專(zhuān)利名稱(chēng)：：能夠由蔗糖生產(chǎn)聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物的重組微生物和使用該微生物由蔗糖生產(chǎn)聚...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能夠由蔗糖生產(chǎn)聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重組微生物和使用該微生物由蔗糖生產(chǎn)PLA或PLA共聚物的方法。
背景技術(shù)：
：聚乳酸酯(PLA)是一種來(lái)源于乳酸酯的典型可生物降解的聚合物，其高度應(yīng)用于商業(yè)和生物醫(yī)藥學(xué)。雖然目前通過(guò)發(fā)酵微生物產(chǎn)生的乳酸酯的聚合來(lái)制備PLA，但是通過(guò)乳酸酯的直接聚合僅僅獲得了大約1000到5000道爾頓的低分子量PLA。為了合成分子量為100，000道爾頓或更高的PLA，可以使用鏈偶聯(lián)劑將通過(guò)乳酸酯的直接聚合獲得的低分子量PLA聚合。但是，在這種方法中，由于添加有機(jī)溶劑或鏈偶聯(lián)劑，而且其不容易被去除，而使整個(gè)過(guò)程變得復(fù)雜。目前商業(yè)上可用的制備高分子量PLA的方法包括將乳酸酯轉(zhuǎn)變成丙交酯，和利用丙交酯環(huán)的開(kāi)環(huán)縮聚作用合成PLA。當(dāng)通過(guò)乳酸酯的化學(xué)合成來(lái)合成PLA時(shí)，很容易獲得PLA均聚物，但是由各種單體組成的PLA共聚物難以合成而且是商業(yè)上不可用的。同時(shí)，當(dāng)存在過(guò)量的碳源和缺乏其他的養(yǎng)分(如磷⑵、氮(N)、鎂(Mg)和氧(0)、等等)時(shí)，聚羥基鏈烷酸酯(PHA)是微生物儲(chǔ)存作為能量或碳源的聚酯。由于PHA具有與來(lái)自石油的常規(guī)合成聚合物類(lèi)似的物理性能，并顯示完全的生物可降解性，它正被公認(rèn)為常規(guī)合成塑料的替代品。為了使用微生物生產(chǎn)PHA，需要將微生物的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成PHA單體的酶和使用PHA單體合成PHA聚合物的PHA合酶。當(dāng)利用微生物合成PLA和PLA共聚物時(shí)，需要相同的系統(tǒng)，而且除了提供羥酰輔酶A的酶外，其是PHA合酶的最初底物，還需要提供乳酰輔酶A的酶。而且，為了經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)可生物降解的聚合物，采用低成本的底物是非常重要的。特別是，需要開(kāi)發(fā)一種使用蔗糖作為低成本底物來(lái)生產(chǎn)PLA或PLA共聚物的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明旨在一種能夠使用蔗糖作為底物生產(chǎn)聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的微生物和使用該微生物生產(chǎn)PLA或PLA共聚物的方法。技術(shù)方案本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種由蔗糖生產(chǎn)聚乳酸酯(PLA)或羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法。該方法包括在含有乳酸酯和蔗糖的環(huán)境中或者在含有乳酸酯、蔗糖和羥基鏈烷酸酯的環(huán)境中，培養(yǎng)細(xì)胞或植物或者使細(xì)胞或植物生長(zhǎng)。該細(xì)胞或植物含有將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因和使用乳酰輔酶A作為底物的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的基因，而且能夠使用蔗糖作為底物生產(chǎn)PLA或羥基鏈烷酸酯_乳酸酯共聚物。然后，從細(xì)胞或植物中回收PLA或羥基鏈烷酸酯_乳酸酯共聚物。如韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第10-2006-0116234號(hào)中所公開(kāi)的，本發(fā)明人利用來(lái)自丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的用于提供乳酰輔酶A的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶，和使用乳酰輔酶A作為底物的來(lái)自假單胞菌屬(Pseudomonas)sp.6-19的PHA合酶的突變體，成功合成了PLA和PLA共聚物。而且，本發(fā)明人試圖利用低成本的底物蔗糖來(lái)生產(chǎn)PLA和PLA共聚物，從而經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)可生物降解的聚合物。因此，本發(fā)明人用表達(dá)來(lái)自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶和來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19的PHA合酶的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化利用蔗糖作為低成本底物的大腸桿菌，并發(fā)現(xiàn)，使用轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌能有效地由蔗糖生產(chǎn)PLA和PLA共聚物。這使他們完成了本發(fā)明?？赏ㄟ^(guò)用(a)將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因與(b)使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因的至少之一轉(zhuǎn)化不含有(a)與(b)的至少之一的細(xì)胞或植物，來(lái)獲得能夠生產(chǎn)PLA或PLA共聚物(羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物)的細(xì)胞或植物。也就是說(shuō)，可通過(guò)用(a)與(b)的至少之一轉(zhuǎn)化不具有(a)與(b)的細(xì)胞或植物，或通過(guò)用(a)轉(zhuǎn)化不具有(a)但是具有(b)的細(xì)胞或植物，來(lái)獲得能夠生產(chǎn)PLA或羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物的細(xì)胞或植物，但是本發(fā)明不局限于此。例如，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)細(xì)胞具有(a)與(b)之一時(shí)，可通過(guò)增強(qiáng)包含的(a)與(b)之一，和用缺乏的(a)與(b)之一轉(zhuǎn)化細(xì)胞，來(lái)獲得能夠生產(chǎn)PLA或羥基鏈烷酸酯_乳酸酯共聚物的細(xì)胞。本發(fā)明中，所述羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物的羥基鏈烷酸酯可以是選自3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、4-羥基丁酸酯、具有6到14個(gè)碳原子的中鏈長(zhǎng)(D)-3-羥基羧酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二碳烯酸、3-羥基-6-順式-十二碳烯酸、3-羥基-5-順式-十四碳烯酸、3-羥基-7-順式-十四碳烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四碳烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋(píng)果酸、3-羥基琥珀酸_甲酯、3-羥基己二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-甲酯、3-羥基壬二酸-甲酯、3-羥基癸二酸_甲酯、3-羥基辛二酸_乙酯、3-羥基癸二酸-乙酯、3-羥基庚二酸-丙酯、3-羥基癸二酸-芐酯、3-羥基-8-乙酸基辛酸、3-羥基-9-乙酸基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基己酸、對(duì)硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12-二羥基十二烷酸、3，8-二羥基-5-順式_十四碳烯酸、3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-11-溴十一烷酸、3-羥基-2-丁烯酸、6-羥基-3-十二碳烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一種，但是本發(fā)明不限于此。本發(fā)明中，所述將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因可以是丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(pet)基因。更具體地說(shuō)，將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因可以是來(lái)自丙酸梭菌的pet基因。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因可具有選自以下的一種=SEQIDNO:1的堿基序列(CpPCT)；通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C獲得的堿基序列(CpPCT522)；通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的A1200G獲得的堿基序列(CpPCT512)；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDN0:2的氨基酸序列中的Gly335Asp獲得的堿基序列(CpPCT531)；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的T669C、A1125G禾口T1158C和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp65Gly獲得的堿基序列(CpPCT533)；通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突變SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Asp65Asn獲得的堿基序列(CpPCT535)；通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突變SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Thrl99Ile獲得的堿基序列(CpPCT537)；通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Ala243Thr獲得的堿基序列(CpPCT532)；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Asp257Asn獲得的堿基序列(CpPCT534)；和通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的T78C、T669C、A1125G禾口T1158C和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Vall93Ala獲得的堿基序列(CpPCT540)。特別地，CpPCT532基因可以是來(lái)自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變基因，其優(yōu)選用于使用蔗糖生產(chǎn)PLA或PLA共聚物。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞或植物可包含使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因，其是來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19的PHA合酶的基因。使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因可以是具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的基因，或者具有對(duì)應(yīng)于突變的氨基酸序列的堿基序列的基因，其中SEQIDNO4的氨基酸序列中選自E130D、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R中的至少一個(gè)發(fā)生突變。特別地，phaClPs6_19400基因可以是來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19的PHA合酶的基因，其優(yōu)選用于使用蔗糖生產(chǎn)PLA或PLA共聚物。而且，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞或植物另外可包含用于由蔗糖生產(chǎn)羥酰輔酶A的酶的基因。由于另外包括由蔗糖生產(chǎn)羥酰輔酶A的酶的基因的重組細(xì)胞或植物，本身能生產(chǎn)羥酰輔酶A，即使培養(yǎng)基中不包括羥基鏈烷酸酯，也可以高產(chǎn)量生產(chǎn)羥基鏈烷酸酯_乳酸酯共聚物。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，用于由蔗糖生產(chǎn)羥酰輔酶A的酶可以是酮硫解酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶，但是本發(fā)明不限于此。酮硫解酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶可來(lái)源于富氧羅爾其j通氏菌(Ralstoniaeutropha)。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，能夠生產(chǎn)PLA或羥基鏈烷酸酯_乳酸酯共聚物的細(xì)胞可以是細(xì)菌，尤其是大腸桿菌。本發(fā)明提供了一種用用于生產(chǎn)PLA或PLA共聚物的重組載體轉(zhuǎn)化并使用蔗糖作為底物的細(xì)胞或植物，該重組載體含有將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因和使用乳酰輔酶A作為底物的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的基因。所述細(xì)胞或植物另外可包含用于由蔗糖生產(chǎn)3-羥基丁基-輔酶A的酶的基因。載體指包含與能在合適的宿主中表達(dá)DNA的適合調(diào)控序列可操作連接的DNA序列的DNA構(gòu)建體。在本發(fā)明中，載體可以是質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體或酵母人工染色體(YAC)載體。為了本發(fā)明的目的，可以使用質(zhì)粒載體。用于本發(fā)明目的的典型質(zhì)粒載體包含(a)允許有效復(fù)制以便每個(gè)宿主細(xì)胞包含幾百個(gè)質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)，(b)允許篩選導(dǎo)入了質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞的抗生素抗性基因，和(c)其中可插入外源DNA片段的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。即使沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，可以通過(guò)普通方法使用合成的寡核苷酸連接體或接頭，很容易地連接載體與外源DNA。連接過(guò)程以后，載體必須被轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中。本發(fā)明中，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。原核細(xì)胞可以是具有上述3個(gè)基因之一的微生物，或者不具有上述3個(gè)基因的微生物，例如，大腸桿菌。大腸桿菌可包括大腸桿菌DH5a菌株、大腸桿菌JMlOl菌株、大腸桿菌K12菌株、大腸桿菌W3110菌株、大腸桿菌X1776菌株、大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene)、大腸桿菌B，等等。但是，大腸桿菌菌株，如FMBlOl、匪522、匪538和匪539，以及其他的原核生物種和屬也可以使用。除了具有PHA合酶的基因的上述大腸桿菌和微生物以外，土壤桿菌菌株(如土壤桿菌A4)、桿菌(如枯草桿菌)及其他腸細(xì)菌(如鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌或粘質(zhì)沙雷氏桿菌)，可用作宿主細(xì)胞。已知的真核宿主細(xì)胞(如酵母和霉菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(如感染草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)(SF9))、動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和小鼠細(xì)胞)以及組織培養(yǎng)的人和植物細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。當(dāng)載體被轉(zhuǎn)化到合適的宿主中時(shí)，載體能復(fù)制或發(fā)揮功能，而不管宿主基因組，或者有時(shí)載體與基因組本身整合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，為了提高轉(zhuǎn)化的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)化的基因必須與表達(dá)調(diào)控序列可操作連接，該表達(dá)調(diào)控序列在選擇的表達(dá)宿主中執(zhí)行轉(zhuǎn)錄和喘譯功能。優(yōu)選地，表達(dá)調(diào)控序列和轉(zhuǎn)化的基因包含在一個(gè)表達(dá)載體中，該表達(dá)載體同時(shí)含有細(xì)菌選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)表達(dá)宿主是真核細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體必須另外包含可用于真核表達(dá)宿主的表達(dá)標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)調(diào)控序列”指可操作連接的編碼序列在特定的宿主中表達(dá)不可缺少的DNA序列。調(diào)控序列包括轉(zhuǎn)錄所需的啟動(dòng)子、用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄的任意的操縱子序列、用于編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列和用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。例如，適于原核生物的調(diào)控序列包含啟動(dòng)子、任意的操縱子序列和RBS。適于真核細(xì)胞的調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。影響質(zhì)粒中的基因的表達(dá)量的最重要的因子是啟動(dòng)子。SRa啟動(dòng)子或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子可用作高表達(dá)啟動(dòng)子。為了表達(dá)本發(fā)明的DNA序列，任何一種表達(dá)調(diào)控序列可用于載體。表達(dá)調(diào)控序列可以是，例如，SV40或腺病毒的早期和后期啟動(dòng)子、Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac系統(tǒng)、trc系統(tǒng)、T3和T7啟動(dòng)子、噬菌體λ的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域、fd編碼蛋白的調(diào)控區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖解酶的啟動(dòng)子、磷酸酶的啟動(dòng)子(例如，啟動(dòng)子如Pho5)、酵母α-交配體系的啟動(dòng)子、具有原核或真核細(xì)胞或它們的病毒的調(diào)控表達(dá)已知的結(jié)構(gòu)或衍生物的其他序列，及其各種組合。當(dāng)將一個(gè)核酸置入與另一個(gè)核酸序列處于功能關(guān)系時(shí)，該核酸與該核酸序列可操作連接。合適的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)可以是基因和調(diào)控序列，其以這樣的方式連接以便當(dāng)它與調(diào)控序列連接時(shí)能使基因表達(dá)。例如，當(dāng)它表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白時(shí)，前序列或分泌性前導(dǎo)區(qū)的DNA與多肽的DNA可操作連接；當(dāng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作連接；當(dāng)RBS影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，RBS與編碼序列可操作連接；或當(dāng)RBS傾向于促進(jìn)翻譯時(shí)，RBS與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接的序列”指被連接的DNA序列是連續(xù)的，而且在分泌性前導(dǎo)區(qū)的情況中是連續(xù)的且在閱讀框中。但是，增強(qiáng)子不必接觸編碼序列。可通過(guò)在適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)中連接來(lái)進(jìn)行序列之間的連接。然而，當(dāng)沒(méi)有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時(shí)，根據(jù)普通方法可使用合成的寡核苷酸連接體和接頭。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，不是所有的載體和表達(dá)調(diào)控序列在表達(dá)本發(fā)明的DNA序列中發(fā)揮同等的功能。類(lèi)似地，相對(duì)于相同的表達(dá)系統(tǒng)，不是所有的宿主都發(fā)揮同等的功能。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在各種載體、表達(dá)調(diào)控序列和宿主中進(jìn)行合適的選擇，而不背離本發(fā)明的范圍或者承擔(dān)過(guò)量的實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān)。例如，選擇載體必須考慮宿主，因?yàn)檩d體必須在宿主中被復(fù)制。特別地，還必須考慮載體和由相應(yīng)的載體編碼的其他蛋白(例如，抗生素標(biāo)記)表達(dá)的拷貝數(shù)和拷貝數(shù)調(diào)控。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從上述變量的合適范圍內(nèi)的各種載體、表達(dá)調(diào)控序列和宿主中選擇適合的組合。而且，使用上文Sambrook等人的1.82部分描述的氯化鈣法，可以很容易地完成真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?；蛘?，電穿孔可用于這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(Neumann等人，EMBOJ.，1841(1982))。同時(shí)，利用土壤桿菌、病毒載體等等，通過(guò)普通方法可以進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)化。例如，用包含根據(jù)本發(fā)明的基因的重組載體轉(zhuǎn)化微生物，轉(zhuǎn)化的土壤桿菌微生物可以感染靶植物的組織，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物。例如，可以與WO94/11519或US6，103，956中公開(kāi)的使用轉(zhuǎn)化植物生產(chǎn)PHA的方法相同的方式或類(lèi)似的方式，獲得根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物。更具體地說(shuō)，轉(zhuǎn)染植物的產(chǎn)生可包括(a)預(yù)培養(yǎng)靶植物的外植體和共培養(yǎng)外植體與用于轉(zhuǎn)染植物的轉(zhuǎn)化的土壤桿菌；(b)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的外植體以獲得愈傷組織；和(C)切出愈傷組織并在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)切出的愈傷組織以獲得芽。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)外植體”指從植物切割的組織片段，而且包括子葉或胚軸。子葉或胚軸可用作植物的外植體，用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選使用通過(guò)消毒和清潔植物的種子，并在Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基中萌發(fā)種子而獲得的子葉。本發(fā)明中，待轉(zhuǎn)化的靶植物可以是煙草、番茄、紅辣椒、豆、水稻植物、玉米等等，但是本發(fā)明不限于此。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道即使用于轉(zhuǎn)化的植物是可有性繁殖的，它可通過(guò)組織培養(yǎng)等無(wú)性繁殖。有益效果如上面解釋的，本發(fā)明提供了一種能夠由蔗糖有效生產(chǎn)聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的細(xì)胞或植物和通過(guò)使該細(xì)胞或植物生長(zhǎng)或者培養(yǎng)該細(xì)胞或植物生產(chǎn)PLA和PLA共聚物的方法。圖1是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例制備含有來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的突變基因、來(lái)自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變基因和來(lái)自富氧羅爾斯通氏菌的PhaAB的基因的重組表達(dá)載體的方法的示意圖。具體實(shí)施例方式在下文中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的實(shí)施例。然而，本發(fā)明不限于下面公開(kāi)的實(shí)施例，但是可以各種修飾形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。提供本實(shí)施例足以使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能具體化和實(shí)施本發(fā)明。實(shí)施例1重組大腸桿菌的制備制備用pPs619C1400CPPCT532ReAB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌W。根據(jù)本實(shí)施例的大腸桿菌菌株W(ATCC9637)可代謝作為碳源的蔗糖。構(gòu)建制備用于本發(fā)明的pPs619C1400CPPCT532ReAB質(zhì)粒來(lái)表達(dá)4種主要的酶。這些主要的酶對(duì)大腸桿菌中聚(3-羥基丁酸酯-共-乳酸酯)的生物合成是必不可少的，聚(3-羥基丁酸酯-共-乳酸酯)是一種可生物降解的聚合物。這些主要的酶可以是phaClPs6_19400(其是來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19(KCTC11027BP)的聚合酶)、來(lái)自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(CP-PCT)(其是將輔酶A從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到要被轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的乳酸酯的酶)、和來(lái)自富氧羅爾斯通氏菌的酮硫解酶(PhaAlffi)和乙酰乙酰輔酶A還原酶(phaBEE)(其是用于由蔗糖合成3-羥基丁基-輔酶A的酶)。PPs619C1400CPPCT532ReAB質(zhì)粒包含分別編碼上述主要的酶的phaClPs6_19400、CPPCT532、phaAKE和phaBKE基因(參見(jiàn)圖1)。而且，通過(guò)突變phaClPs6_19的基因(其是SEQIDNO3的來(lái)自假單胞菌屬sp.的PHA合酶)和SEQIDNO1的CP-PCT的基因分別獲得phaClPs6_19400和CPPCT532基因，其對(duì)于PLA和PLA共聚物是有利的。制備pPs619C1400CPPCT532ReAB質(zhì)粒以在重組大腸桿菌中組成性表達(dá)全部4種基因。實(shí)施例1-1由假單胞菌屬sp.6-19制備PHA合酶的底物特異性突變體在各種PHA合酶中，II型PHA合酶已知為中鏈長(zhǎng)的PHA(MCL-PHA)合酶，用于聚合具有相對(duì)較多碳原子的底物，而且期待MCL-PHA合酶在生產(chǎn)PLA共聚物中非常有用。雖然來(lái)自假單胞菌屬sp.61-3的phaCl合酶是II型合酶，其與根據(jù)本發(fā)明獲得的phaClPs6_19具有高度同源性，已經(jīng)報(bào)道PhaCl合酶具有相對(duì)寬范圍的底物特異性(Matsusaki等人，J.Bacteriol.，180:6459，1998)，并報(bào)道了對(duì)適于生產(chǎn)短鏈長(zhǎng)PHA(SCL-PHA)的突變體的研究結(jié)果(Takase等人，Biomacromolecules,5480,2004)?；谏鲜鲅芯?，如韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第10-2006-0116234號(hào)中公開(kāi)的，使用影響SCL激活的氨基酸通過(guò)SDM方法，本發(fā)明人制備了phaClPS6_19合酶的突變體。更具體地說(shuō)，為了從假單胞菌屬sp.6-19(KCTC11027BP)分離PHA合酶(phaClPs6_19)基因，提取假單胞菌屬sp.6-19的總DNA，根據(jù)phaClPs6_19的堿基序列(Ae-jinSong,Master'sThesis,DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering,KAIST，2004)制備具有SEQIDNO:5和6的堿基序列的引物，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以獲得phaClPs6_19基因。SEQIDNO55'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3'SEQIDNO65'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3'當(dāng)對(duì)PCR反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，證實(shí)了對(duì)應(yīng)于phaClPs6_19基因的1.7kbp基因片段。為了表達(dá)phaClPs6_19合酶，采用操縱子型組成型表達(dá)系統(tǒng)，其中同時(shí)表達(dá)單體供給酶和合酶。用BamHI/EcoRI切割來(lái)自pSYL105載體(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994,441337-1347)的DNA片段，其含有來(lái)自富氧羅爾斯通氏菌H16的產(chǎn)生PHB的操縱子，然后插入到pBluescriptII(Stratagene)的BamHI/EcoRI限制性位點(diǎn)，從而制備pReCAB重組載體。已知pReCAB載體通過(guò)PHB操縱子啟動(dòng)子組成性表達(dá)PHA合酶(phaCKE)和單體供給酶(phaAKE*phaBKE)，而且在大腸桿菌中有效地被操縱(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，441337-1347)。用BstBI/Sbfl切割pReCAB載體以除去富氧羅爾斯通氏菌H16PHA合酶(phaCRE)，并將phaClPs6_19基因插入到BstBI/Sbfl限制性位點(diǎn)，從而制備pPs619CI-ReAB重組載體。為了制備在任意一個(gè)末端具有僅僅一個(gè)BstBI/Sbfl限制性位點(diǎn)的phaClPs6_19合酶基因片段，通過(guò)定點(diǎn)誘變(SDM)除去內(nèi)源的BstBI位點(diǎn)而不改變氨基酸，并使用具有SEQIDNO7和8、9和10、以及11和12的堿基序列的引物，通過(guò)重疊PCR添加BstBI/Sbfl限制性位點(diǎn)。SEQIDNO75'-atgcccggagccggttcgaa~3'SEQIDNO85'-CGTTACTCTTGTTACTCATGATTTGATTGTCTCTC-3'SEQIDNO95'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3‘SEQIDNO105'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3‘SEQIDNO115'-GTACGTGCACGAACGGTGACGCTTGCATGAGTG-3‘SEQIDNO125‘-aacgggagggaacctgcagg-3‘通過(guò)測(cè)序證實(shí)制備的PPs619Cl-ReAB重組載體的phaClPs6_19基因的序列，并表示為SEQIDNO:3，而且由SEQIDNO3的堿基序列編碼的氨基酸的序列表示為SEQIDNO4。為了檢驗(yàn)phaClPs6_19合酶是否生產(chǎn)PHB，將PPs619Cl-ReAB重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-IBlue(Stratagene)中，然后轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生長(zhǎng)于PHB檢測(cè)培養(yǎng)基(LuriaBertani(LB)瓊脂，葡萄糖20g/L，尼羅紅0.5μg/ml)中。結(jié)果，沒(méi)有檢測(cè)到PHB產(chǎn)物。通過(guò)氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)了影響SCL活性的3個(gè)氨基酸位點(diǎn)，并使用表1中所示的SEQIDNO1318的引物，通過(guò)SDM制備了phaClPs6_19合酶的突變體。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>S325TSEQIDNO135'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3'SEQIDNO145'-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'Q481MSEQIDNO155'-CGAGCAGCGGGCATATCATGAGCATCCTGAACCCGC-3'SEQIDNO165'-GCGGGTTCAGGATGCTCATGATATGCCCGCTGCTCG-3'E130DSEQIDNO:17:5'-ateaacctcatgaccgatgcgatggcgccgacc_3'SEQIDNO:18:5'-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat_3'重組載體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-IBlue中，并生長(zhǎng)于PHB檢測(cè)培養(yǎng)基中(LB瓊脂，葡萄糖20g/L，尼羅紅0.5μg/ml)。結(jié)果，在用pPs619C1200-ReAB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL-IBlue和用pPs619C1300-ReAB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL-IBlue中都能證實(shí)PHB的生產(chǎn)。也就是說(shuō)，由于單體供給酶(phaAKE和phaBKE)，由蔗糖產(chǎn)生了3HB-輔酶A，而且phaClPs6_19合酶SCL突變體(phaClPs6_19200&phaClPs6_19300)利用3HB-輔酶A作為底物合成了PHB。這里，為了構(gòu)建表達(dá)來(lái)自丙酸梭菌的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(CP-PCT)的操縱子型組成型表達(dá)系統(tǒng)，其用于提供作為合成PLA和PLA共聚物所需的單體的乳酰輔酶A，使用cp-pct基因。對(duì)于cp-pct基因，使用SEQIDNO19和20的引物，通過(guò)PCR克隆由聚合丙酸梭菌的染色體DNA獲得的DNA片段。在這種情況下，通過(guò)SDM除去野生型cp-pct基因中存在的NdeI位點(diǎn)以便于克隆。SEQIDNO195'-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGASEQIDNO205'-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg還使用SEQIDNO21和22的引物進(jìn)行重疊PCR，以便添加Sbfl/Ndel限制性位點(diǎn)。SEQIDNO215‘-aggcctgcaggcggataacaatttcacacagg-3‘SEQIDNO225'-gcccatatgtctagattaggacttcatttcc_3'包含phaClPs6_19300的pPs619C1300_ReAB載體(phaClPs6_19300是phaClPs6_19合酶SCL突變體)用Sbfl/Ndel切割以從富氧羅爾斯通氏菌H16除去單體供給酶(phaAKE和phaBKE)，并將PCR克隆的cp-pct基因插入到Sbfl/Ndel限制性位點(diǎn)中，從而產(chǎn)生pPs619C1300-CPPCT重組載體。類(lèi)似地，使用下列引物產(chǎn)生各種PHA合酶突變體。產(chǎn)生的突變體排列在下面的表2到5中。E130DSEQIDNO:175'-ateaacctcatgaccgatgcgatggcgccgacc_3'SEQIDNO:18:5'-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat_3'S325TSEQIDNO135'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3'SEQIDNO145'-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'S477RSEQIDNO235'-gaattcgtgctgtcgagecgcgggcatatc_3'SEQIDNO-.24-.5'-gatatgcccgcggetcgacagcacgaattc_3'S477HSEQIDNO255'-gaattcgtgctgtcgagecatgggcatatc_3'SEQIDNO:26:5'-gatatgcccatggetcgacagcacgaattc_3'S477FSEQIDNO275'-gaattcgtgctgtcgagetttgggcatatc_3'SEQIDNO285'-gatatgcccaaagetcgacagcacgaattc~3'S477YSEQIDNO295'-gaattcgtgctgtcgagetatgggcatatc_3'SEQIDNO:30:5'-gatatgcccatagetcgacagcacgaattc_3'S477GSEQIDNO315'-gaattcgtgctgtcgageggcgggcatatc-3'SEQIDNO:32:5'-gatatgcccgccgetcgacagcacgaattc_3'Q481KSEQIDNO:33:5'-gggcatateaaaageatectgaacccgc_3'SEQIDNO345'-gcgggtteaggatgcttttgatatgccc_3'Q481MSEQIDNO:35:5'-gggcatateatgageatectgaacccgc_3'SEQIDNO365'-gcgggtteaggatgcteatgatatgccc_3'Q481RSEQIDNO:37:5'-gggcatatecgcageatectgaacccgc_3'SEQIDNO385'-gcgggtteaggatgctgcggatatgccc_3'[表2]組合酶ι核酸取代酸取代ι引物pPs619C1200AGC—ACCS325T__SEQIDNO:13和14_CAG—ATGQ481M__SEQIDNO:35和36pPs619C1202GAA-^GATE130D__SEQIDNO:17和18__CAG—AAAQ481K__SEQIDNO:33和34pPs619C1203AGC—ACCS325T__SEQIDNO:13和14_CAG—AAAQ481K__SEQIDNO:33和34tjAA-^GAT^EQTPTO:IT^TO_CAG-^ATGQ481M__SEQIDNO:35和36pPs619C1205GAA—GATE130D__SEQIDNO:17和18_CAG-CGCQ481RSEQIDNO:37和38[表3]"i組合酶I核酸取代酸取代I引物pPs619C1300|GAA—GAT|E130D|SEQIDNO:17和18<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>使用上述的易錯(cuò)PCR，對(duì)最終選擇的突變體512和522進(jìn)行隨機(jī)誘變，從而獲得下面的CP-PCT突變體531-537。[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>其后，為了擴(kuò)增包含CpPct532突變的PCR片段，使用SEQIDNO:39和40的引物，在通常條件下，進(jìn)行PCR方法。用Sbfl/Ndel切割pPs619C1300-CPPCT載體，以除去野生型CP-PCT基因，并將擴(kuò)增的CpPct532PCR片段插入到Sbfl/Ndel限制性位點(diǎn)中，以產(chǎn)生連接混合物，從而產(chǎn)生用于下面的實(shí)施例1-3中的pPs619C1300-CPPCT532載體。實(shí)施例1-3:pPs619C1300-CPPCT532載體的制備使用SEQIDNO41和42的引物，利用phaClPs6_19合酶突變體(phaClPs6_19300)，通過(guò)SDM制備來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19的PHA合酶突變體(phaClPs6_19400)，其具有其中E130D、S325T、S477R和Q481M突變的氨基酸順序。SEQIDNO415'_ttcgtgctgtcgageagagggcatatc-3'SEQIDNO425'-gatatgccctctgetcgacagcacgaa_3'將得到的重組載體(pPs619C1400-CPPCT532)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，并生長(zhǎng)于包含3HB的聚合物檢測(cè)培養(yǎng)基(LB瓊脂，葡萄糖20g/L，3HB2g/L，尼羅紅0.5μg/ml)中。結(jié)果，檢測(cè)到聚合物產(chǎn)生。實(shí)施例1-4:PPs619C1400CPPCT532ReAB質(zhì)粒的制備和大腸桿菌的轉(zhuǎn)化為了產(chǎn)生包含phaClPs6_19400、CPPCT532、phaAEE和phaBEE基因的質(zhì)粒，phaClPs6_19400、CPPCT532、phaAKE和phaBKE基因分別編碼從蔗糖有效生產(chǎn)PLA和PLA共聚物所需的酶，對(duì)于產(chǎn)生PHB的啟動(dòng)子pReC和來(lái)自富氧羅爾斯通氏菌H16的phaAKE和phaBKE基因，分別使用SEQIDNO43和44的引物與SEQIDNO45和46的引物，對(duì)pSYL105載體(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，441337-1347)進(jìn)行PCR克隆。SEQIDNO435‘-agacatatgcaagtaccttgccgacatctatg-3‘SEQIDNO445'-gatgacaacgtcagtcatgatttgattgtctctctg_3'SEQIDNO455'-cagagagacaatcaaateatgactgacgttgtcatc~3'SEQIDNO465'-gcaggtcagcccatatgcag-3'PCR反應(yīng)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行純化，并使用PCR反應(yīng)物作為模板，和SEQIDNO43和46的引物，進(jìn)行重疊PCR。PCR反應(yīng)物和pPs619C1400CPPCT532載體用NdeI切割，并將PCR反應(yīng)物(pReC-phaABRE)插入到pPs619C1400CPPCT532載體的NdeI限制性位點(diǎn)，從而得到pPs619C1400CPPCT532ReAB載體，如圖1所示。在pPs619C1400CPPCT532ReAB載體中，產(chǎn)生PHB的啟動(dòng)子(pReC)另外被插入到phaAKE和phaBKE基因的前部分，以進(jìn)一步促進(jìn)靶phaARE和phaBRE基因的轉(zhuǎn)錄。重組載體(pPs619C1400CPPCT532ReAB)被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，并生長(zhǎng)于不含3HB的聚合物檢測(cè)培養(yǎng)基(LB瓊脂，葡萄糖20g/L，尼羅紅0.5μg/ml)中。結(jié)果，能觀察到聚合物產(chǎn)生。因此，可以證實(shí)另外插入到pPs619C1400CPPCT532載體中的phaAKdnphaBKE基因被正常表達(dá)和操縱。實(shí)施例2使用蔗糖作為碳源由重組大腸桿菌制備聚(3-羥基丁酸酯-共-乳酸酯)(P(3HB-共-LA))將包含100mg/L氨芐青霉素作為抗生素的LB瓊脂平板上的克隆，接種到3mL包含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并于30°C培養(yǎng)12小時(shí)，同時(shí)以200rpm攪動(dòng)。將ImL培養(yǎng)液分別接種到IOOmL甲基紅(MR)培養(yǎng)基與IOOmLLB培養(yǎng)基中，其含有100mg/L氨芐青霉素，20g/L蔗糖，和有時(shí)2g/L3-羥基丁酸酯。然后，每種培養(yǎng)液于30°C培養(yǎng)4天，同時(shí)以200rpm攪拌。使用10NNaOH調(diào)節(jié)MR培養(yǎng)基的初始pH到pH7。下面的表8中顯示了用于本培養(yǎng)方法中的培養(yǎng)基的例子。培養(yǎng)完成以后，從培養(yǎng)液回收生物量。回收的細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次，并在干燥器中保持在大約100°C干燥24小時(shí)。部分收集干燥的細(xì)胞并進(jìn)行氣相色譜(GC)分析，從而測(cè)定細(xì)胞中合成的P(3HB-共-LA)的含量。用于GC分析的標(biāo)準(zhǔn)材料是P(3HB-共-3HV)共聚物(包括大約12%的3HV，按重量計(jì))和PLA均聚物。GC分析結(jié)果示于下面的表9中。從表9中能看出，不管是否添加3HB，在MR和LB培養(yǎng)基中，都能生物合成P(3HB-共-LA)共聚物。而且，能證實(shí)在MR培養(yǎng)基中比在LB培養(yǎng)基中更有效地生物合成P(3HB-共-LA)共聚物。因此，使用根據(jù)本發(fā)明的重組大腸桿菌，能由蔗糖生產(chǎn)P(3HB-共-LA)共聚物。[表8]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*痕量溶液(/L)IOgFeSO4·H2O;2·25gZnSO4·H2O；IgCuSO4·H2O；0.5gMnS04·H2O；2gCaCl2·H2O；0.23gNa2B4O7·H2O；0.Ig(NH4)6Mo7O24；IOmL35%HCl。[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*Su:20g/L蔗糖**3HB:2g/L3_羥基丁酸酯雖然已經(jīng)參考其某些實(shí)施例顯示和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以多種形式和細(xì)節(jié)對(duì)其進(jìn)行各種改變，而不背離如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求一種由蔗糖生產(chǎn)聚乳酸酯(PLA)或羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法，包括在包含乳酸酯和蔗糖的環(huán)境或者包含乳酸酯、蔗糖和羥基鏈烷酸酯的環(huán)境中，培養(yǎng)細(xì)胞或植物或者使細(xì)胞或植物生長(zhǎng)，其中，所述細(xì)胞或植物包含將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因和使用乳酰輔酶A作為底物的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的基因，而且其能夠使用蔗糖作為底物生產(chǎn)PLA或羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物；和從所述細(xì)胞或植物中收獲PLA或羥基鏈烷酸酯-乳酸酯共聚物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過(guò)用將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因和使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因中的至少一種，轉(zhuǎn)化不含有將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因和使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因中的至少一種且能夠使用蔗糖作為底物的細(xì)胞或植物，來(lái)獲得所述細(xì)胞或植物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯_乳酸酯共聚物的羥基鏈烷酸酯是選自3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、4-羥基丁酸酯、具有6到14個(gè)碳原子的中鏈長(zhǎng)(D)-3-羥基羧酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式_己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二碳烯酸、3-羥基-6-順式-十二碳烯酸、3-羥基-5-順式-十四碳烯酸、3-羥基-7-順式-十四碳烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四碳烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基庚酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋(píng)果酸、3-羥基琥珀酸-甲酯、3-羥基己二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-甲酯、3-羥基壬二酸-甲酯、3-羥基癸二酸-甲酯、3-羥基辛二酸-乙酯、3-羥基癸二酸-乙酯、3-羥基庚二酸_丙酯、3-羥基癸二酸-芐酯、3-羥基-8-乙酸基辛酸、3-羥基-9-乙酸基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基己酸、對(duì)硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12-二羥基十二烷酸、3，8-二羥基-5-順式-十四碳烯酸、3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基壬酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-11-溴i^一烷酸、3-羥基-2-丁烯酸、6-羥基-3-十二碳烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因是丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(pet)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因是來(lái)自丙酸梭菌的pet基因。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因具有選自以下的一種SEQIDNO1的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDN0:1的堿基序列中的A1200G獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Gly335Asp獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp65Gly獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp65Asn獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Thrl99Ile獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Ala243Thr獲得的堿基序列；通過(guò)突變SEQIDNO1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp257Asn獲得的堿基序列；和通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C和突變SEQIDNO2的氨基酸序列中的Vall93Ala獲得的堿基序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因具有通過(guò)突變SEQIDNO:1的堿基序列中的A1200G和突變SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Ala243Thr獲得的堿基序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因是來(lái)自假單胞菌屬sp.6-19的PHA合酶的基因。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因具有對(duì)應(yīng)于以下的堿基序列SEQIDNO4的氨基酸序列；或者其中SEQIDNO4中選自E130D、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R中的至少一個(gè)突變的氨基酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述使用乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶的基因具有對(duì)應(yīng)于其中SEQIDNO4中的E130D、S325T、S477R和Q481M突變的氨基酸序列的堿基序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞或植物另外包含由蔗糖生產(chǎn)羥酰輔酶A的酶的基因。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述由蔗糖生產(chǎn)羥酰輔酶A的酶是酮硫解酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述酮硫解酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶來(lái)源于富氧羅爾斯通氏菌。14.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是細(xì)菌。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述細(xì)菌是大腸桿菌。全文摘要本發(fā)明提供了一種能夠由蔗糖生產(chǎn)聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的微生物和使用該微生物由蔗糖生產(chǎn)PLA或PLA共聚物的方法。把將乳酸酯轉(zhuǎn)變成乳酰輔酶A的酶的基因和使用乳酰輔酶A作為底物的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的基因引入到能夠使用蔗糖作為底物的微生物中，并使用蔗糖作為底物培養(yǎng)該微生物，從而有效地生產(chǎn)PLA或PLA共聚物。文檔編號(hào)C12N15/05GK101835895SQ200880105983公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年8月8日優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日發(fā)明者姜惠玉,樸時(shí)載,李相賢,梁宅鎬,金泰完申請(qǐng)人:Lg化學(xué)株式會(huì)社;韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院