專利名稱：具有生產(chǎn)1，4-丁二醇能力的突變體和使用該突變體制備1，4-丁二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠生產(chǎn)l，4-丁二醇的突變體微生物，以及使用該突變體微生 物制備1，4_ 丁二醇的方法。
背景技術(shù)：
可生物降解的聚合物已經(jīng)被建議作為合成聚合物的替代品，合成聚合物是嚴(yán)重環(huán) 境污染的重要原因之一。在目前正在開發(fā)的各種可生物降解的聚合物中，聚羥基丁酸 酯(poly-ii-hydroxybutyrate)是各種微生物在營養(yǎng)不平衡狀態(tài)下儲存的一種可生物降 解的聚合物，其具有優(yōu)良的特性，如生物可降解性、水抗性、壓電性和生物相容性。尤其是 4_羥基丁酸酯，其是聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的一個(gè)例子，具有聚酯樣特性，并顯示從結(jié)晶塑 料到高彈性橡膠的特性的許多特性。因此，目前正在對微生物可生物降解的塑料進(jìn)行大量 研究。此外，4-羥基丁酸酯可以很容易被轉(zhuǎn)變成具有4個(gè)碳原子的各種化學(xué)制品，如1， 4_ 丁二醇、Y-丁內(nèi)酯(GBL)和THF。尤其是，1，4_ 丁二醇是一種以如聚合物、溶劑和精細(xì) 化學(xué)制品中間體多種形式存在的重要的工業(yè)化學(xué)制品。雖然具有4個(gè)碳原子的大多數(shù)化學(xué) 制品目前是從1，4_ 丁二醇、馬來酐等等合成的，但是由于油價(jià)格的增加而導(dǎo)致的增加的生 產(chǎn)成本，需要開發(fā)用于補(bǔ)償和替代常規(guī)的化學(xué)生產(chǎn)方法的另一種方法。生物學(xué)方法已經(jīng)被 建議作為這種替代方法。同時(shí)，琥珀酸(succinate)，具有4個(gè)碳原子的二羧酸，是在厭氧條件下培養(yǎng)微生 物時(shí)產(chǎn)生的一種有機(jī)酸。現(xiàn)在，多種微生物被用作生產(chǎn)琥珀酸的細(xì)胞，而且由于有效的發(fā)酵 方法以及分離和純化方法的發(fā)展，它的生產(chǎn)成本變得更低。還可以由琥珀酸生產(chǎn)4-羥基丁 酸酯，而且具有4個(gè)碳原子的各種有機(jī)酸可以源自4-羥基丁酸酯。PCT公開第WO 2005/052135號是公開了一種有效生產(chǎn)琥珀酸的方法的專利申 請的一個(gè)例子，其中，腔細(xì)菌(Lumen bacterial)突變體在不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的情況下 生產(chǎn)高濃度的琥珀酸，和一種使用該突變體制備琥珀酸的方法。另外，韓國專利申請第 10-2004-60149中公開了一種制備能夠生產(chǎn)高濃度的琥珀酸的大腸桿菌突變體的方法，并 且韓國專利申請第 10-2005-0076301 號、第 10-2005-0076317 號和第 10-2005-0076348 號 中公開了一種使用新基因制備琥珀酸的方法。如上面所解釋的，迫切需要一種能夠生產(chǎn)1，4_ 丁二醇的突變體和使用該突變體 制備1，4- 丁二醇的生物學(xué)方法，1，4- 丁二醇是一種具有4個(gè)碳原子的工業(yè)上重要的化學(xué)制品。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明旨在提供一種能夠高效生產(chǎn)1，4_ 丁二醇的突變體微生物，以及使用該突變體微生物制備1，4_ 丁二醇的方法。技術(shù)方案一個(gè)方面，提供了一種能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物和使用該微生物制備1，4_ 丁二 醇的方法，所述微生物優(yōu)選為顯示出高1，4_ 丁二醇產(chǎn)量的突變體，其中，引入或增強(qiáng)編碼 把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯的酶的基因和編碼把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4- 丁二醇的 酶的基因。另一個(gè)方面，提供了 SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9的丁基-輔酶A脫氫酶基因和 具有該基因的重組載體，該基因?qū)?-羥基丁基-輔酶A有效生產(chǎn)為1，4- 丁二醇。在下文中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。作為使用能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物制備1，4_ 丁二醇的努力的結(jié)果，本發(fā)明人通 過在能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物中誘導(dǎo)或增強(qiáng)與4-羥基丁酸酯生物合成相關(guān)的基因和/或 與1，4_ 丁二醇生物合成相關(guān)的基因，開發(fā)了一種生產(chǎn)1，4_ 丁二醇的突變體微生物，并發(fā) 現(xiàn)，該突變體微生物有效生產(chǎn)1，4_ 丁二醇。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明。這里使用的術(shù)語“增強(qiáng)”指與原始表達(dá)水平相比基因表達(dá)水平的增加。如果在突 變之前微生物中沒有待增強(qiáng)的基因，那么可以向該微生物中引入至少一個(gè)基因，然后增強(qiáng)。 并且，如果在突變之前在微生物中有待增強(qiáng)的基因，可以通過如上所述的相同的方法向該 微生物中引入至少一個(gè)基因，或者可以通過遺傳工程技術(shù)對原來存在于微生物中的基因進(jìn) 行操作以增加基因表達(dá)。例如，當(dāng)增強(qiáng)表達(dá)的基因存在于待突變的微生物中時(shí)，可以用更強(qiáng) 的啟動子代替用于操縱基因表達(dá)的原始啟動子，從而增強(qiáng)基因表達(dá)。能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物可顯示出高琥珀酸產(chǎn)量，該微生物優(yōu)選為選自細(xì) 菌、酵母和真菌中的一種，更特別地為細(xì)菌，例如，腔細(xì)菌(Lumen bacteria)、棒狀桿菌 (Corynebacterium species)、短桿菌(Brevibacterium species)和大腸桿菌(E. coli)。所述腔細(xì)菌可具有失活的編碼乳酸脫氫酶(IdhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl) 的基因，并在厭氧條件下在不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。這里使用的術(shù)語“失活”指由于突變基因沒有被轉(zhuǎn)錄，或者轉(zhuǎn)錄的mRNA沒有適當(dāng) 地被翻譯成原始蛋白質(zhì)。為了使基因失去活性，可通過丟失基因或改變基因的核酸序列來 進(jìn)行突變。此外，所述腔細(xì)菌可具有失活的編碼乳酸脫氫酶(IdhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶 (pfl)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Pta)和乙酸激酶(ackA)的基因，并在厭氧條件下在基本上不生產(chǎn)其 他有機(jī)酸的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。做為選擇，所述腔細(xì)菌可具有失活的編碼乳酸脫氫酶(IdhA)、丙酮酸_甲酸裂解 酶(pfl)和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因，并在厭氧條件下在基本上不產(chǎn)生其他有機(jī)酸 的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。所述腔細(xì)菌可選自Mannheimia sp、放線桿菌(Actinobacillus sp.)和厭氧螺菌 (Anaerobiospirillum sp.)，但是本發(fā)明不局限于這些例子。Mannheimia sp.是優(yōu)選的， M5.Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)等Mannheimia sp. LPK (KCTC 10558BP)、LPK4 和 LPK7 (KCTC 10626BP)是更優(yōu)選的。所述大腸桿菌可具有失活的編碼葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA 和pykF)的基因，并在厭氧條件下在基本上不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。特別地，大腸桿菌突變體優(yōu)選是在韓國專利公開第10-2006-0011345號中公開的 W3110GFA。在上述高濃度生產(chǎn)琥珀酸的微生物中，可以以PCT公開第WO 2005/052135號中公 開的方法制備腔細(xì)菌。也就是說，使Mannheimia succiniciproducens 55E中的乳酸脫氫 酶基因(IdhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶基因(pfl)失活，從而構(gòu)建突變株，也即Marmheimnia sp.LPK(KCTC 10558BP)。然后，在LPK株中，使磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(pta)和乙酸激酶基因 (ackA)的基因和磷酸丙酮酸羧化酶的基因(ppc)分別失活，從而構(gòu)建突變株(Marmheimia sp. LPK7和LPK4)，然后在厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)以高產(chǎn)量生產(chǎn)琥珀酸。另外，在高濃度生產(chǎn)琥珀酸的微生物中，通過韓國專利公開第10-2006-0011345 號中公開的方法構(gòu)建大腸桿菌。也就是說，通過在用表達(dá)噬菌體red操縱子(exo-ii-gam) 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的W3110菌株中，使編碼葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(ptsG)的基因和編碼丙酮 酸激酶(pykA和pykF)的兩個(gè)基因失活，來產(chǎn)生突變體大腸桿菌菌株W3110GFA。然后，當(dāng)在 厭氧條件下培養(yǎng)突變體大腸桿菌菌株W3110GFA時(shí)，可以證實(shí)突變體的生產(chǎn)率大于母本菌 株W3110的生產(chǎn)率。把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯的酶的基因和與把琥珀酸半醛轉(zhuǎn)變成琥珀酸相關(guān) 的酶的基因可以來源于科氏梭菌(Clostridium kluyveri)，而把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1， 4_ 丁二醇的酶的基因可來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。雖然科氏 梭菌和丙酮丁醇梭菌不生產(chǎn)4-羥基丁酸酯和1，4_ 丁二醇，但是在這些菌株中克隆的酶在 生產(chǎn)4-羥基丁酸酯和1，4_ 丁二醇中發(fā)揮重要作用。另外，把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯的酶的基因可選自編碼琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶 (Catl)的基因、編碼琥珀酸半醛脫氫酶(SucD)的基因、編碼4-羥基丁酸脫氫酶(hbD)的基 因、編碼4-羥基丁酸脫氫酶(GHB)的基因。優(yōu)選地，編碼Catl的基因具有SEQID NO :1的 堿基序列，編碼SucD的基因具有SEQ ID NO :2的堿基序列，編碼4hbD的基因具有SEQ ID NO 3的堿基序列，以及編碼GHB的基因具有SEQ ID NO 4的堿基序列。例如，根據(jù)本發(fā)明的突變體微生物可以具有編碼Catl的基因、編碼SucD的基因和 編碼4hbD的基因，或者編碼Catl的基因、編碼SucD的基因和編碼GHB的基因，但是本發(fā)明 不局限于這些例子。此外，琥珀酸的有效使用對實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)是非常重要的，因此可以從高濃度 生產(chǎn)琥珀酸的微生物重組大腸桿菌中除去與把琥珀酸半醛轉(zhuǎn)變成琥珀酸相關(guān)的琥珀酸半 醛脫氫酶(GabD)。因此，根據(jù)本發(fā)明的突變體微生物也可具有失活的與把琥珀酸半醛轉(zhuǎn)變 成琥珀酸相關(guān)的基因，其優(yōu)選是編碼琥珀酸GabD的基因。編碼GabD的基因具有SEQ ID NO 10的堿基序列，但是本發(fā)明不局限于該序列。同時(shí)，為了在微生物中有效轉(zhuǎn)運(yùn)琥珀酸，可以增強(qiáng)與琥珀酸的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的C4-二 羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DctA)酶。因此，突變體微生物可另外具有編碼與琥珀酸的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的Dct4 的基因，其被引入到突變體微生物中或被增強(qiáng)，而且編碼Dct4的基因優(yōu)選具有SEQ ID N0 11的堿基序列。所述把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4- 丁二醇的酶的基因可以是編碼4-羥基丁酸-輔 酶A轉(zhuǎn)移酶和使4-羥基丁酸-輔酶A還原的醇脫氫酶的基因，或者編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁 酰激酶和使4-羥基丁酸-輔酶A還原的醇脫氫酶的基因。
所述編碼4-羥基丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因可以具有SEQ ID NO 5的堿基序列， 其可以用磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(ptb ;SEQ ID NO 6)和丁酰激酶(BuK ；SEQ ID NO :7)取代，以把 4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸-輔酶A。所述醇脫氫酶可以是來源于丙酮丁醇梭菌的丁基-輔酶A脫氫酶，而且編碼丁 基-輔酶A脫氫酶的基因優(yōu)選具有SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的堿基序列(CAP0035或 CAPO162) ο SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9的基因?qū)τ谠诟鶕?jù)本發(fā)明的突變體微生物中生產(chǎn) 1，4-丁二醇是非常有用的。因此，本發(fā)明提供了一種編碼丁基-輔酶A脫氫酶的基因和含 有該基因的重組載體。術(shù)語“載體”指含有與適于在合適的宿主中表達(dá)DNA的調(diào)控序列可操作連接的DNA 序列的DNA構(gòu)建體。在本發(fā)明中，載體可包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、酵母人工染 色體(YAC)載體，而且優(yōu)選質(zhì)粒載體。例如，質(zhì)粒載體可以具有這樣的結(jié)構(gòu)，其包括(a)用 于有效復(fù)制以在一個(gè)宿主細(xì)胞中具有幾百個(gè)拷貝的復(fù)制起點(diǎn)，(b)用于篩選用該質(zhì)粒載體 轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞的抗生素抗性基因，和(c)其中能夠插入外源DNA片段的限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)。即使沒有適合的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以根據(jù)常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸適體或 接頭，很容易地連接載體與外源DNA。因此，本發(fā)明提供了一種能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物，且優(yōu)選顯示高1，4_ 丁二醇產(chǎn) 量的突變體微生物，其中，使編碼GabD的基因失活，而且引入或增強(qiáng)編碼Catl的基因、編碼 SucD的基因、編碼4hbD (或GHB)的基因、編碼4-羥基丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼丁 基輔酶A脫氫酶的基因的全部。此外，本發(fā)明提供了一種能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物，且優(yōu)選顯示高1，4_ 丁二醇產(chǎn) 量的突變體微生物，其中，引入或增強(qiáng)編碼4-羥基丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因(或編碼磷 酸轉(zhuǎn)丁酰酶的基因和編碼丁酰激酶的基因)和編碼丁基-輔酶A脫氫酶的基因，以及使用 該微生物制備1，4_ 丁二醇的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備1，4_ 丁二醇的方法，其包括在含有碳源的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)該突變體，并從所述培養(yǎng)物中獲得1，4_ 丁二醇。有益效果如上面詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供了一種能夠高濃度生產(chǎn)琥珀酸的微生物，且更優(yōu) 選地，一種顯示高1，4_ 丁二醇產(chǎn)量的突變體以及使用該微生物制備1，4_ 丁二醇的生物學(xué) 方法，1，4_ 丁二醇是一種具有4個(gè)碳原子的化學(xué)制品，其在化學(xué)工業(yè)中具有廣泛的重要應(yīng) 用。


圖1是由琥珀酸生產(chǎn)4-羥基丁酸酯的途徑的示意圖；圖2是通過由琥珀酸產(chǎn)生的4-羥基丁酸酯生產(chǎn)1，4_ 丁二醇的途徑的示意圖；和圖3顯示了 1，4- 丁二醇產(chǎn)物的GC分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
在下文中，將通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚理解，提供 實(shí)施例只是為了解釋本發(fā)明，而不是為了限制它的范圍。
同時(shí)，在本發(fā)明中，制備1，4_丁二醇的方法使用腔細(xì)菌(如突變體Marmheimiasp. LPK(KCTC 10558BP)、LPK7和LPK4，其具有來源于Mannheimia sp.菌株的失活基因并高 濃度生產(chǎn)琥珀酸)、大腸桿菌和突變體大腸桿菌W3110GFA，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚理解，可 以使用另一種腔細(xì)菌菌株，通過產(chǎn)生高濃度生產(chǎn)琥珀酸的突變體，并引入和增強(qiáng)與生產(chǎn)1， 4_ 丁二醇相關(guān)的基因來生產(chǎn)1，4_ 丁二醇。另外，下面的實(shí)施例提供了具體的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚 地理解，如文獻(xiàn)(Lee 等人，Bioprocess Biosyst. Eng.，26 :63，2003 ；Lee 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol, 58 663,2002 ；Lee 等人，Biotechnol. Lett, 25 111,2003 ；Lee 等 人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :23，2000 ；以及 Lee 等人，Biotechnol. Bioeng.，72 41,2001)中所公開的，這里使用的培養(yǎng)基可以不同于水解物(如乳清或玉米漿)，或者可以 使用不同的培養(yǎng)方法(如加料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng))。棚列1 吿卿荒屮■物白妨法1-1.具有高琥珀酸產(chǎn)量的腔細(xì)菌的制備通過PCT公開第WO 2005/052135號中公開的方法制備根據(jù)本發(fā)明的微生物，腔細(xì) 菌，其顯示出高琥拍酸產(chǎn)量。也就是說，通過使Mannheimia succiniciproducens55E ( — 種腔細(xì)菌)中的乳酸脫氫酶(IdhA)的基因和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因失活來 制備突變株Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)，并通過使LPK菌株中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 (Pta)的基因、乙酸激酶(ackA)的基因和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因失活制備突變株 (Mannheimia sp. LPK7 和 LPK4)。1-2.顯示出高琥珀酸產(chǎn)量的大腸桿菌的制備通過韓國專利公開第10-2006-0011345號中公開的方法制備根據(jù)本發(fā)明的微生 物，大腸桿菌，其顯出示高琥珀酸產(chǎn)量。就是說，通過使W3110菌株中編碼葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移 酶(PtsG)的基因和編碼丙酮酸激酶(pykA和pykF)的兩個(gè)基因失活，來產(chǎn)生突變體大腸 桿菌菌株W3110GFA，W3110菌株用表達(dá)噬菌體red操縱子(exo-i^-gam)的重組表達(dá)載體 pTrcEBG 轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2 :1，4_ 丁二醇轉(zhuǎn)變酶的克隆2-1.編碼4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變酶(Catl、SucD和4hbD)的基因的克隆本發(fā)明人使用基于已知的基因序列(L21902)合成的寡核苷酸引物，通過聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增了 catl、sucD和4hbD基因，以便克隆編碼來源于科氏梭菌DSM 555的 CatUSucD和4hbD的基因的操縱子。用于PCR的引物如下。SEQ ID NO 12 CatIf-SacI5' -tttcccgagctc TGTGAGGCGATTAAATGAGTAAAGGGATAAAGSEQ ID NO 13 :4hbDb_XabIgc tctaga tta gat aaa aaa gag gac att tea caa tat gg為了構(gòu)建表達(dá)載體pTacLacfflBl，將擴(kuò)增的catLsucD和4hbD基因的操縱子插入 到表達(dá)載體PTacLacI中，其用Sacl/Xbal切割。通過用SspI切割載體pTac99A(Parkand Lee, J Bacteriol. 185，5391-5397，2003)，并連接該切割的載體與也用SspI切割的 pTrc991 (Amersham Pharmacia Biotech) H勾Iii^y[本 pTacLacI。
本 pTacLacI Jl*% pTrc99A相同的序列，而且丟失了存在于pTrc99A中的來自多克隆位點(diǎn)(MCS)的NcoI限性
8內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(限制性位點(diǎn))。此時(shí)，MCS從EcoRI位點(diǎn)開始。2-2.編碼與琥珀酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的DctA的基因的克隆為了克隆大腸桿菌W3110中編碼與琥珀酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的DctA的基因，使用基于已知 的基因序列(NC_000913)合成的寡核苷酸引物，通過DNA-PCR擴(kuò)增DctA基因。用于PCR的 引物如下。SEQ ID NO 14=DctAf-EcoRIggaattc ATGAAAACCTCTCTGTTTAAAAGCSEQ ID NO 15 =DctAb-XbaIgc tctaga tta aga gga taa ttc gtg cgt ttt gcc為了構(gòu)建表達(dá)載體ρ 10499DctA，用EcoRI/Xbal切割擴(kuò)增的DctA基因，然后插入 到表達(dá)載體 pl0499A(Park 等人.(2002)FEMS Microbiol. Lett 214:217-222)中。2-3.編碼把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4_ 丁二醇的酶的基因的克隆為了克隆SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9的編碼丁基-輔酶A脫氫酶的基因，丁 基-輔酶A脫氫酶是丙酮丁醇梭菌中把丁酸轉(zhuǎn)變成丁醇的酶，使用基于已知的基因序列 (NC_003030)合成的寡核苷酸引物，通過DNA-PCR擴(kuò)增cap0035和cap0162基因。用于PCR 的引物如下。SEQ ID NO 16 :CAP0035f_SacItttcccgagctc atgaaagttacaaatcaaaaaSEQ ID NO 17 :CAP0035b_XbaIgc tctaga tta aaa tgc ttt tat ata gatSEQ ID NO :18 :CAP0162f-EcoRIGGAATT C atgaaagtcacaacagtaaagSEQ ID NO : 19 :CAP0162b_XbaIgc tctaga tta agg ttg ttt ttt aaa為了構(gòu)建表達(dá)載體 pTacLacCAP35 和 pTacLacCAP 162，將擴(kuò)增的 cap0035 和 cap0162基因獨(dú)立地插入到表達(dá)載體pTacLacI中，該表達(dá)載體用Sacl/Xbal和EcoRI/Xbal 切割。為了把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸-輔酶A，使用基于SEQ ID NO :5的序 列合成的寡核苷酸引物，通過DNA-PCR擴(kuò)增SEQ ID NO :5的Cat2基因的操縱子。用于PCR 的引物如下。SEQ ID NO 20 :cat2f_EcoRIggaattc ATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGSEQ ID NO 21 :cat2b_BamHIeg ggatcc tta tct Ctt ttt ttc att cat taa tg為了構(gòu)建表達(dá)載體PTacLacCat2，把擴(kuò)增的cat2基因插入到表達(dá)載體pTacLacI 中，其用EcoRI/BamHI切割。為了把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸-輔酶A，使用基于SEQ ID NO :6和SEQID NO 7的序列合成的寡核苷酸引物，通過DNA-PCR擴(kuò)增SEQ ID NO 6和SEQ IDNO 7的ptb 和buk基因的操縱子。用于PCR的引物如下。
SEQ ID NO 22 :ptbf-RcoRIggaattc ATGATTAAGAGTTTTAATGAAATATCATGSEQ ID NO 23 :bukb_XbaIgc tctaga tta ttt gta ttc ctt age ttt ttc ttc tcc為了構(gòu)建表達(dá)載體，把擴(kuò)增的ptb和buk基因的操縱子插入到表達(dá)載體pTacLacI 中，其用 EcoRI/Xbal 切割，從而獲得 pTacLacPtbBuk。用 SspI 切割載體 pTacLacPtbBuk, 以獲得包括tac啟動子、ptb和buk基因和轉(zhuǎn)錄終止子的基因片段，并把該基因片段插入 到載體PBBR1MCS2 (Kovach等人，Gene. 166 175，1995)中，其用EcoRV切割，從而獲得載體 pMCS2TacPtbBuk。實(shí)施例3 :1,4-BD0的產(chǎn)牛載體pTacCAP162和pMCS2Tacptbbuk用大腸桿菌XLl-Blue通過電穿孔同時(shí)轉(zhuǎn)化， 然后鋪板于含有ΙΟΟμ g/ml氨芐青霉素和50μ g/ml醌那霉素的LB平板上，并于37°C培 養(yǎng)過夜。把培養(yǎng)的克隆接種到具有3ml LB液體培養(yǎng)基(包含100 μ g/ml氨芐青霉素)的 15ml管(FalCOn，USA)中，并以200rpm于37°C在振動孵育箱中生長過夜。將孵育的細(xì)胞接 種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含有IOOml 2%葡萄糖和100 μ g/ml氨芐青霉素)中，然后以 200rpm于37°C生長于振動孵育箱中。當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 7時(shí)，以ImM的終濃度添加IPTG來誘 導(dǎo)蛋白表達(dá)，并且將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。然后，離心培養(yǎng)物，并從其中除去上清液。然后，將細(xì)胞沉淀用MR培養(yǎng)基洗滌一 次，重懸于包含50ml 2%葡萄糖和2% Y-羥基丁內(nèi)酯和ImM IPTG的MR培養(yǎng)基中，并使用 5% H2,5% CO2和余量N2的氣體混合物起絨毛30分鐘以建立厭氧條件。培養(yǎng)物以200rpm 于37°C在振動孵育箱中生長過夜，并持續(xù)大約3天，然后離心培養(yǎng)物以獲得上清液。獲得的 上清液濃縮兩次，并用作GC分析樣品用于分析，以證實(shí)1，4_ 丁二醇的產(chǎn)生。在下列條件下 進(jìn)行分析，且結(jié)果示于圖3中。柱AT-Waw(0.53mm ID χ 15ml, 1. 2um u. f.毛細(xì)管)氣體流速柱(He)4. Oml/min烘箱溫度初始值&時(shí)間50°C，5min編程速率10°C/min終值& 時(shí)間250°C，5min噴射器溫度250°C檢測器溫度250°C噴射器分流比20/1噴射器體積1·0μ1如圖3所示，證實(shí)產(chǎn)生了 1，4-丁二醇。雖然已經(jīng)參考其某些實(shí)施例顯示和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以 多種形式和細(xì)節(jié)對其進(jìn)行各種改變，而不背離如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
10
權(quán)利要求
一種顯示高1，4-丁二醇產(chǎn)量的突變體，其通過在能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物中引入或增強(qiáng)編碼把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯和把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4-丁二醇的酶的基因來制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，所述能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物選自顯示出高 琥珀酸產(chǎn)量的細(xì)菌、酵母和真菌中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變體，其中，所述細(xì)菌選自腔細(xì)菌、棒狀桿菌、短桿菌和大 腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體，其中，所述腔細(xì)菌具有失活的編碼乳酸脫氫酶 (IdhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)的基因，并在厭氧條件下在基本上不產(chǎn)生其他有機(jī)酸 的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體，其中，所述腔細(xì)菌具有失活的編碼乳酸脫氫酶 (IdhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ackA)的基因，并在 厭氧條件下在基本上不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體，其中，所述腔細(xì)菌具有失活的編碼乳酸脫氫酶 (IdhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶(pfl)和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因，并在厭氧條件下在 基本上不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體，其中，所述腔細(xì)菌選自Marmheimiaspecies、放線桿 菌和厭氧螺菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的突變體，其中，所述腔細(xì)菌是Marmheimiaspecies.
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的突變體，其中，所述腔細(xì)菌選自 Mannheimiasucciniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)禾口 Mannheimia species LPK (KCTC10558BP)、LPK4 和 LPK7 (KCTC 10626BP)中。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體，其中，所述大腸桿菌具有失活的編碼葡萄糖磷酸轉(zhuǎn) 移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA和pykF)的基因，并在厭氧條件下在基本上不產(chǎn)生其他有 機(jī)酸的情況下高濃度生產(chǎn)琥珀酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的突變體，其中，所述大腸桿菌突變體是W3110GFA。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，所述編碼把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯的酶 的基因來源于科氏梭菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，所述編碼把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯的酶 的基因選自編碼琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Catl)、琥珀酸半醛脫氫酶(SucD)、4_羥基丁酸脫氫 酶(4hbD)和4-羥基丁酸脫氫酶(GHB)的基因中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的突變體，其中，所述編碼Catl的基因具有SEQIDNO :1的 堿基序列，所述編碼SucD的基因具有SEQ ID NO 2的堿基序列，所述編碼4hbD的基因具有 SEQ ID NO 3的堿基序列，以及所述編碼GHB的基因具有SEQID NO 4的堿基序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的突變體，其中，所述突變體包含編碼Catl的基因；編碼 SucD的基因；和編碼4hbD的基因或編碼GHB的基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，所述編碼把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4_丁二 醇的酶的基因來源于丙酮丁醇梭菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，所述編碼把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4_丁二醇的酶的基因是編碼4-羥基丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼使4-羥基丁酸-輔酶A還 原的醇脫氫酶的基因；或者編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶的基因、編碼丁酰激酶的基因和編碼使4-羥 基丁酸-輔酶A還原的醇脫氫酶的基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的突變體，其中，所述編碼4-羥基丁酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基 因具有SEQ ID NO 5的堿基序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的突變體，其中，所述編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶的基因和編碼丁酰 激酶的基因分別具有SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的堿基序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的突變體，其中，所述醇脫氫酶是來源于丙酮丁醇梭菌的丁 基-輔酶A脫氫酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的突變體，其中，所述編碼丁基-輔酶A脫氫酶的基因具有 SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 的堿基序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，該突變體具有失活的與把琥珀酸半醛轉(zhuǎn)變成 琥珀酸相關(guān)的基因。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的突變體，其中，所述與把琥珀酸半醛轉(zhuǎn)變成琥珀酸相關(guān)的 基因是編碼琥珀酸半醛脫氫酶(GabD)的基因。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的突變體，其中，所述編碼GabD的基因具有SEQIDNO 10的 堿基序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其中，在所述突變體中另外引入或增強(qiáng)編碼與琥珀 酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DctA)的基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的突變體，其中，所述編碼DctA的基因具有SEQIDNO :11的 大堿基序列。
27.—種顯示高1，4_ 丁二醇產(chǎn)量的突變體，其通過在能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物中引入 或增強(qiáng)編碼Catl的基因；編碼SucD的基因；編碼4hbD或GHB的基因；編碼4-羥基丁酸-輔 酶A轉(zhuǎn)移酶的基因或編碼Ptb的基因和編碼Buk的基因；和編碼丁基-輔酶A脫氫酶的基 因而制備。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的突變體，其中，在所述突變體中使編碼GabD的基因失活。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的突變體，其中，在所述突變體中引入或增強(qiáng)編碼與琥珀酸 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的DctA的基因。
30.一種制備1，4_ 丁二醇的方法，包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1到29中任一項(xiàng)所述的突變體；和從所述培養(yǎng)基中收獲1，4_ 丁二醇。
31.一種具有SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的堿基序列的丁基-輔酶A脫氫酶基因。
32.一種包含根據(jù)權(quán)利要求31所述的基因的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠生產(chǎn)1，4-丁二醇的突變體和使用該突變體制備1，4-丁二醇的方法。通過在能夠生產(chǎn)琥珀酸的微生物中引入和增強(qiáng)編碼把琥珀酸轉(zhuǎn)變成4-羥基丁酸酯和把4-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變成1，4-丁二醇的酶的基因來制備該突變體微生物。該方法包括在含有碳水化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該突變體，并由培養(yǎng)物獲得1，4-丁二醇。因此，可以生物學(xué)方法制備化學(xué)工業(yè)中必需的1，4-丁二醇。
文檔編號C12N15/10GK101883853SQ200880105984
公開日2010年11月10日 申請日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日
發(fā)明者樸時(shí)載, 李恩政, 李相燁, 李相賢 申請人:Lg化學(xué)株式會社;韓國科學(xué)技術(shù)院