專利名稱：突變體ilvH基因和制備L－纈氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵制備L-纈氨酸的方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種不受L-纈氨酸反饋抑制的乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA、攜帶該DNA的微生物、以及使用這種微生物制備L-纈氨酸的方法。
背景技術(shù)：
過去，L-纈氨酸通過發(fā)酵方法來生產(chǎn)，主要使用屬于短桿菌屬、棒桿菌屬或沙雷氏菌屬并且能夠生產(chǎn)L-纈氨酸或L-亮氨酸的微生物或其突變體(《氨基酸發(fā)酵》，日本科學協(xié)會出版，397-422頁，1986)。盡管傳統(tǒng)的方法已經(jīng)在很大程度上提高了這些氨基酸的生產(chǎn)，但仍需要發(fā)展一種更有效、廉價的技術(shù)，來滿足將來L-纈氨酸和L-亮氨酸不斷增長的需要。
至于除上述細菌以外的用于L-纈氨酸生產(chǎn)的細菌，其例子為，屬于埃希氏菌屬、生長需要硫辛酸和/或H+-ATP酶活性缺陷的L-纈氨酸生產(chǎn)菌，以及屬于埃希氏菌屬、具有上述特征、被導入了一種能表達ilvG、ilvM、ilvE和ilvD基因的ilvGMEDA操縱子并且不表達蘇氨酸脫氨酶的細菌(WO96/06926)。
L-纈氨酸生物合成的最后步驟由一組ilvGMEDA操縱子編碼的酶催化。ilvGMEDA操縱子包括ilvG、ilvM、ilvE、ilvD和ilvA基因各一個，分別編碼乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅱ的大亞基和小亞基、轉(zhuǎn)氨酶、二羥酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶。在這些酶中，乙酰羥酸合成酶、轉(zhuǎn)氨酶和二羥酸脫氫酶催化丙酮酸至L-纈氨酸和2-丁酮酸至L-異亮氨酸的合成途徑，而蘇氨酸脫氨酶催化L-蘇氨酸至2-丁酮酸的脫氨反應，后者是L-異亮氨酸生物合成的限速步驟。順便提一句，ilvGMEDA操縱子的表達受L-纈氨酸和/或L-異亮氨酸和/或L-亮氨酸的控制(減弱)。
就涉及L-纈氨酸生物合成的乙酰羥酸合成酶而言，除了同功酶Ⅱ(這里也稱為AHASⅡ)，還知道有同功酶Ⅲ(這里也稱為AHASⅢ)。AHASⅢ由ilvIH操縱子編碼，該操縱子由編碼大亞基(催化亞基)的ilvI和編碼小亞基(控制亞基)的ilvH組成。AHASⅢ受L-纈氨酸的反饋抑制。
順便提一句，已經(jīng)有報道，從抗L-纈氨酸的突變體大腸桿菌中克隆的ilvH基因具有一個14gly至asp的氨基酸取代(Vyazmensky,M.等，《生物化學》35:10339-10346(1996))。而且，已知ilvH612是AHASⅢ突變(De Felice等，《細菌學雜志》120:1058-1067(1974))。大腸桿菌MI262(Guardiola等，《細菌學雜志》120:536-538(1974)；De Felice等，《細菌學雜志》120:1068-1077(1974))的ilvIH操縱子中的ilvH基因含有ilvH612雙重突變，分別是29Asn被Lys取代和92Gln被一個終止密碼子(TAG)取代。
如上所述，編碼AHASⅡ的DNA已被用于培育L-纈氨酸的生產(chǎn)菌株，但對于AHASⅢ，就沒有這方面的報道。
發(fā)明公開鑒于上面所指出的，本發(fā)明的目的是提供一種不受L-纈氨酸反饋抑制的乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA、攜帶該DNA的微生物、以及使用這種細菌制備L-纈氨酸的方法。
作為為完成上述目的而進行的努力研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，在將從一種L-纈氨酸抗性突變體分離的、編碼纈氨酸抗性AHASⅢ的DNA導入大腸桿菌時，纈氨酸的產(chǎn)量增加。因此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的各方面如下(1)一種編碼乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的小亞基的DNA，它來源于大腸桿菌，它具有一個突變，即對應于SEQ ID NO:2中17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種殘基取代；或者它具有兩個突變，即對應于SEQ ID NO:2中17號氨基酸的絲氨酸殘基和對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種殘基取代；(2)(1)的DNA，其中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是絲氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代，對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代；(3)一種編碼來源于大腸桿菌的乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA，該酶不受L-纈氨酸的抑制，并且具有催化從丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰乳酸和從α-丁酮酸及丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰-α羥基丁酸這兩種反應的活性；(4)(3)的DNA，其中DNA編碼乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的大亞基和小亞基，小亞基帶有一個突變，即SEQ ID NO:2中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，或者對應于29號氨基酸的天冬酰胺殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，或者自91號氨基酸下游的一個C末端片段缺失，或者選自上述突變和對應于SEQ ID NO:2中14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的突變的2種或多種突變的組合；(5)(4)的DNA，其中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是絲氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代，對應于29號氨基酸的天冬氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是天冬氨酸殘基被賴氨酸或酪氨酸殘基取代，對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代；(6)在其染色體DNA或質(zhì)粒上攜帶(1)或(3)的DNA并具有產(chǎn)生L-纈氨酸能力的細菌；(7)(6)的細菌，其中DNA的表達被增強；(8)(7)的細菌，其中表達通過將DNA置于強啟動子的控制之下或增加DNA的拷貝數(shù)來增強；(9)一種制備L-纈氨酸的方法，包括以下步驟在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)(6)的細菌，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累L-纈氨酸，并從培養(yǎng)基回收L-纈氨酸。
下面將對本發(fā)明進行詳細解釋。
本發(fā)明的第1個DNA是編碼AHASⅢ的小亞基的DNA，該亞基與大亞基一起顯示不受L-纈氨酸反饋抑制的乙酰羥酸合成酶活性。乙酰羥酸合成酶活性在這里指催化從丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰乳酸和從α-丁酮酸及丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰-α羥基丁酸這兩種反應的活性。大腸桿菌的AHASⅢ小亞基具有序列表中SEQ ID NO:2描述的氨基酸序列。
上述突變選自如下的一個突變，即對應于SEQ ID NO:2中17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種殘基取代；或者兩個突變，即對應于SEQ ID NO:2中17號氨基酸的絲氨酸殘基和對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種殘基取代。就對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基的突變而言，優(yōu)選的例子是用苯丙氨酸殘基取代絲氨酸殘基，而就對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基的突變來說，優(yōu)選的例子是用天冬氨酸殘基取代甘氨酸殘基。
本發(fā)明的第2個DNA是編碼AHASⅢ的DNA，其中所說的AHASⅢ不受L-纈氨酸的抑制，并且具有催化從丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰乳酸和從α-丁酮酸及丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰-α羥基丁酸這兩種反應的活性。該DNA同時編碼AHASⅢ的大亞基和小亞基。
小亞基帶有一個突變，即SEQ ID NO:2中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，或者對應于29號氨基酸的天冬酰胺殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，或者自91號氨基酸下游的一個C末端片段缺失，或者選自上述突變和對應于SEQ ID NO:2中14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的突變的2種或多種突變的組合。帶有這些突變的AHASⅢ小亞基在這里也被稱為AHASⅢ的小亞基突變體。就對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基突變而言，優(yōu)選的例子是絲氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代，就對應于29號氨基酸的天冬氨酸殘基的氨基酸殘基而言，例子是天冬氨酸殘基被賴氨酸或酪氨酸殘基取代，而就對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基的突變而言，優(yōu)選的例子是甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代。
本發(fā)明的DNA獲自大腸桿菌的L-纈氨酸抗性突變體，但它也可通過定點誘變將上述突變導入編碼野生型AHASⅢ的DNA來獲得。AHASⅢH由ilvIH操縱子編碼。ilvIH操縱子可通過諸如PCR擴增ilvH基因的啟動子區(qū)域至3’末端的DNA片段來獲得，PCR使用具有示于SEQ ID NO:3和4的序列的引物，并使用大腸桿菌的基因組DNA作為模板。ilvIH操縱子的核苷酸序列已經(jīng)知道(Genbank/EMBL/DDBJaccession X55034)。ilvH的編碼區(qū)的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中描述。
本發(fā)明的DNA編碼的AHASⅢ的突變體小亞基可以具有一種含有一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位以及上述突變的氨基酸序列，只要突變體小亞基能夠與大亞基一起顯示不受L-纈氨酸反饋抑制的乙酰羥酸合成酶活性。
編碼與上面介紹的突變體小亞基基本上相同的蛋白的DNA，可通過諸如修飾核苷酸序列，例如通過定點誘變的方法使特殊位點的一個或多個氨基酸殘基被取代、缺失、插入、添加或倒位，來獲得。按上面的介紹修飾的DNA可以通過傳統(tǒng)已知的突變處理來獲得。突變處理包括例如用羥胺在體外處理編碼小亞基的DNA的方法；以及用紫外線輻射或一種突變試劑如通常用于突變處理的N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理一種屬于埃希氏菌屬并攜帶編碼小亞基的DNA的細菌的方法。
編碼與AHASⅢ突變體小亞基基本上相同的蛋白的DNA通過如下方法來獲得在一種合適的細胞中以多拷貝的方式表達含有上述突變的DNA，研究對L-纈氨酸的抗性，并選擇抗性提高的DNA。而且通常知道，一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及編碼它的核苷酸序列在菌株、突變體或變異體之間有少量的差別，因此，編碼基本上相同的蛋白的DNA可從屬于埃希氏菌屬的L-纈氨酸抗性的種、菌株、突變體和變異體中獲得。
具體地說，編碼與突變體小亞基基本上相同的蛋白的DNA可通過如下方法來獲得從經(jīng)過突變處理的、屬于埃希氏菌屬的細菌或一種屬于埃希氏菌屬的細菌的自發(fā)突變體或變異體中，分離一種DNA，該DNA能夠與具有諸如示于序列表的SEQ ID NO:1的核苷酸序列在嚴緊條件下雜交，并且編碼具有乙酰羥酸合成酶活性的蛋白。術(shù)語“嚴緊條件”在這里指這樣一種條件，在該條件下，特異性雜交體形成而非特異性雜交體不能形成。使用任何數(shù)值都很難清楚地表述這種條件。但是，例如，嚴緊條件包括這樣一種條件，在該條件下，具有高度同源性的DNAs例如彼此的同源性不低于70％的DNAs能夠雜交，并且彼此的同源性低于上面的介紹的DNAs不能雜交。
本發(fā)明的細菌攜帶有本發(fā)明的第1種DNA或第2種DNA，并具有產(chǎn)生L-纈氨酸的活性。這種細菌沒有特別的限制，只要它具有一種涉及乙酰羥酸合成酶的L-纈氨酸生物合成途徑。其例子是屬于埃希氏菌屬、棒狀細菌和沙雷氏菌屬的細菌，優(yōu)選是埃希氏菌屬的細菌。屬于埃希氏菌屬的細菌的具體的例子是大腸桿菌。
將本發(fā)明的DNA導入一種細菌的方法的例子包括，諸如細菌用含有本發(fā)明的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法；本發(fā)明的DNA通過同源重組整合進細菌的染色體DNA的方法等等。
本發(fā)明的DNA的表達優(yōu)選被增強。表達的增強通過將本發(fā)明的DNA置于強啟動子的控制之下或擴增DNA的拷貝數(shù)來完成。例如，已知lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體的PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、amyE啟動子和spac啟動子是強啟動子。而且，可以在多拷貝載體上維持DNA或?qū)⒍嗫截惖腄NA導入染色體DNA來增加本發(fā)明的DNA的拷貝數(shù)。多拷貝載體的例子是pBR322、pTWV228、pMW119和pUC19等。
為將含有本發(fā)明的DNA的載體導入宿主細菌，可以使用任何已知的轉(zhuǎn)化方法。例如，可以使用的方法有用氯化鈣處理受體細胞來增加DNA的通透性的方法，這種方法已被報道用于大腸桿菌K-12(見Mandel,M.和Higa,A.《分子生物學雜志》53卷，159頁(1970))；和從處于生長期的細胞制備感受態(tài)細胞，接著將DNA導入其中的方法，這種方法已被用于枯草芽孢桿菌(見Duncan,C.H.,Wilson,G.A.和Young,F.E.《基因》1:153(1977))。除了這些，還可使用的方法是將DNA受體細胞制備成容易攝取重組DNA的原生質(zhì)體或球質(zhì)體，接著將重組DNA導入細胞，這種方法已知被用于枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母(見Chang,S.和Choen,S.N.，《普通分子遺傳學》168:111(1979)；Bibb,M.J.,Ward,J.M.和Hopwood,O.A.,《自然》274:398(1978)；Hinnen,A.,Hicks,J.B.和Fink,G.R.，《美國科學院院刊》75:1929(1978))，或者用于本發(fā)明的實施方案中的轉(zhuǎn)化方法是電脈沖方法(參見日本專利公開No.2-207791)。
可以使用的、將本發(fā)明的DNA導入細菌染色體DNA的方法包括，使用線性化DNA的方法和使用含有溫度敏感的復制起始區(qū)域的質(zhì)粒的方法。此外，本發(fā)明的DNA可通過轉(zhuǎn)導從在染色體上攜帶本發(fā)明的DNA的細菌導入一種細菌。
為將多拷貝的本發(fā)明的DNA導入一種細菌的染色體DNA，使用一種序列作為靶進行同源重組，其中該序列的多拷貝存在于染色體DNA中。就多拷貝存在于染色體DNA中的序列而言，可以使用存在于轉(zhuǎn)座因子的末端的重復DNA、反向重復DNA。而且，如同在日本專利公開No.2-109985中的公開，可以將本發(fā)明的DNA整合進轉(zhuǎn)座子，使其能夠通過轉(zhuǎn)座將多拷貝的DNA導入染色體DNA。
導入本發(fā)明的DNA的細菌可以是一種通過導入本發(fā)明的DNA而獲得L-纈氨酸產(chǎn)生能力的細菌以及本身具有L-纈氨酸產(chǎn)生能力的細菌。
具有L-纈氨酸產(chǎn)生能力的細菌的例子包括諸如大腸桿菌VL1970(美國專利5 658 766)。此外，優(yōu)選使用WO96/06926中介紹的諸如屬于埃希氏菌屬、生長需要硫辛酸和/或H+-ATP酶活性缺陷的L-纈氨酸生產(chǎn)菌，或者屬于埃希氏菌屬并被導入了一種能表達ilvG、ilvM、ilvE和ilvD基因的ilvGMEDA操縱子的細菌。因為ilvGMEDA操縱子的表達受L-纈氨酸和/或L-異亮氨酸和/或L-亮氨酸的控制(減弱)，優(yōu)選將對減弱作用重要的區(qū)域缺失或突變，來使表達抑制對產(chǎn)生的L-纈氨酸脫敏。另一種途徑提出引入突變(ileS或valS)來影響氨酰-tRNA合成酶，使之對相應的氨基酸具有降低的親合性(Km增加)。而且，優(yōu)選使用不表達活性蘇氨酸脫氨酶的操縱子。
含有ileS17突變并且減弱作用如上所述脫敏的大腸桿菌VL1970已經(jīng)在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),GNIIgenetika,(1,Dorozhny Proezd.,,113545,Moseow,Russia)進行了保藏，保藏號為VKPM B-4411。
所用的方法，例如雜交、PCR、質(zhì)粒DNA制備、DNA的消化和連接以及轉(zhuǎn)化，由Sambrook,J.,Fritsche,E.F.,Maniatis,T.在《分子克隆》Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)中介紹。
L-纈氨酸的制備按下面的方法進行，在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-纈氨酸生產(chǎn)能力的細菌，制備纈氨酸并在培養(yǎng)基中積累，從培養(yǎng)基中回收L-纈氨酸。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)、從培養(yǎng)基中回收和純化L-纈氨酸等可以與傳統(tǒng)的使用微生物生產(chǎn)氨基酸的發(fā)酵方法相似的方式進行。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是一種合成培養(yǎng)基或一種天然培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基含有碳源和氮源和礦物質(zhì)，并且在需要時含有適當數(shù)量的微生物生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源可包括各種碳水化合物如葡萄糖和蔗糖以及各種有機酸。根據(jù)所用微生物的同化模式，可以使用醇類包括乙醇和甘油。就氮源而言，可以使用各種銨鹽如氨和硫酸銨、其他含氮化合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解物和消化的發(fā)酵微生物。就礦物質(zhì)而言，可以使用單磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣等。
培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件下例如振蕩培養(yǎng)、通氣和攪拌培養(yǎng)在20至40℃的溫度下優(yōu)選30至38℃下進行。培養(yǎng)的pH通常在5至9之間，優(yōu)選在6.5至7.2之間。培養(yǎng)物的pH可用氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿和緩沖液進行調(diào)節(jié)。在通常情況下，1至3天的培養(yǎng)將導致靶L-纈氨酸在液體培養(yǎng)基中積累。
培養(yǎng)之后，固體如細胞可通過離心和膜過濾從液體培養(yǎng)基中除去，接著靶L-纈氨酸可通過離子交換、濃縮和結(jié)晶方法收集和純化。
附圖簡述


圖1顯示用于獲得只含有一個突變“14Gly至Asp”的突變體ilvH基因的PCR引物；圖2顯示用于獲得只含有一個突變“17Ser至Phe”的突變體ilvH基因的PCR引物。
實施本發(fā)明的最佳方式以下參照實施例來介紹本發(fā)明。(1)大腸桿菌W3350的L-纈氨酸抗性菌株在含有0.1mg/ml的L-纈氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上從大腸桿菌野生型菌株W3350中選擇了一個L-纈氨酸抗性突變體。這樣獲得的突變體W3350 Val0.1R對濃度不超過1mg/ml的L-纈氨酸具有抗性。
接著將插入了轉(zhuǎn)座子Tn10(Leu::Tn10)的亮氨酸操縱子(leuABCD)通過P1轉(zhuǎn)導導入W3350 Val0.1R。從W3350 Val0.1RLeu::Tn10轉(zhuǎn)導子中，誘導了一株雙突變體菌株，該菌株能夠在含有20mg/ml的纈氨酸和0.05mg/ml的L-亮氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長。(2)L-纈氨酸生產(chǎn)菌株VLl991的培育大腸桿菌VL1970(VKPM B-4411，美國專利5 658 766)被導入了一種參與抵抗高濃度的蘇氨酸(＞40mg/ml)或高絲氨酸(＞5mg/ml)的基因，該基因分離自帶有一個參與抗性的突變(rhtA23)的菌株B3996(美國專利5 705 371)。這樣就獲得了菌株VL1971。
然后通過使用P1噬菌體的轉(zhuǎn)導將來自大腸桿菌VL478的蔗糖利用基因?qū)隫L1971，獲得VL1972。然后自VL1972誘導一種自發(fā)突變體VL1991，該菌株比親本菌株長得快。(3)將L-纈氨酸抗性導入VL1991通過P1轉(zhuǎn)導將上面提到的雙重突變體中含有的突變導入VL1991。從轉(zhuǎn)導子中選擇一種Leu+的自發(fā)突變體。該突變體被命名為VL1997。接著將插入了轉(zhuǎn)座子Tn10(ilvD::Tn10)的ilvD基因通過P1轉(zhuǎn)導導入VL1997，獲得VL1997 ilvD::Tn10。然后用來自大腸桿菌菌株B的ilvGMEDA操縱子轉(zhuǎn)導VL1997 ilvD::Tn10。從這樣獲得的VL1998中選擇了一種自發(fā)突變體VL1999，該菌株比親本菌株長得快。(4)L-纈氨酸生產(chǎn)菌株VL1999/pVL715菌株VL1999用質(zhì)粒pVL715轉(zhuǎn)化，獲得重組纈氨酸生產(chǎn)菌株VL1999/pVL715。質(zhì)粒pVL715按如下方法構(gòu)建。從含有ilv基因(ilvGMEDAYC)的質(zhì)粒pVR12(Gavrilova等，《生物技術(shù)》(俄文)，4,No5,600-608(1988)切下含有該基因的BamHⅠ-XmalⅠDNA片段，并接著插入一種RSF1010衍生物(Chistoserdov和Tsygankov 《質(zhì)?！?986,16卷，161-167頁)--pAYC32，取代pAYC32的BamHⅠ-XmalⅠDNA片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pVS712。然后從pVS712衍生質(zhì)粒pVL715，后者按如下介紹抑制影響纈氨酰-tRNA合成酶的valS91突變(美國專利5 658 766)。將pVS712導入valS91突變體。所產(chǎn)生的菌株ValS91/pVS712如受體菌一樣保留了纈氨酸自養(yǎng)性。然后選擇能夠在不含纈氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的“回復子”。在一些回復子中，這種特性是由pVS712質(zhì)粒中含有的ilvGMEDAYC基因中的一個突變引起的。從一個“回復子”中，分離了質(zhì)粒pVL715。在含有pVL715的大腸桿菌菌株中，至少AHAS活性與含有pVS712的菌株相比被提高。(5)提供L-纈氨酸抗性的突變的鑒定從W3350 Val0.1R和VL1997中，對ilvIH基因進行了克隆和測序。ilvIH基因通過使用具有示于SEQ ID NO:3和4的序列的引物、用PCR擴增ilvIH基因的啟動子區(qū)域至3’末端的DNA片段來克隆，PCR在下列條件下進行94℃ 60秒、48℃ 30秒、72℃ 90秒、30個循環(huán)。擴增的ilvIH基因用Klenow片段處理，并克隆進pUC19載體的HincⅡ位點，產(chǎn)生pILVIH1和pILVIH2。用同樣的方式，將野生型ilvIH操縱子從菌株W3350克隆進pUC19，獲得pILVIH。
序列比較分析顯示，W3350 Val0.1R的突變體ilvIH操縱子在SEQ IDNO:1的50位核苷酸處含有一個取代“C”至“T”，而VL1997的突變體ilvIH操縱子含有兩個取代在SEQ ID NO:1的50位核苷酸處的“C”至“T”和41位核苷酸處的“G”至“A”。這些突變導致17Ser至Phe和14Gly至Asp的氨基酸取代。17Ser至Phe和14Gly至Asp的突變分別可以被稱為ilvHI1突變和ilvHI2突變。含有一個或兩個這些突變的ilvH基因分別被命名為ilvH1、ilvH2和ilvH1,2。(6)從ilvH1,2突變基因分離ilvHI1突變和ilvHI2突變?yōu)殛U明ilvH1,2的每個突變的影響，使用PCR通過定點誘變分離這些突變。
為獲得僅含一個突變14Gly至Asp的突變體ilvH基因，利用如下事實，即此突變產(chǎn)生了一個單一的Mlu位點(
圖1)。因此，合成了兩條具有示于SEQ ID NO:5和6的序列的引物。
使用上述引物，用PCR對質(zhì)粒pILVIH1,2進行擴增，該質(zhì)粒中克隆了ilvH1,2基因。這樣，就制備了兩翼為Mlu位點的約5kb的線性DNA片段。將此PCR片段用Mlu切割，并接著連接，產(chǎn)生環(huán)形的質(zhì)粒pILVIH2，該質(zhì)粒僅含靶突變。這也被序列分析證明。
為獲得僅含一個突變17Ser至Phe的突變體ilvH基因，設(shè)計了兩條具有示于SEQ ID NO:7和8的序列的引物。
使用這些引物，用PCR對含有野生型ilvIH操縱子的質(zhì)粒pILVIH進行擴增。所產(chǎn)生的PCR片段兩翼為StuⅠ位點，該位點由用ATA(編碼Ile)取代適當密碼子ATT來產(chǎn)生。片段用StuⅠ切割并連接，產(chǎn)生環(huán)形質(zhì)粒pILVIH1’，該質(zhì)粒含有新導入的突變點17Ser至Phe。這通過對質(zhì)粒的ilvH1基因進行測序來證明。(7)提供L-纈氨酸抗性的其他突變的鑒定在以上面介紹的同樣方式獲得的大腸桿菌W3350的兩個L-纈氨酸抗性突變體中，對ilvH基因進行了克隆和測序。結(jié)果顯示，在一個突變體中，產(chǎn)生了位于SEQ ID NO:1的85位核苷酸的“T”取代“A”，在另一個突變體中產(chǎn)生了位于SEQ ID NO:1的87位核苷酸的“A”取代“C”，通過這些突變，29Asn分別被Tyr或Lys取代。29Asn至Tyr和29Asn至Lys的突變分別可以被稱為ilvH3和ilvH4。從這些突變體將ilvIH操縱子克隆進pUC19，分別獲得pILVIH3和pILVIH4。
用同樣的方式，將ilvIH操縱子克隆進來自大腸桿菌MI262(IlvI-,IlvB-,IlvG-)的pUC19，獲得pILVIH262，其中該菌株獲自大腸桿菌遺傳保藏中心，其AHASⅢ具有一個已知的突變ilvH612(Guardiolae等，《細菌學雜志》120:536-538(1974)；De Felice等，《細菌學雜志》120:1068-1077(1974))。pILVIH262的操縱子中的ilvH基因具有下列突變(ilvH612):SEQ ID NO:1的87位核苷酸處的“C”至“A”和SEQ ID NO:1的274位核苷酸處的“C”至“T”。通過這些突變29Asn被Lys取代，92Gln被一個終止密碼子(TAG)取代。順便提一句，MI262中的ilvIH操縱子的ilvI基因具有一個突變(ilvI614)，這樣ilvI基因的表達產(chǎn)物不顯示酶活性。用含有野生型ilvI基因的pILVIHA的BamHⅠ片段取代含有突變的ilvI基因的pILVIH262的BamHⅠ片段，獲得pILVIH612。(8)將ilvH1基因?qū)氪竽c桿菌的野生型菌株使用以前介紹的方法(Parker和Marinus,1988，《基因》73卷，531-535頁)將突變體ilvH1基因?qū)氪竽c桿菌菌株W3350的染色體。這樣就獲得菌株W3350 ilvH1。已經(jīng)證明，該菌株能抵抗高達1mg/ml的L-纈氨酸，也就是說，它顯示與菌株W3350 Val0.1R相同的抗性水平。
這樣，通過對ilvH1基因以及通過定點誘變從ilvH1,2突變體的ilvH2突變分離的ilvH1突變的序列分析，我們證明了突變點17Ser至Phe能夠賦予細胞對L-纈氨酸低水平的抗性。(9)各種ilvH突變對AHASⅢ抵抗L-纈氨酸抑制的影響突變IlvH1(17Ser至Phe)、ilvH2(14Gly至Asp)、ilvH3(29Asn至Lys)、ilvH4(29Asn至Tyr)和ilvH612(29Asn至Lys和92Gln至一個終止密碼子TAG)按如下方式賦予酶AHASⅢ對L-纈氨酸抑制的抗性。也就是說，缺乏AHAS活性的大腸桿菌菌株MI262，在導入帶有各種ilvIH基因的質(zhì)粒之后，該菌株顯示對L-纈氨酸具有不同抗性水平的酶活性(表1)。還可以發(fā)現(xiàn)，來自含有pILVIH2或pILVIH612質(zhì)粒的菌株的AHAS顯示對L-纈氨酸具有最高抗性水平。
表1各種ilvH突變對AHASⅢ抵抗L-纈氨酸抑制的影響

(10)各種ilvH突變對L-纈氨酸產(chǎn)生的影響檢測了各種ilvH突變對L-纈氨酸產(chǎn)生的影響。將突變導入菌株VL1970和VL1999/pVL715的染色體。順便提一句，菌株VL1970和VL1999的親本菌株(W3350)不表達活性的乙酰羥酸合成酶Ⅱ(AHASⅡ)，因為該親本菌株在ilvG基因中有一個移碼突變。在另一方面，菌株VL1970和VL1999表達一種活性的AHASⅡ。
在將各種ilvH突變導入菌株VL1970之后，獲得了新菌株VL1970ilvH1、VL1970 ilvH2、VL1970 ilvH3、VL1970 ilvH4、VL1970 ilvH612。另外，在將各種ilvH突變導入菌株VL1999/pVL715之后，獲得了新菌株VL1999 ilvH1,2/pVL715、VL1999 ilvH3/pVL715、VL1999ilvH612/pVL715。將這些菌株和相應的親本菌株各自在37℃在一種營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18小時，在含有下列組分的20×200mm試管中的3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中接種0.3ml所獲得的培養(yǎng)物，在37℃在搖床上(250r.p.m.)培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)之后，用已知方法測定培養(yǎng)基中纈氨酸的積累數(shù)量和培養(yǎng)基在560nm處的吸收值。
結(jié)果示于表2和表3。在這些表中，ilvH+表示野生型ilvH基因。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖 80(NH4)2SO422K2HPO42NaCl 0.8MgSO4*7H2O 0.8FeSO4*5H2O 0.02MnSO4*5H2O 0.02鹽酸硫胺素 0.2酵母抽提物 1.0CaCO330(CaCO3單獨滅菌)表2菌株VL1970中各種ilvH突變對L-纈氨酸產(chǎn)生的影響

表3在ilvH基因中含有不同突變的菌株VL1999/pVL715的L-纈氨酸產(chǎn)生

由表2和表3可以看出，導入上面介紹的ilvH突變提高了各纈氨酸產(chǎn)生菌株的纈氨酸產(chǎn)量。而且，ilvH1和ilvH2突變的組合可產(chǎn)生最好的結(jié)果。
將含有各種突變體ilvH基因的ilvIH操縱子的pUC19衍生物導入菌株W3350。順便提一句，菌株W3350不表達活性的乙酰羥酸合成酶Ⅱ(AHASⅡ)，因為該親本菌株在ilvG基因中有一個移碼突變。從表4可以看出，所獲得的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生L-纈氨酸，并且含有質(zhì)粒pILVIH1,2的菌株產(chǎn)量最高。
表4攜帶含不同突變體ilvH基因的質(zhì)粒的菌株W3350的L-纈氨酸產(chǎn)量

以前本發(fā)明的發(fā)明者們觀察到，在L-纈氨酸發(fā)酵過程中，生產(chǎn)細胞中的AHAS活性(主要由AHASⅡ提供)逐漸降低。已經(jīng)顯示，AHASⅢ在45℃的半衰期是144分鐘，而AHASⅡ的半衰期是44分鐘。(Alexander-Caudle等，《細菌學雜志》172卷，3060-3065(1990))。這可能提示，AHASⅢ的較高的熱穩(wěn)定性反應了該酶普遍增加的穩(wěn)定性。因此，我們認為L-纈氨酸抗性的AHASⅢ對L-纈氨酸的產(chǎn)量具有正向的影響，因為它與AHASⅡ相比具有較高的穩(wěn)定性。
序列表<110>Ajinomoto,Co.,Inc.<120>突變體ilvH基因和制備L-纈氨酸的方法<130>0P969<141>2000--<150>RU-2000101678<151>2000-01-26<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>492<212>DNA<213>大腸桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(489)<400>1atg cgc cgg ata tta tca gtc tta ctc gaa aat gaa tca ggc gcg tta 48Met Arg Arg Ile Leu Ser Val Leu Leu Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu1 5 10 15tcc cgc gtg att ggc ctt ttt tcc cag cgt ggc tac aac att gaa agc 96Ser Arg Val Ile Gly Leu Phe Ser Gln Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser20 25 30ctg acc gtt gcg cca acc gac gat ccg aca tta tcg cgt atg acc atc 144Leu Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp Pro Thr Leu Ser Arg Met Thr Ile35 40 45cag acc gtg ggc gat gaa aaa gta ctt gag cag atc gaa aag caa tta 192Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Lys Gln Leu50 55 60cac aaa ctg gtc gat gtc ttg cgc gtg agt gag ttg ggg cag ggc gcg 240His Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Val Ser Glu Leu Gly Gln Gly Ala65 70 75 80cat gtt gag cgg gaa atc atg ctg gtg aaa att cag gcc agc ggt tac 288His Val Glu Arg Glu Ile Met Leu Val Lys Ile Gln Ala Set Gly Tyr85 90 95ggg cgt gac gaa gtg aaa cgt aat acg gaa ata ttc cgt ggg caa att 336Gly Arg Asp Glu Val Lys Arg Asn Thr Glu Ile Phe Arg Gly Gln Ile100 105 110atc gat gtc aca ccc tcg ctt tat acc gtt caa tta gca ggc acc agc 384Ile Asp Val Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Val Gln Leu Ala Gly Thr Ser115 120 125ggt aag ctt agt gca ttt tta gca tcg att cgc gat gtg gcg aaa att 432Gly Lys Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Ile Arg Asp Val Ala Lys Ile130 135 140gtg gag gtt gct cgc tct ggt gtg gtc gga ctt tcg cgc ggc gat aaa 480Val Glu Val Ala Arg Ser Gly Val Val Gly Leu Ser Arg Gly Asp Lys145 150 155 160ata atg cgt tga 492Ile Met Arg<210>2<211>163<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Arg Arg Ile Leu Ser Val Leu Leu Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu1 510 15Ser Arg Val Ile Gly Leu Phe Ser Gln Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser20 25 30Leu Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp Pro Thr Leu Ser Arg Met Thr Ile35 40 45Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Lys Gln Leu50 55 60His Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Val Ser Glu Leu Gly Gln Gly Ala65 70 75 80His Val Glu Arg Glu Ile Met Leu Val Lys Ile Gln Ala Ser Gly Tyr85 90 95Gly Arg Asp Glu Val Lys Arg Asn Thr Glu Ile Phe Arg Gly Gln Ile100 105 110Ile Asp Val Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Val Gln Leu Ala Gly Thr Ser115 120 125Gly Lys Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Ile Arg Asp Val Ala Lys Ile130 135 140Val Glu Val Ala Arg Ser Gly Val Val Gly Leu Ser Arg Gly Asp Lys145 150 155 160Ile Met Arg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>3gacatgaatg tctggttt18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>4tcaacgcatt attttatcg 19<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>5taaacgcgtt atcccgcgtg attg 24<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>6gccacgcgtc tgattcattt tcga 24<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>7ctcgaggcct tttttcccag cgtgg25<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>8ctcgaggcct atcacgcgga aataacg 2權(quán)利要求
1．一種編碼乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的小亞基的DNA，它來源于大腸桿菌，它具有一個突變，即對應于SEQ ID NO:2中17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種殘基取代；或者它具有兩個突變，即對應于SEQ ID NO:2中17號氨基酸的絲氨酸殘基和對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種殘基取代。
2．權(quán)利要求1的DNA，其中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是絲氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代，對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代。
3．一種編碼來源于大腸桿菌的乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA，該酶不受L-纈氨酸的抑制，并且具有催化從丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰乳酸和從α-丁酮酸及丙酮酸產(chǎn)生α-乙酰-α羥基丁酸這兩種反應的活性。
4．權(quán)利要求3的DNA，其中DNA編碼乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的大亞基和小亞基，小亞基帶有一個突變，即SEQ ID NO:2中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，或者對應于29號氨基酸的天冬酰胺殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，或者自91號氨基酸下游的一個C末端片段缺失，或者選自上述突變和對應于SEQ ID NO:2中14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的突變的2種或多種突變的組合。
5．權(quán)利要求4的DNA，其中對應于17號氨基酸的絲氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是絲氨酸殘基被苯丙氨酸殘基取代，對應于29號氨基酸的天冬氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是天冬氨酸殘基被賴氨酸或酪氨酸殘基取代，對應于14號氨基酸的甘氨酸殘基的氨基酸殘基的突變是甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代。
6．在其染色體DNA或質(zhì)粒上攜帶權(quán)利要求1或3的DNA并具有產(chǎn)生L-纈氨酸能力的細菌。
7．權(quán)利要求6的細菌，其中所說DNA的表達被增強。
8．權(quán)利要求7的細菌，其中表達通過將所說DNA置于強啟動子的控制之下或增加所說DNA的拷貝數(shù)來增強；
9．一種制備L-纈氨酸的方法，包括以下步驟在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6的細菌，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累L-纈氨酸，并從培養(yǎng)基回收L-纈氨酸。
全文摘要
一種制備L－纈氨酸的方法,它包括以下步驟:培養(yǎng)攜帶了編碼乙酰羥酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA的細菌,其中該酶來源于大腸桿菌,不受L－纈氨酸的抑制,并且具有催化從丙酮酸產(chǎn)生α－乙酰乳酸和從α－丁酮酸及丙酮酸產(chǎn)生α－乙酰－α羥基丁酸這兩種反應的活性;在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累L－纈氨酸;并從培養(yǎng)基回收L－纈氨酸。
文檔編號C12R1/19GK1310233SQ0110333
公開日2001年8月29日 申請日期2001年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月26日
發(fā)明者V·A·里夫希特斯, V·G·多羅申科, N·V·戈斯科瓦, A·V·貝拉爾耶瓦, L·V·伊瓦諾維斯卡雅, E·M·克霍爾格斯, V·Z·阿克維迪案, M·M·古斯雅蒂納, Y·I·科茲洛夫 申請人:味之素株式會社