AAA AGA361 TTC CTG GGA GTC GAA GTT GAA AGG AAG CTT TCC CCC GCC AAG GAC406 GCC TAC CCC GAA ACC GGC CCC GAC GCC CCG CAG AGG CCC GCC TGA451 AGC CAG CCC GGC GCC CTA GCA GAT GCA CGT GTC TGT CGA ATC GCT496 GCC TCC GAG CCC ACC CCC GAG CTC GCA TGC TGT CAC CCA TTC CAG541 CCT AAA TGT GAC CAT AAA ATT AGG GCT GCT GCT TTT ATC GAG AAA586 AAA AAA AAA AAA AAA AAASEQ ID NO 2的信息(i)序列特征(A)長度149個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO25 10 15| ||1 Met Leu Lys Ile Leu Arg Leu Ser Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ala16 Cys Phe Ile Ile Thr Gln Ala Asn Glu Ser Phe Ile Thr Ile Thr31 Ser Leu Glu Ile Cys Ile Val Val Phe Phe Ile Leu Ile Tyr Val46 Leu Thr Leu His His Leu Leu Thr Tyr Leu His Trp Pro Leu Leu61 Asp Leu Thr Asn Ser Ile Ile Thr Ala Val Phe Leu Ser Val Val76 Ala Ile Leu Ala Met Gln Glu Lys Lys Arg Arg His Leu Leu Tyr91 Val Gly Gly Ser Leu Cys Leu Thr Ala Val Ile Val Cys Cys Ile106 Asp Ala Phe Val Val Thr Thr Lys Met Arg Thr Asn Leu Lys Arg121 Phe Leu Gly Val Glu Val Glu Arg Lys Leu Ser Pro Ala Lys Asp136 Ala Tyr Pro Glu Thr Gly Pro Asp Ala Pro Gln Arg Pro Ala ---SEQ ID NO3 的信息序列特征(A)長度587個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO33 915 21 27 33 39 45| | | | | | | |1 ATG TTG AAG ATC CTG AGA CTG AGT CTT ATC TTA GGA GCA TTA GCT46 TGT TTC ATC ATC ACC CAA GCC AAT GAG TCA TTT ATA ACA ATC ACA91 AGT CTG GAA ATC TGC ATT GTC GTT TTT TTT ATT CTA ATA TAT GTG136 CTA ACC CTT CAC CAC TTG CTG ACC TAT TTA CAT TGG CCC TTA CTT181 GAT CTT ACC AAC AGT ATC ATT ACA GCT GTG TTC CTT TCA GTA GTT226 GCC ATC TTG GCC ATG CAA GAA AAG AAA AGA AGG CAT TTA CTC TAT271 GTC GGG GGG CGG TAA TCG TGT GTT GCA TCG ATG CGT TTG TGG TCA316 CCA CGA AGA TGA GGA CCA ACT TGA AAA GAT TCC TGG GAG TCG AAG361 TTG AAA GGA AGC TTT CCC CCG CCA AGG ACG CCT ACC CCG AAA CCG406 GCC CCG ACG CCC CGC AGA GGC CCG CCT GAA GCC AGC CCG GCG CCC451 TAG CAG ATG CAC GTG TCT GTC GAA TCG CTG CCT CCG AGC CCA CCC496 CCG AGC TCG CAT GCT GTC ACC CAT TCC AGC CTA AAT GTG ACC ATA541 AAA TTA GGG CTG CTG CTT TTA TCG AGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA586 AASEQ ID NO4的信息(i)序列特征(E)長度94個(gè)氨基酸(F)類型氨基酸(G)鏈型單鏈(H)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO45 10 15| | |1 Met Leu Lys Ile Leu Arg Leu Ser Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ala16 Cys Phe Ile Ile Thr Gln Ala Asn Glu Ser Phe Ile Thr Ile Thr31 Ser Leu Glu Ile Cys Ile Val Val Phe Phe Ile Leu Ile Tyr Val46 Leu Thr Leu His His Leu Leu Thr Tyr Leu His Trp Pro Leu Leu61 Asp Leu Thr Asn Ser Ile Ile Thr Ala Val Phe Leu Ser Val Val76 Ala Ile Leu Ala Met Gln Glu Lys Lys Arg Arg His Leu Leu Tyr91 Val Gly Gly Arg
權(quán)利要求
1.一段分離的多核苷酸序列，它包括選自如下一組的一個(gè)成員(1)一段能夠編碼如SEQ ID NO2所示多肽的多核苷酸序列；(2)一段能夠編碼如SEQ ID NO4所示多肽的多核苷酸序列；(3)一段能夠與(1)或(2)雜交，并且與它們具有至少80％同源性的多核苷酸序列；(4)一段多核苷酸序列，該序列是(1)、(2)或(3)的核酸片段。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中的多核苷酸是DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中的多核苷酸是RNA。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中的多核苷酸是基因組DNA。
5.一種載體，該載體包含權(quán)利要求1的核酸序列。
6.一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞經(jīng)權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過。
7.一種用基因工程手段生產(chǎn)多肽的方法，這種方法包括在權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
8.一種多肽，它包括選自如下一組的一個(gè)成員(1)一種具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；(2)一種具有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽；(3)一種(1)或(2)所述多肽的多肽片段。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物包括有效劑量的權(quán)利要求8所述的多肽或其活性成分，以及一或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.如權(quán)利要求8所述的多肽在制備治療造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)新的細(xì)胞因子CK－HA及其變異體CKB。本發(fā)明公開了CK－HA、B的核酸序列與氨基酸序列,本發(fā)明涉及攜帶CK－HA、B核酸序列的載體,表達(dá)CK－HA、B的宿主細(xì)胞,用基因工程技術(shù)生產(chǎn)CK－HA、B多肽的方法。本發(fā)明還涉及含有CK－HA、B的藥物組合物及細(xì)胞因子CK－HA、B在治療造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病的用途。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1369561SQ01103908
公開日2002年9月18日 申請日期2001年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月14日
發(fā)明者曹勇 申請人:曹勇