專利名稱：生產(chǎn)氨基酸的微生物以及氨基酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸的微生物以及L-氨基酸的生產(chǎn)方法。L-賴氨酸、L-蘇 氨酸和L-色氨酸被廣泛地作為飼料添加劑等使用。此外，L-苯丙氨酸被作為甜味劑原料 使用。L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸可用于氨基酸輸液、滋補(bǔ)品。此外，L-絲氨酸可 以用作食品添加劑、化妝品的原料等。
背景技術(shù)：
為了通過(guò)使用微生物的發(fā)酵法生產(chǎn)L-氨基酸等目的物質(zhì)，可以采用使用野生型 微生物(野生株)的方法、使用從野生株衍生的營(yíng)養(yǎng)缺陷型株的方法、使用從野生株作為各 種藥物抗性突變株衍生的代謝調(diào)節(jié)突變株的方法、使用兼具營(yíng)養(yǎng)缺陷型株和代謝調(diào)節(jié)突變 株二者的性質(zhì)的菌株的方法等。近年來(lái)，在目的物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)中采用了重組DNA技術(shù)。例如，人們通過(guò)增強(qiáng)L-氨 基酸生物合成體系酶編碼基因或涉及L-氨基酸的分泌或抗性的蛋白質(zhì)的編碼基因的表 達(dá)、或者增強(qiáng)L-氨基酸生物合成體系的碳源流入來(lái)提高微生物的L-氨基酸生產(chǎn)性能。作為如上所述技術(shù)，例如，就L-賴氨酸而言，已知可以增強(qiáng)二氫吡啶二羧酸合酶、 天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶等酶的 編碼基因的表達(dá)(專利文獻(xiàn)1)，降低高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(專利文獻(xiàn)2)和蘋(píng)果 酸酶(malic enzyme)(專利文獻(xiàn)3)的活性等。就L-蘇氨酸而言，作為賦予L-蘇氨酸和/或L-高絲氨酸抗性的基因，可以列舉 下列rhtA基因(專利文獻(xiàn)4)、rhtB基因(專利文獻(xiàn)5)、rhtC基因(專利文獻(xiàn)6)、yfiK、 yeaS基因(專利文獻(xiàn)7)。此外，還包括增強(qiáng)編碼天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、高絲 氨酸激酶、蘇氨酸合酶、以及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)的基因的表達(dá)(專利 文獻(xiàn)8)，降低蘇氨酸脫氫酶的活性(專利文獻(xiàn)9)等。就L-色氨酸而言，已知有解除磷酸甘油酸脫氫酶、鄰氨基苯甲酸合酶的反饋抑制 (專利文獻(xiàn)10)，缺損色氨酸酶(專利文獻(xiàn)11)等。就L-苯丙氨酸而言，已知有解除分支酸變位酶_預(yù)苯酸脫水酶的反饋抑制(專利 文獻(xiàn)12)，以及缺損分支酸變位酶_預(yù)苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻遏物(專利文獻(xiàn)13)等。就L-纈氨酸而言，已知有生長(zhǎng)需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突變株(專利文獻(xiàn) 14)等；對(duì)于L-亮氨酸，已知有解除異丙基蘋(píng)果酸合酶的反饋抑制(專利文獻(xiàn)15)等；對(duì)于 L-異亮氨酸，已知有強(qiáng)化編碼蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合酶的基因等的表達(dá)(專利文獻(xiàn)16)寸。就L-絲氨酸而言，已知有攜帶降低了由絲氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的3-磷酸甘油酸 脫氫酶的菌株(專利文獻(xiàn)17)，具有L-絲氨酸生產(chǎn)能力且增強(qiáng)了磷酸絲氨酸磷酸酶活性或 磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性中的至少一種的細(xì)菌，缺失L-絲氨酸分解能力的細(xì)菌(專利文獻(xiàn) 18)，以及具有偶氮絲氨酸或β - (2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性且具有L-絲氨酸生產(chǎn)能力的 細(xì)菌(專利文獻(xiàn)19)等。
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專利文獻(xiàn)1美國(guó)專利第6，040, 160號(hào)專利文獻(xiàn)2美國(guó)專利第5，827，698號(hào)專利文獻(xiàn)3W02005/010175專利文獻(xiàn)4美國(guó)專利第6，303，348號(hào)專利文獻(xiàn)5歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第0994190號(hào)專利文獻(xiàn)6歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第1013765號(hào)專利文獻(xiàn)7歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第1016710號(hào)專利文獻(xiàn)8W02006/123專利文獻(xiàn)9美國(guó)專利第7，179，623號(hào)專利文獻(xiàn)10美國(guó)專利第6，180，373號(hào)專利文獻(xiàn)11美國(guó)專利第4，371，614號(hào)專利文獻(xiàn)12美國(guó)專利第5，354，672號(hào)專利文獻(xiàn)13W003/04419專利文獻(xiàn)14美國(guó)專利第5，888，783號(hào)專利文獻(xiàn)15美國(guó)專利第6，403，342號(hào)專利文獻(xiàn)16美國(guó)專利第5，998，178號(hào)專利文獻(xiàn)17美國(guó)專利第5，618，716號(hào)專利文獻(xiàn)18美國(guó)專利第6，037，154號(hào)專利文獻(xiàn)19美國(guó)專利第6，258，573號(hào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的課題是提供能夠高效生產(chǎn)L-氨基酸的菌株，以及提供使用該菌株高效 生產(chǎn)L-氨基酸的方法。解決問(wèn)題的手段傳統(tǒng)的L-氨基酸生產(chǎn)主要是以糖類作為碳源，利用丙酮酸脫氫酶為T(mén)CA循環(huán)提供 乙酰CoA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但是，丙酮酸脫氫酶的反應(yīng)伴有脫碳酸，必然要釋放1分子的C02。因此， 本發(fā)明人等認(rèn)為，為了進(jìn)一步提高生產(chǎn)力，必須要減少這種脫碳酸。于是，本發(fā)明人等為解 決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙醇、脂肪酸等能提供乙酰CoA的物質(zhì)為碳源， 通過(guò)提高催化碳酸固定反應(yīng)的酶一丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的酶活性，進(jìn) 一步通過(guò)增強(qiáng)鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性(該酶具有分別從氧化型鐵氧還蛋白或氧 化型黃素氧還蛋白生成對(duì)丙酮酸合酶的酶活性而言必要的還原型鐵氧還蛋白或還原型黃 素氧還蛋白的活性)、或者通過(guò)提高鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白產(chǎn)生能力，能夠提高L-氨 基酸的生產(chǎn)力，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下述。(1). 一種微生物，其具有生產(chǎn)選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、 L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-氨基酸的能力，且經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng) 了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。(2).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸合酶的活性。
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(3).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。(4).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性是通過(guò) 增加編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的表達(dá)量和/或增加所述基因的 翻譯量而增強(qiáng)的。(5).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性是通過(guò) 提高編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的拷貝數(shù)或修飾所述基因的表達(dá) 調(diào)節(jié)序列而增強(qiáng)的。(6).上述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因編碼下述㈧ ⑶中任一 項(xiàng)所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、(I)和(J) 的多肽(A)包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQ ID NO 2中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨 基酸序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(C)包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的多肽；(D)包含在SEQ ID NO 4中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨 基酸序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(E)下述(El)或(E2)的多肽(El)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(E2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能夠與至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質(zhì)復(fù)合體的多肽；(F)下述(Fl)或(F2)的多肽(Fl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(F2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能夠與至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質(zhì)復(fù)合體的多肽；(G)下述(Gl)或(G2)的多肽(Gl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(G2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質(zhì)復(fù)合體的多肽；(H)下述(Hl)或(H2)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質(zhì)復(fù)合體的多肽；(I)下述(Il)或(12)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 65所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 65中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的
7氨基酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的 蛋白質(zhì)復(fù)合體的多肽；(J)下述(Jl)或(J2)的多肽(Jl)包含SEQ ID NO 67所示的氨基酸序列的多肽；(J2)包含在SEQ ID NO 67中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的 蛋白質(zhì)復(fù)合體的多肽。(7).上述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因包含下述(a) (d)中任 一項(xiàng)的 DNA，或下述(e)、(f)、(g)和(h)的 DNA，或下述(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和(j)的 DNA (a)具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列的DNA ；(b)與SEQ ID NO :1所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探 針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(c)具有SEQ ID NO 3所示的堿基序列的DNA ；(d)與SEQ ID NO 3所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探 針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(e)下述(el)或(e2)的 DNA (el)具有SEQ ID NO 56所示的堿基序列的DNA ；(e2)與SEQ ID NO 56所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的 探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(f)下述(f 1)或(f2)的 DNA (fl)具有SEQ ID NO 58所示的堿基序列的DNA ；(f2)與SEQ ID NO 58所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的 探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(g)下述(gl)或(g2)的 DNA (gl)具有SEQ ID NO 60所示的堿基序列的DNA、(g2)與SEQ ID NO 60所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的 探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(h)下述(hi)或(h2)的 DNA (hi)具有SEQ ID NO 62所示的堿基序列的DNA、(h2)與SEQ ID NO 62所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的 探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；⑴下述(il)或(i2)的DNA (hi)具有SEQ ID NO 64所示的堿基序列的DNA ；(h2)與SEQ ID NO :64所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的
8探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA —起編碼具有丙 酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(j)下述(jl)或(j2)的 DNA (jl)具有SEQ ID NO 66所示的堿基序列的DNA ；(j2)與SEQ ID NO 66所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的 探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA —起編碼具有丙 酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA。(8).上述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因編碼下述(A)或 ⑶所示的多肽(A)包含SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQ ID NO 6中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨
基酸序列，并且具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽。(9).上述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因包含下述(a)或 (b)的 DNA (a)具有SEQ ID NO 5所示的堿基序列的DNA ；(b)與SEQ ID NO 5所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探 針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽的DNA。(10).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性。(11).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而提高了產(chǎn)生鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的能 力。(12).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而降低了蘋(píng)果酸酶的活性。(13).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而降低了丙酮酸脫氫酶活性。(14).上述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾從而能夠以需氧方式同化乙醇。(15).上述的微生物，其中，所述微生物是屬于選自埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌 屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬中的屬的細(xì)菌。(16).上述的微生物，其中，該微生物的NAD型蘋(píng)果酸酶和NADP型蘋(píng)果酸酶二者的 活性均已降低。(17).上述的微生物，其中，所述微生物為棒狀桿菌型細(xì)菌。(18). 一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的微生物，使該培養(yǎng) 基中或菌體內(nèi)生成并蓄積選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、 L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌體收集L-氨基酸。(19).上述的方法，其中，所述培養(yǎng)基的特征在于含有乙醇或脂肪酸作為碳源。


[圖1]顯示源自纖細(xì)裸藻(Euglenagracilis)的丙酮酸NADP+氧化還原酶 (PNO)基因的表達(dá)的Western印跡照片。泳道1 分子量標(biāo)記，泳道2 :WC196 Δ cadA Δ IdcC/ pCABD2/pMW-Pthr 的粗酶抽提液，泳道 3 :WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PN0 的粗 酶抽提液發(fā)明的具體實(shí)施方式
以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。<1>本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物是具有生產(chǎn)選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、 L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、以及L-絲氨酸中的L-氨基酸的能力，且經(jīng)過(guò)了修飾而 增強(qiáng)了丙酮酸合酶或丙酮酸=NADP+氧化還原酶的活性的微生物。在本發(fā)明中，如無(wú)特殊說(shuō)明，"L-氨基酸”是指所述的L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色 氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、和/或L-絲氨酸。“L-氨基酸生產(chǎn)能力”是指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時(shí)，以可從細(xì)胞或培 養(yǎng)基中回收的程度在細(xì)胞或培養(yǎng)基中生成、蓄積L-氨基酸的能力。本發(fā)明的微生物所生產(chǎn) 的L-氨基酸可以是1種氨基酸，也可以是2種或2種以上的L-氨基酸。作為具備L-氨基 酸生產(chǎn)能力的微生物，可以是本身具備L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物，也可以是通過(guò)利用突 變法或重組DNA技術(shù)對(duì)如下文所述的微生物進(jìn)行修飾而具備了 L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生 物，或者可以是通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明的基因而被賦予了 L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物。此外，“增強(qiáng)丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性”包括如下兩方面含 義在本身具有丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的微生物中，增強(qiáng)所述兩種酶中的 至少一種的活性；以及，對(duì)于賦予不具有丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的微生物， 賦予其所述兩種酶中的至少一種酶的活性。<1-1>L-氨基酸生產(chǎn)能力的賦予本發(fā)明的微生物可以通過(guò)以具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物作為親本株，對(duì)其 進(jìn)行修飾以增強(qiáng)丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶或這兩者的活性來(lái)獲得。本發(fā)明 的微生物還可以通過(guò)以經(jīng)過(guò)了修飾使得丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增 強(qiáng)的微生物作為親本株，并對(duì)其賦予或增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)能力來(lái)獲得。以下，示例說(shuō)明對(duì)微生物賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法以及能夠在本發(fā)明中使 用的被賦予了 L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物。但是，微生物只要具有L-氨基酸生產(chǎn)能力，并 不限于此。作為用于本發(fā)明的微生物，可以列舉例如，屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、 腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏 菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、摩根氏菌屬 (Morganella)等Y -變形細(xì)菌的腸桿菌科細(xì)菌，屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿 菌屬(Corynebacterium) ^WtfMM (Microbacterium)的所謂棒狀桿菌型(coryneform) 細(xì)菌，屬于脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、酵母屬 (Saccharomyces)等的微生物。Y -變形細(xì)菌可以使用依據(jù)NCBI (National Center for Biotechnology Information)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax. cgi · id = 91347)公布的分類法歸屬的微生物。作為埃希氏菌屬細(xì)菌，可以列舉大腸桿菌(Escherichia coli)等。在采用基因工 程方法選育大腸桿菌時(shí)，可以使用大腸桿菌K-12株及其衍生物大腸桿菌MG1655株(ATCC 47076)和W3110株(ATCC 27325)。大腸桿菌K-12株是在1922年由斯坦福大學(xué)分離出來(lái) 的，它是λ噬菌體的溶原菌，具有F因子，是一種能夠通過(guò)接合等手段來(lái)構(gòu)建遺傳重組體 的、通用性高的菌株。此外，大腸桿菌Κ-12株的基因組序列已經(jīng)測(cè)定，其基因信息也可以自
10由地使用。大腸桿菌K-12株及其衍生株可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)零售 獲得(住所ATCC，地址P. O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)。特別是，泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌和腸桿菌屬細(xì)菌是分類為Y-變形細(xì) 菌(γ -Proteobacteria)的細(xì)菌，它們?cè)诜诸悓W(xué)上的親緣關(guān)系非常近(J. Gen. Appl. Microbiol. 1997,43 :355_361 ；Int. J. Syst. Bacteriol. 1997,47 :1061_1067)。近年來(lái)， 依據(jù)DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)等，屬于腸桿菌屬的細(xì)菌中，有些被重新分類為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)或分散泛菌(Pantoeadispersa)等(Int.J. Syst. Bacteriol. 1989, 39 337-345)。此外，屬于歐文氏菌屬的細(xì)菌中，有些被重新分類為菠蘿泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(參照 Int.J. Syst. Bacteriol. 1993,43 162-173)。腸桿菌屬細(xì)菌包括例如成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)等。具體地，可以使用歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)952221號(hào)說(shuō)明書(shū)示例 的菌株。作為腸桿菌屬的代表性菌株，可以列舉成團(tuán)腸桿菌ATCC12287株。作為泛菌屬細(xì)菌的代表性菌株，可以列舉Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成團(tuán)泛 菌、檸檬泛菌(Pantoea citrea)。具體地，可以列舉下述菌株。Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)0952221 號(hào)說(shuō) 明書(shū))Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)0952221 號(hào)說(shuō) 明書(shū))而且，所述菌株在歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)0952221號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載為成團(tuán)腸桿菌，但 現(xiàn)在，如上文所述，依據(jù)16S rRNA堿基序列分析它們已被重新分類為Pantoea ananatis。作為歐文氏菌屬細(xì)菌，可以列舉解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿卜 軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)；作為克雷伯氏菌屬細(xì)菌，可以列舉植生克雷伯氏菌 (Klebsiella planticola)。具體地，可以列舉下述菌株。解淀粉歐文氏菌ATCC15580株胡蘿卜軟腐歐文氏菌ATCC15713株植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)955368號(hào)說(shuō)明 書(shū))植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)955368號(hào)說(shuō)明 書(shū))本發(fā)明所稱的棒狀桿菌型細(xì)菌包括這樣的微生物，它們是在《Bergey’ sManual of Determinative Bacteriology》第8版599頁(yè)(1974)中定義的一組微生物，包括為需氧性、 革蘭氏陽(yáng)性、非耐酸性、無(wú)芽孢形成能力的桿菌，曾經(jīng)歸類于短桿菌屬(Brevibacterium) 但現(xiàn)在已經(jīng)統(tǒng)一歸類于棒桿菌屬(Corynebacterium)的那些細(xì)菌(Liebl，W. et al. 1991， Int. J. Syst. Bacteriol. 41 :255_260)，還包括與棒桿菌屬極其近緣的短桿菌屬細(xì)菌和微桿 菌屬細(xì)菌。作為適于在L-谷氨酸類氨基酸的生產(chǎn)中應(yīng)用的棒狀桿菌型細(xì)菌，可以列舉例如 以下所示的菌株。口譽(yù)乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)0128]醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
0129]g醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)
0130]^^llfiif (Corynebacterium callunae)
0131]谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)
0132]百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)
0133]棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)
0134]嗜熱 產(chǎn)氨棒 桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) Corynebacteriumefficiens)
0135]力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)
0136]二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)(谷M基酸棒桿lif (Corynebacterium glutamicum))
0137]H fe ^S ff Ir (Brevibacterium flavum) ( # M Sl # ff ^ Corynebacteriumglutamicum))
0138]Brevibacterium immariophilum
0139]乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨基酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum))
0140]玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)
0141]角軍H短桿菌(Brevibacterium saccharoIyticum)
0142]生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)
0143]產(chǎn)氛短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)(產(chǎn)氛棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes))
0144]白fe棒桿菌(Brevibacterium album)
0145]賭狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)
0146]^mMMMM (Microbacterium ammoniaphilum)
0147]具體地，可以列舉諸如下述的菌株。
0148]嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)
0149]谷氨酸棒桿菌ATCC13032
0150]黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826、ATCC14067
0151]乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13665、ATCC13869
0152]產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒桿菌)ATCC6871
0153]用于本發(fā)明的細(xì)菌可以是具有乙醇同化性的細(xì)菌。作為這樣的細(xì)菌，可以是本來(lái) 具有乙醇同化性的細(xì)菌，也可以是被賦予了乙醇同化性的重組菌株，還可以是提高了乙醇 同化性的突變菌株。在大腸桿菌中，作為在厭氧條件下生成乙醇的酶，已知有可逆地催化以 下反應(yīng)的具有乙醛脫氫酶和醇脫氫酶活性的AdhE的存在。乙酰-CoA+NADH+H+ —乙醛 +NAD++CoA乙醛 +NADH+H+ —乙醇 +NAD+大腸桿菌在需氧條件下不能同化乙醇，但已知其通過(guò)AdhE的突變，可變得能夠以 需氧方式同化乙醇(Clark D. P.，and Cronan, J. Ε. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144 :179-184 ； MembrilΙο-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275 =33869-33875)。作為這樣的具有
12突變的AdhE突變體，具體地有大腸桿菌AdhE的第568位的谷氨酸殘基被谷氨酸和天冬氨 酸以外的氨基酸殘基、例如賴氨酸取代而得到的突變體(Glu568Lys、E568K)。而且，所述AdhE突變體還可以包含以下的附加突變。A)第560位的谷氨酸殘基被其它氨基酸殘基、例如賴氨酸殘基所取代；B)第566位的苯丙氨酸殘基被其它氨基酸殘基、例如纈氨酸殘基所取代；C)第22位的谷氨酸殘基、第236位的甲硫氨酸殘基、第461位的酪氨酸殘基、第 554位的異亮氨酸殘基以及第786位的丙氨酸殘基被其它氨基酸殘基、例如分別被甘氨酸 殘基、纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基以及纈氨酸殘基所取代；或D)上述突變的組合。已知谷氨酸棒桿菌具有多種醇脫氫酶，能夠以需氧方式同化乙醇(Pelechova， J. et al. 1980. Folia Microbiol (Praha) 25 :341_346)。用于本發(fā)明的細(xì)菌還可以是具有油脂或脂肪酸同化性的細(xì)菌。這樣的細(xì)菌可 以是本來(lái)就具有油脂或脂肪酸同化性的細(xì)菌，也可以是賦予了油脂或脂肪酸同化性的 重組菌株，還可以是提高了油脂或脂肪酸同化性的突變菌株。已知在大腸桿菌中能夠 同化鏈長(zhǎng) 12 以上的長(zhǎng)鏈脂肪酸(Clark，D. P. and Cronan, J. Ε. 1996. In Escherichia coli and Salmonella :Cellular andMolecular Biology/Second Edition(Neidhardt, F. C. Ed.) pp. 343-357)。而且，已知能夠利用中鏈、短鏈脂肪酸的大腸桿菌突變株(Nunn, W. D. et al. 1979. J. Biol. Chem. 254 :9130_9134 ；Salanitro, J. P. and Wegener, W. S. 1971. J.Bacteriol. 108 :885_892)。在本發(fā)明中，具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌是指具有下述能力細(xì)菌當(dāng)在培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，能夠生產(chǎn)L-氨基酸、并能夠使L-氨基酸在培養(yǎng)基中蓄積到可從培養(yǎng)基回收 的程度。優(yōu)選能夠使目的L-氨基酸以優(yōu)選0. 5g/L以上、更優(yōu)選1. 0g/L以上的量在培養(yǎng)基 中蓄積的細(xì)菌。L-氨基酸包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、 L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸。特別是，優(yōu)選L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-色 氨酸。以下，說(shuō)明對(duì)如上所述的細(xì)菌賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法，或增強(qiáng)如上所述的 細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法。為了賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力，可以使用在棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌等 氨基酸生產(chǎn)菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株、L-氨基酸類似物抗性菌 株或代謝調(diào)節(jié)突變菌株，創(chuàng)建L-氨基酸生物合成系統(tǒng)酶表達(dá)增強(qiáng)的重組菌株等等(參見(jiàn) 《7 S 7酸発酵》，(株)學(xué)會(huì)出版中心，1986年5月30日第一版發(fā)行，第77-100頁(yè))。這 里，在L-氨基酸生產(chǎn)菌的選育中，被賦予的營(yíng)養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變等性 質(zhì)可以是單獨(dú)一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達(dá)增強(qiáng)的L-氨基酸生物合成系 統(tǒng)酶可以是單獨(dú)一種，也可以是兩種或三種以上。另外，營(yíng)養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝 調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)的賦予與生物合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)可以組合進(jìn)行。具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體菌株、類似物抗性菌株或代謝調(diào)節(jié)突 變菌株可如下地獲得對(duì)親本菌株或野生型菌株施以常規(guī)突變處理，即χ-射線或紫外線照 射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等處理；其后，從所得的突變菌株中選 擇顯示營(yíng)養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變并且還具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的菌株。
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此外，可以通過(guò)進(jìn)行基因重組增強(qiáng)酶活性，來(lái)賦予或增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)能力。就 酶活性的增強(qiáng)而言，包括例如通過(guò)修飾細(xì)菌以增強(qiáng)編碼與L-氨基酸的生物合成相關(guān)的基 因的表達(dá)的方法。增強(qiáng)基因的表達(dá)的方法可以通過(guò)下述方式實(shí)現(xiàn)導(dǎo)入通過(guò)將包含所述基 因的DNA片段導(dǎo)入合適的質(zhì)粒(例如至少包含負(fù)責(zé)質(zhì)粒在微生物內(nèi)的復(fù)制增殖功能的基因 的質(zhì)粒載體)而得到的擴(kuò)增質(zhì)粒；或者通過(guò)接合、基因轉(zhuǎn)移等使所述基因在染色體上多拷 貝化；抑或在這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)胪蛔兊?參考國(guó)際公開(kāi)小冊(cè)子W095/34672號(hào))。當(dāng)向上文所述的擴(kuò)增質(zhì)?；蛘呷旧w上導(dǎo)入目的基因時(shí)，用于表達(dá)所述基因的啟 動(dòng)子可以是任何能夠在屬于腸桿菌科的細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，可以是所使用的基因自 身的啟動(dòng)子，也可以是經(jīng)過(guò)修飾的啟動(dòng)子。也可以通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇在L-氨基酸生產(chǎn)菌中強(qiáng) 力發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，或者通過(guò)使啟動(dòng)子的-35、-10區(qū)域與共有序列接近，來(lái)進(jìn)行基因表 達(dá)量的調(diào)節(jié)。如上所述的增強(qiáng)酶基因表達(dá)的方法，在W000/18935號(hào)小冊(cè)子、歐洲專利申請(qǐng) 公開(kāi)1010755號(hào)說(shuō)明書(shū)等中有記載。下面，對(duì)于給細(xì)菌賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法、以及被賦予了 L-氨基酸生產(chǎn)能 力的細(xì)菌進(jìn)行示例。L-賴氨酸生產(chǎn)菌屬于埃希氏菌屬的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的實(shí)例可以列舉出對(duì)L-賴氨酸類似物具有 抗性的突變株。L-賴氨酸類似物可抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是這種抑制在當(dāng) L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時(shí)會(huì)被全部或部分解除。L-賴氨酸類似物的實(shí)例可以列舉出、但 不限于，氧代賴氨酸，賴氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate), S_(2_氨乙基)_L_半胱氨酸 (AEC)，γ -甲基賴氨酸，α-氯代己內(nèi)酰胺等。這些賴氨酸類似物具有抗性的突變株可以通 過(guò)對(duì)屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的人工誘變處理來(lái)得到?？捎糜贚-賴氨酸生產(chǎn)的菌 株的具體實(shí)例可以列舉出大腸桿菌AJ11442(參考FERMBP-1543，NRRL B-12185 ；參見(jiàn)美國(guó) 專利第4，346，170號(hào))和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L-賴氨酸對(duì)由天冬氨酸激酶 的反饋抑制已被解除。WC196株可以用作大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌。該菌株是通過(guò)對(duì)大腸桿菌K_12 來(lái)源的W3110株賦予AEC抗性來(lái)選育獲得的。該菌株被命名為大腸桿菌AJ13069，于1994 年12月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜 合研究所專利生物保藏中心，〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第 6)，保藏號(hào)FERMP-14690，并于1995年9月29日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，保藏號(hào) FERM ΒΡ-5252 (美國(guó)專利第 5，827，698 號(hào))。作為L(zhǎng)-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-賴氨酸生產(chǎn)菌的親本株，可以列舉出L-賴 氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種或者2種以上的活性被增強(qiáng)的菌株。相關(guān)的酶包括，但不限 于二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、二 氨基庚二酸脫羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國(guó)專利第6，040, 160號(hào))、磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、二氨 基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD) (tetrahydrodipicolinic acidsuccinylase)、琥拍酉先二氨基庚二酸脫酉先酶(dapE) (succinyl diamino pimelicacid deacylase)以及天冬氨酸酶基因(aspA) (EP 1253195A)。酶名稱后的括號(hào)內(nèi)為基因名稱 (下同)。在這些酶中，特別優(yōu)選為二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶、 天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶。此外， 可以增強(qiáng)親本株中下述基因的表達(dá)水平與能量效率相關(guān)的基因(cyo) (EP 1170376A)、 編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(PntAB)(美國(guó)專利第5，830，716號(hào))、ybjE基因 (W02005/073390)、或所述基因的組合。作為L(zhǎng)-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-氨基酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，還可以列舉 催化通過(guò)從L-氨基酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶的活性 減少或者缺損的菌株。作為催化通過(guò)從L-賴氨酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸之 外的化合物的反應(yīng)的酶的例子，可以列舉出高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國(guó)專利第 5，827，698 號(hào))、和蘋(píng)果酸酶(W02005/010175)。作為優(yōu)選的L-賴氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉出大腸桿菌WC196 Amez/ pCABD2(W02005/010175)、WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2 (W02006/078039)等。WC196Amez/ PCABD2株是通過(guò)在WC196 Amez株中導(dǎo)入美國(guó)專利第6040160所述的質(zhì)粒pCABD2而獲得的 菌株，所述WC196 Δ mez株是通過(guò)破壞WC196株的編碼蘋(píng)果酸酶的sfcA和b2463基因而制 作的。WC196Amez株的詳細(xì)情況在W02005/010175中有記載。sfcA基因和b2463基因的 堿基序列、以及各基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:52 55所示。WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2株是通過(guò)在編碼賴氨酸脫羧酶的cadA以及IdcC基因 被破壞的WC196株中導(dǎo)入美國(guó)專利第6040160所述的質(zhì)粒pCABD2而獲得的菌株。pCABD2 包含編碼具有解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的突變的大腸桿菌來(lái)源二氫吡啶二羧 酸合成酶(DDPS)的突變型dapA基因、編碼具有解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的突變 的大腸桿菌來(lái)源天冬氨酸激酶III的突變型IysC基因、編碼源自大腸桿菌的二氫吡啶二羧 酸還原酶的dapB基因、以及編碼源自乳發(fā)酵短桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因。L-蘇氨酸生產(chǎn)菌作為具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的微生物優(yōu)選實(shí)例可以列舉出增強(qiáng)了 L-蘇氨酸生物 合成系統(tǒng)酶的1種或2種以上的活性的細(xì)菌。作為L(zhǎng)-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶，可以列舉出 天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、thr操縱子所編碼的天冬氨酸 激酶I基因(thrA)、高絲氨酸激酶基因(thrB)、蘇氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)(aspC)。括號(hào)里為該基因的簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào)(下同)。這些酶中特別優(yōu)選天 冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶、以及蘇氨酸合酶。也可以將L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)基因?qū)胩K氨酸分解受到抑制的埃 希氏屬細(xì)菌中。作為蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細(xì)菌，例如可以列舉出蘇氨酸脫氫 酶活性缺損的TDH-6菌株(特開(kāi)2001-346578號(hào)、美國(guó)專利第7，179，623號(hào))。L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶的酶活性受最終產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸的抑制。因此，為了構(gòu)建 L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，優(yōu)選對(duì)L-蘇氨酸生產(chǎn)菌合成系統(tǒng)基因進(jìn)行修飾以使所述酶不受L-蘇氨 酸的反饋抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，蘇氨酸操縱子形成 弱化子(attenuator)結(jié)構(gòu)，蘇氨酸操縱子的表達(dá)受到培養(yǎng)液中異亮氨酸和蘇氨酸的抑制， 并且表達(dá)受到弱化作用的抑制。這種修飾可通過(guò)去除弱化區(qū)中的前導(dǎo)序列或弱化子來(lái)實(shí)現(xiàn) (參照 Lynn，S. P. et al.，J. F. J. Mol. Biol. 194 :59_69 (1987)；國(guó)際公開(kāi)第 02/26993 號(hào)小 冊(cè)子；國(guó)際公開(kāi)第2005/049808號(hào)小冊(cè)子)。
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蘇氨酸操縱子的上游存在天然啟動(dòng)子，但可以用非天然啟動(dòng)子將其取代(參考 W098/04715號(hào)小冊(cè)子)，也可以構(gòu)建蘇氨酸操縱子使得蘇氨酸生物合成的相關(guān)的基因的表 達(dá)受到λ噬菌體的阻遏物Oppressor)和啟動(dòng)子的調(diào)控(參考?xì)W洲專利第0593792號(hào)說(shuō) 明書(shū))。此外，為了對(duì)細(xì)菌進(jìn)行修飾使其不受L-蘇氨酸的反饋抑制，可以通過(guò)選擇對(duì)α -氨 基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于如上所述經(jīng)修飾而不受L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子而言，優(yōu)選的 是其在宿主內(nèi)的拷貝數(shù)有所提高、或者是其連接于強(qiáng)啟動(dòng)子而表達(dá)量有所增加。除了通過(guò) 使用質(zhì)粒的擴(kuò)增來(lái)提高拷貝數(shù)之外，還可以通過(guò)使用轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體等向基因組中轉(zhuǎn)移 蘇氨酸操縱子來(lái)提高拷貝數(shù)。理想的是，除了 L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶之外，還增強(qiáng)與糖酵解系統(tǒng)、TCA循環(huán)或 呼吸鏈相關(guān)的基因或調(diào)控基因表達(dá)的基因，或者糖攝取基因。這些在L-蘇氨酸生產(chǎn)中有效 的基因的實(shí)例可以列舉出，轉(zhuǎn)氫酶基因(PntAB)(歐洲專利733712號(hào)說(shuō)明)、磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶基因(PepC)(國(guó)際公開(kāi)95/06114號(hào)小冊(cè)子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(歐 洲專利877090號(hào)說(shuō)明書(shū))、棒狀桿菌型細(xì)菌或者芽孢桿菌屬細(xì)菌的丙酮酸羧化酶基因(國(guó) 際公開(kāi)99/18228號(hào)小冊(cè)子、歐洲申請(qǐng)公開(kāi)1092776號(hào)說(shuō)明書(shū))。此外，強(qiáng)化賦予L-蘇氨酸抗性的基因、賦予L-高絲氨酸抗性的基因的表達(dá)，或?qū)?宿主賦予L-蘇氨酸抗性、L-高絲氨酸抗性，也是合適的。作為可以賦予抗性的基因的實(shí)例， 可以列舉出rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 (2003) )、rhtB基因(歐洲專利申請(qǐng) 公開(kāi)第0994190號(hào)說(shuō)明書(shū))、rhtC基因(歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第1013765號(hào)說(shuō)明書(shū))、yfiK、 yeaS基因(歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第1016710號(hào)說(shuō)明書(shū))。此外，關(guān)于對(duì)宿主賦予L-蘇氨酸抗 性的方法，可以參考?xì)W洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第0994190號(hào)說(shuō)明書(shū)、國(guó)際公開(kāi)第90/04636號(hào)小冊(cè) 子中所記載的方法。作為L(zhǎng)-蘇氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，可以列 舉大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國(guó)專利第5，175，107號(hào)、美國(guó)專利第 5，705，371 號(hào))、大腸桿菌 472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美國(guó)專利第 5，631，157 號(hào))、大 腸桿菌NRRL-21593 (美國(guó)專利第5，939，307號(hào))、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國(guó)專利第 5，474，918 號(hào))、大腸桿菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美國(guó)專利第 5，376，538 號(hào))、大 腸桿菌 MG442 (Gusyatiner etal.，Genetika (俄語(yǔ))，14，947-956 (1978))、大腸桿菌 VL643 和VL2055(EP1149911A)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突變(leaky mutation) 0該菌株的rhtA基因也有賦予對(duì)高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性的突變。 B-3996菌株包含pVIC40，pVIC40是通過(guò)將含有突變的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到 由RSF1010獲得的載體中而獲得的。這種突變的thrA基因編碼的天冬氨酸激酶高絲氨酸 脫氫酶I對(duì)蘇氨酸的反饋抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于 All-UnionScientific Center of Antibiotics (全聯(lián)盟抗生素禾斗學(xué)中心)(Nagatinskaya Street3-A, 117105 Moscow，Russia)，保藏號(hào)為 RIA 1867。該菌株也在 1987 年 4 月 7 日 保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)(1 Dorozhny proezd. ,1 Moscowll7545, Russia),保藏號(hào)為 B-3996。
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還可以使用大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作為L(zhǎng)-蘇氨酸生產(chǎn)菌或用于 衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株。B-5318菌株是異亮氨酸原養(yǎng)型的，并且PVIC40質(zhì)粒中 的蘇氨酸操縱子的調(diào)控區(qū)域被置換為溫度敏感的λ噬菌體Cl阻遏物和冊(cè)啟動(dòng)子。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，1 Dorozhny proezd.，1 Moscowll7545, Russia)，保藏號(hào)為 VKPM B-5318。編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的大腸桿菌thrA基因已經(jīng)闡明(核苷酸編 號(hào) 337 至 2799，GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi 49175990)。thrA 基因位于大腸桿菌 K-12 染色體上thrL基因和thrB基因之間。大腸桿菌的編碼高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)闡明 (核苷酸編號(hào) 2801 至 3733，GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB 基因位于大 腸桿菌K-12染色體上的thrA基因和thrC基因之間。大腸桿菌的編碼蘇氨酸合酶的thrC 基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號(hào)3734至5020，GenBank登錄號(hào)NC_000913. 2，gi =49175990)。 thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開(kāi)放閱讀框之間。所述3個(gè)基因 全部作為一個(gè)單獨(dú)的蘇氨酸操縱子發(fā)揮功能。為增強(qiáng)蘇氨酸操縱子的表達(dá)，優(yōu)選從操縱子 中將影響轉(zhuǎn)錄的弱化子區(qū)域去除(W02005/049808，W02003/097839)。編碼對(duì)蘇氨酸的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA 基因，以及thrB和thrC基因可以作為一個(gè)操縱子從熟知的PVIC40質(zhì)粒中獲得，該質(zhì)粒存 在于蘇氨酸生產(chǎn)株大腸桿菌VKPM B-3996菌株中。pVIC40質(zhì)粒在美國(guó)專利5，705，371中有 詳述。大腸桿菌的rhtA基因存在于大腸桿菌染色體上的ISmin處，靠近編碼谷氨酰 胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的成分的glnHPQ操縱子。rhtA基因與0RFl(ybiF基因，核苷酸編號(hào)764至 1651，GenBank 登錄號(hào) AAA218541，gi =440181)相同，位于 pexB 與 ompX 基因之間。表 達(dá)由ORFl編碼的蛋白的單元稱為rhtA基因(rht:對(duì)高絲氨酸和蘇氨酸抗性)。此外， 已經(jīng)證明rhtA23突變是在相對(duì)于ATG起始密碼子的_1位置用G — A取代(ABSTRACTS of the 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology(第17界國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)大會(huì)暨美國(guó)生物化學(xué)與分子生 物學(xué)協(xié)會(huì)年會(huì)摘要)，San Francisco, California, 1997 年 8 月 24-29 日，摘要號(hào) 457，EP 1013765A)。大腸桿菌的asd基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號(hào)3572511至3571408，GenBank登錄 號(hào)NC_000913. l,gi :16131307)，并且可以根據(jù)該基因的堿基序列利用引物通過(guò)PCR來(lái)獲得 (參見(jiàn)White，T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))。其它微生物的asd基因可以通過(guò)類 似方式獲得。此外，大腸桿菌的aspC基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號(hào)983742至984932，GenBank登 錄號(hào)NC_000913. 1，gi :16128895)，并且可以通過(guò)PCR獲得。其它微生物的aspC基因可以 通過(guò)類似方式獲得。L-色氨酸生產(chǎn)菌L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例包括、但不限于 下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如可以使用由突變的trpS基因編碼的色氨酰-tRNA合成 酶缺陷的大腸桿菌 JP4735/pMU3028(DSM10122)和 JP6015/pMU91 (DSM10123)(美國(guó)專利
175，756，345)；具有編碼不受絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼 不受色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因的 大腸桿菌SV164(pGH5)(美國(guó)專利6，180，373)；色氨酸酶缺陷的大腸桿菌AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美國(guó)專利 4，371，614)；產(chǎn)生磷 酸烯醇丙酮酸的能力增強(qiáng)的大腸桿菌AGXl7/pGX50，pACKG4-pps (W09708333，美國(guó)專利 6,319,696)等等。此外，還可以使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白活性增加的產(chǎn)生 L-色氨酸的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌(美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0148473A1和2003/0157667A1)。L-色氨酸生產(chǎn)菌和用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還可以列舉出下述 菌株，該菌株的選自鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)、3-脫氧-D-阿 拉伯庚酮醛酸-7-磷酸合酶(3- r才# * -D- 7，7 7 口 >酸-7-〗J >酸* >夕一 七)(aroG)、3_脫氫奎寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇 丙酮酉先莽草酸 3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase) (aroA)、分 支酸合酶(aroC)、預(yù)苯酸脫水酶、分支酸變位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1種或2種以 上的酶的活性被增強(qiáng)。預(yù)苯酸脫水酶以及分支酸變位酶作為雙功能酶(CM-PD)，由pheA基 因編碼。在這些酶中，特別優(yōu)選磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸 合酶、3-脫氫奎寧酸合酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、預(yù) 苯酸脫水酶、分支酸變位酶_預(yù)苯酸脫氫酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者 均受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此也可以向這些酶中導(dǎo)入使反饋抑制解除的突 變。具有此類突變的菌株的具體實(shí)例包括具有脫敏型鄰氨基苯甲酸合酶的大腸桿菌SV164 和通過(guò)將質(zhì)粒PGH5 (W0 94/08031)轉(zhuǎn)入大腸桿菌SV164獲得的菌株，所述質(zhì)粒pGH5包含突 變的serA基因，該突變的serA基因編碼反饋抑制被解除了的磷酸甘油酸脫氫酶。L-色氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還可以列舉出， 導(dǎo)入了包含編碼抑制解除型鄰氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操縱子的菌株(特開(kāi)昭 57-71397號(hào)，特開(kāi)昭62-244382號(hào)，美國(guó)專利4，371，614)。此外，可以也通過(guò)增強(qiáng)色氨酸操 縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達(dá)來(lái)賦予L-色氨酸生產(chǎn)能力。色氨酸合酶由 α和β亞基組成，這兩種亞基分別由trpA和trpB基因編碼。另外，還可以通過(guò)增強(qiáng)異檸 檬酸裂解酶_蘋(píng)果酸合酶操縱子的表達(dá)來(lái)改進(jìn)L-色氨酸生產(chǎn)能力(W02005/103275)。L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例，可以列 舉出，但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻 遏物缺損的大腸桿菌 AJ12739(tyrA: :Tnl0，tyrR) (VKPM B-8197) (W003/044191)，攜帶了 編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶_預(yù)苯酸脫水酶的突變型pheA34基因的大腸桿菌 HW1089(ATCC55371)(美國(guó)專利第 5，354，672 號(hào))，大腸桿菌MWEC101_b (KR8903681)、大腸桿 菌 NRRL B-1214UNRRL B_12145、NRRL B-12146 以及 NRRLB-12147 (美國(guó)專利第 4，407，952 號(hào))等。此外，也可以使用攜帶有編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基 因的大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERMBP-12662)以及 命名為 AJ 12604 的大腸桿菌 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB] (FERM BP-3579)作 為親本株(EP 488424B1)。此外，還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)的屬于埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌(美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0148473A1以及 2003/0157667AUW003/044192)。L-纈氨酸生產(chǎn)菌L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-纈氨酸生產(chǎn)菌的親本株實(shí)例包括、但不限于經(jīng)修 飾從而過(guò)表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌株(美國(guó)專利5，998，178)。理想的是將ilvGMEDA操縱 子中對(duì)于衰減作用而言必要的區(qū)域移除，以使操縱子的表達(dá)不會(huì)被產(chǎn)生的L-纈氨酸所削 弱。此外，理想的是將操縱子中的ilvA基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-纈氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例還包括具有氨酰 t-RNA合成酶中的突變的突變株(美國(guó)專利5，658，766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970， 該菌株在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。已將大腸桿菌VL1970在 1988年6月24日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny Proezd.)，保藏號(hào)為 VKPM B-4411。此外，還可以使用生長(zhǎng)需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突變株(W096/06926、美國(guó) 專利第5，888，783號(hào))作為親本株。此外，作為屬于埃希氏菌屬的L-纈氨酸生產(chǎn)菌，還可以使用H-81(VKPMB_8066)、 NRRL B-12287 和NRRL B-12288 (美國(guó)專利 4，391，907)、VKPMB_4411 (美國(guó)專利 5，658，766)、 VKPM B-7707(歐洲專利申請(qǐng)1016710A2)等。H-81株于2001年1月30日保藏于俄羅斯國(guó) 立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (1 Dorozhny proezd. , 1 Moscow 117545，Russia)，保藏號(hào) VKPM B-8066，并于2002年2月1日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏。L-亮氨酸生產(chǎn)菌L-亮氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-亮氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出、 但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如對(duì)亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株 57 (VKPM B-7386，美國(guó)專利第6，124，121號(hào)))或?qū)Ζ?_2_噻吩基丙氨酸、3-羥基亮氨 酸、4-偶氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等亮氨酸類似物有抗性的大腸桿菌菌株(特公昭 62-34397號(hào)和特開(kāi)平8-70879號(hào))、通過(guò)W096/06926中描述的基因工程方法獲得的大腸桿 菌菌株、大腸桿菌Η-9068 (特開(kāi)平8-70879號(hào))等?？梢酝ㄟ^(guò)增加涉及L-亮氨酸生物合成的1種以上的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)本發(fā)明的 細(xì)菌。這些基因的實(shí)例可優(yōu)選列舉IeuABCD操縱子中的基因，所述操縱子中的基因以突變 的IeuA基因?yàn)榇恚摶蚓幋a對(duì)L-亮氨酸反饋抑制具有抗性的異丙基蘋(píng)果酸合酶(美 國(guó)專利6，403，342)。此外，可以通過(guò)增強(qiáng)編碼從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白的1種以上 的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)本發(fā)明的細(xì)菌。這類基因的實(shí)例包括b2682和b2683基因(ygaZH基 因)(EP1239041A2)。L-異亮氨酸生產(chǎn)菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實(shí)例可以列舉出、 但不限于對(duì)6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變株(特開(kāi)平5-304969號(hào))，對(duì)異亮氨酸類似 物如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧肟酸具有抗性的突變株，以及對(duì)DL-乙 硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變株(特開(kāi)平5-130882號(hào))。 此外，還可以使用以編碼蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合酶(acetohydroxate synthase)等涉及 L-異亮氨酸生物合成的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化的重組 株(特開(kāi)平2-458號(hào)，F(xiàn)R 0356739，和美國(guó)專利第5，998，178號(hào))作為親本株。L-絲氨酸生產(chǎn)菌作為L(zhǎng)-絲氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-絲氨酸的親本株的例子，可以列舉出攜帶 絲氨酸反饋抑制減弱的3-磷酸甘油酸脫氫酶的大腸桿菌(專利2584409號(hào)、美國(guó)專利第 5，618，716號(hào))。此外，還可以使用具有L-絲氨酸生產(chǎn)能力且磷酸絲氨酸磷氧化酶活性或 磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性中的至少一種增強(qiáng)的棒狀桿菌型細(xì)菌、L-絲氨酸分解能力缺失的 棒狀桿菌型細(xì)菌(特開(kāi)平11-253187號(hào)、美國(guó)專利第6，037，154號(hào))、以及偶氮絲氨酸或 β -(2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性的具有L-絲氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌型細(xì)菌(特開(kāi)平 11-266881號(hào)、美國(guó)專利第6，258，573號(hào))。當(dāng)通過(guò)基因重組來(lái)選育上述L-氨基酸生產(chǎn)菌時(shí)，所使用的基因不限于具有上述 基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不損害所編碼的蛋白質(zhì)的功能的前提下，也可 以使用這些基因的同源物、人工修飾體等具有保守突變的基因。即，還可以是編碼具有在公 知蛋白質(zhì)的氨基酸序列中在1個(gè)或數(shù)個(gè)位置上取代、缺失、插入或添加1個(gè)或者數(shù)個(gè)氨基酸 而得到的序列的蛋白質(zhì)的基因。關(guān)于“保守突變”，在后面關(guān)于丙酮酸合酶等的內(nèi)容中有描 述，其也適用于上述基因。<1-2>丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的增強(qiáng)本發(fā)明的微生物是對(duì)諸如上述的具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物進(jìn)行了修飾使 得其丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增強(qiáng)而得到的微生物。對(duì)于增強(qiáng)丙酮 酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的修飾而言，優(yōu)選進(jìn)行修飾使得與親本株例如野生 株、非修飾株相比，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性增強(qiáng)。而且，正如所述，當(dāng) 微生物本來(lái)不具有丙酮酸合酶活性時(shí)，通過(guò)修飾而具有了該酶活性的微生物，其丙酮酸合 酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性與非修飾株變得更強(qiáng)?？梢韵葘?duì)細(xì)菌進(jìn)行修飾使得其丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的酶活性 提高，然后再賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力。而且，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性 的增強(qiáng)可以采用如前文所述的增強(qiáng)基因表達(dá)的方法來(lái)進(jìn)行。即，可以通過(guò)以啟動(dòng)子修飾為 代表的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域修飾等來(lái)增強(qiáng)內(nèi)源性丙酮酸合酶基因或丙酮酸NADP+氧化還原酶基 因的表達(dá)，也可以通過(guò)在細(xì)菌中導(dǎo)入包含丙酮酸合酶基因或丙酮酸NADP+氧化還原酶基因 的質(zhì)?；蛲ㄟ^(guò)在細(xì)菌染色體上導(dǎo)入所述基因等來(lái)增強(qiáng)外源性丙酮酸合酶基因的表達(dá)。本發(fā)明中的“丙酮酸合酶”是指在電子供體存在下，例如在鐵氧還蛋白或者黃 素氧還蛋白存在下，可逆地催化由乙酰基-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反應(yīng)的酶(EC 1. 2. 7. 1)。丙酮酸合酶也可簡(jiǎn)稱為PS，或者有些情況下還被命名為丙酮酸氧化還原酶、丙酮 酸鐵氧還蛋白氧化還原酶、丙酮酸黃素氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸氧化還原酶。作為電 子供體，可以使用鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白。還原型鐵氧還蛋白+乙酰_CoA+C02 —氧化型鐵氧還蛋白+丙酮酸+CoA丙酮酸合酶的活性增強(qiáng)的確認(rèn)，可以通過(guò)從增強(qiáng)前微生物和增強(qiáng)后的微生物制備 粗酶液、并比較它們的丙酮酸合酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。丙酮酸合酶的活性可以按照例如Yoon等的 方法(Υοοη, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167 :275_279)來(lái)測(cè)定。例如，向包含作為 電子受體的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶液的反應(yīng)液中添加丙酮酸，采用光譜學(xué)方法測(cè)定因 丙酮酸的脫碳酸反應(yīng)而增加的還原型甲基紫精的量，這樣就可以測(cè)定丙酮酸合酶的活性。1個(gè)酶活性單位(U)表示為每1分鐘1 μ mol甲基紫精的還原量。當(dāng)親本株具有丙酮酸合 酶活性時(shí)，理想的是，與親本株相比較，酶活性上升優(yōu)選1. 5倍以上、更優(yōu)選2倍以上、更優(yōu) 選3倍以上。此外，當(dāng)親本株不具有丙酮酸合酶活性時(shí)，只要通過(guò)導(dǎo)入丙酮酸合酶基因生 成丙酮酸合酶即可，但理想的是，優(yōu)選酶活性被增強(qiáng)到可測(cè)定的程度，優(yōu)選0. 001U/mg (菌 體蛋白)以上、更優(yōu)選0.005U/mg以上、更優(yōu)選0.01U/mg以上。丙酮酸合酶對(duì)氧敏感，通常 來(lái)說(shuō)其活性表達(dá)和測(cè)定也往往較為困難(Buckel，W. and Golding，B. Τ. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60 27-49)。因此，在測(cè)定酶活性時(shí)，優(yōu)選如實(shí)施例中描述的那樣，降低反應(yīng)容器 中的氧濃度來(lái)進(jìn)行酶反應(yīng)。作為編碼丙酮酸合酶的基因，可以利用綠硫菌(Chlorobium t印idum)、嗜熱氫桿 菌(Hydrogenobacter thermophilus)等具有還原性TCA循環(huán)的細(xì)菌的丙酮酸合酶基因。 此外，也可以利用以大腸桿菌(Escherichia coli)代表的屬于腸桿菌科細(xì)菌群(腸內(nèi)細(xì)菌 群)的細(xì)菌來(lái)源的丙酮酸合酶基因。而且，作為編碼丙酮酸合酶的基因，還可以利用海藻甲 ；求胃(Methanococcusmaripaludis)、；氏甲;求胃(Methanocaldococcus jannaschii)、 高溫彎曲甲燒熱桿菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)等自養(yǎng)型產(chǎn)甲燒古細(xì) 菌(autotrophic methanogens)的丙酮酸合酶基因。具體地，作為綠硫菌(Chlorobium t印idum)的丙酮酸合酶基因，可以列舉出具 有位于綠硫菌基因組序列(GenBank登錄號(hào)NC_002932)的堿基序號(hào)1534432 1537989 的、SEQ ID NO :1所示的堿基序列的基因。SEQ ID NO :2中示出了該基因編碼的氨基 酸序列(GenBank登錄號(hào)AAC76906)。此外，已知嗜熱氫桿菌的丙酮酸合酶由δ亞基 (GenBank 登錄號(hào)ΒΑΑ95604)、α 亞基(GenBank 登錄號(hào) ΒΑΑ95605)、β 亞基(GenBank 登 錄號(hào):ΒΑΑ95606)、γ亞基(GenBank登錄號(hào):ΒΑΑ95607)這4個(gè)亞基的復(fù)合體形成(Ikeda， Τ. etal. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340 :76_82)。而且，還可以示例出由位于幽 門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)基因組序列(GenBank登錄號(hào)NC000915)的堿基序 號(hào)1170138 1173296的HP1108、HP1109、HP1110、HPllll這4個(gè)基因構(gòu)成的丙酮酸合 酶基因，由硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)基因組序列(GenBank登錄號(hào)NC 002754)的堿基序號(hào) 1047593 1044711 所示的 SS01208、SS07412、SS01207、SS01206 這 4 個(gè)基因編碼的丙酮酸合酶基因。而且，丙酮酸合酶基因還可以基于與上述示例的基因的同 源性，從綠硫菌屬(Chlorobium)、脫硫菌屬(Desulfobacter)、產(chǎn)液菌屬(Aquifex)、氫桿菌 屬(Hydrogenobacter)、熱變形菌屬(Thermoproteus)、熱棒菌屬(Pyrobaculum)細(xì)菌等中 克隆。在大腸桿菌中，ydbK基因(bl378)位于K_12株基因組序列(GenBank登錄號(hào) U00096)的堿基序號(hào)1435284 1438808，具有SEQ ID NO 3所示的堿基序列；從序列同源 性推測(cè)，其編碼丙酮酸黃素氧還蛋白氧化還原酶、即丙酮酸合酶。SEQ ID NO :4中示出了該 基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)AAC76906)。如實(shí)施例所示，證實(shí)了該基因產(chǎn)物具 有丙酮酸合酶活性，通過(guò)強(qiáng)化該基因的表達(dá)，能夠提高L-氨基酸生產(chǎn)能力。而且，丙酮酸合 酶基因還可以是與大腸桿菌丙酮酸合酶基因(ydbK)具有高同源性的、屬于埃希氏菌屬、沙 門(mén)氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、志賀氏菌屬 (Shigella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)等腸桿菌科細(xì)菌群的丙酮酸合酶基因。海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)的丙酮酸合酶由位于海沼甲
21燒球菌基因組序列(GenBank 登錄號(hào)NC_005791) (Hendrickson, Ε. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186 -.6956-6969)的堿基序號(hào) 1462535 1466397 的 porCDABEF 操縱子編碼 (Lin, W. C. et al. 2003. Arch. Microbiol. 179. 444-456)。已知該丙酮酸合酶包含 Y、α、 β和δ這4個(gè)亞基，除了所述亞基之外，PorE和PorF對(duì)丙酮酸合酶的活性而言也是重要 的(Lin，W. and Whitman, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181 :68_73)。γ 亞基由基因組序列 的堿基序號(hào)1465867 1466397 (互補(bǔ)鏈)的porA基因編碼，SEQ ID NO :56中示出了其堿 基序列，SEQ ID NO 57中示出了該基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)NP_988626)。 δ亞基由基因組序列的堿基序號(hào)1465595 1465852 (互補(bǔ)鏈)的porB基因編碼，SEQ ID NO :58中示出了其堿基序列，SEQ ID NO :59中示出了該基因編碼的氨基酸序列(GenBank 登錄號(hào)ΝΡ_988627)。α亞基由基因組序列的堿基序號(hào)1464410 1465573 (互補(bǔ)鏈)的 porC基因編碼，SEQ ID NO :60中示出了其堿基序列，SEQ ID NO :61中示出了該基因編碼的 氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)ΝΡ_988625)。β亞基由基因組序列的堿基序號(hào)1463497 1464393(互補(bǔ)鏈)的porD基因編碼，SEQ ID NO :62中示出了其堿基序列，SEQ ID NO 63 中示出了該基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)NP_988624)。PorE由基因組序列堿 基序號(hào)1462970 1463473 (互補(bǔ)鏈)的porE基因編碼，SEQ ID NO :64中示出了其堿基序 列，SEQ ID NO :65中示出了該基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)NP_988623)。PorF 由基因組序列堿基序號(hào)1462535 1462951 (互補(bǔ)鏈)的porF基因編碼，SEQ ID NO 66中 示出了其堿基序列，SEQ ID NO :67中示出了該基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào) NP_988622)。已知自養(yǎng)型的甲烷生成古細(xì)菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、 高溫彎曲甲烷熱桿菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)等也具有相同基因結(jié) 構(gòu)的丙酮酸合酶基因，可以加以利用。本發(fā)明中，“丙酮酸NADP+氧化還原酶”是指在電子供體存在下，例如在NADPH或 者NADH存在下，可逆地催化由乙酰-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反應(yīng)的酶(EC 1. 2. 1. 15)。 丙酮酸NADP+氧化還原酶有時(shí)簡(jiǎn)稱為ΡΝ0，有些情況下還被命名為丙酮酸脫氫酶。然而， 本發(fā)明中在提及“丙酮酸脫氫酶活性”時(shí)，是指如文后述的催化丙酮酸氧化脫碳酸生成乙 酰-CoA的反應(yīng)的活性，催化該反應(yīng)的丙酮酸脫氫酶(PDH)與丙酮酸NADP+氧化還原酶不 是同一種酶。丙酮酸NADP+氧化還原酶可以利用NADPH或者NADH作為電子供體。NADPH+ 乙酰 _CoA+C02 — NADP++ 丙酮酸 +CoA丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增強(qiáng)這一事實(shí)的確認(rèn)，可以通過(guò)從增強(qiáng)前的微生 物和增強(qiáng)后的微生物制備粗酶液、并比較它們的丙酮酸NADP+氧化還原酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。丙 酮酸NADP+氧化還原酶的活性可以按照例如Inui等的方法(Inui，H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262 =9130-9135)來(lái)測(cè)定。例如，向包含作為電子受體的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶 液的反應(yīng)液中添加丙酮酸，采用光譜學(xué)方法測(cè)定由于丙酮酸的脫碳酸反應(yīng)而增加的還原型 甲基紫精的量，這樣就可以測(cè)定丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。1個(gè)酶活性單位(U)表 示為每1分鐘1 μ mol甲基紫精的還原量。當(dāng)親本株具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性時(shí)， 理想的是，與親本株相比較，酶活性上升優(yōu)選1. 5倍以上、更優(yōu)選2倍以上、更優(yōu)選3倍以 上。此外，當(dāng)親本株不具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性時(shí)，只要通過(guò)導(dǎo)入丙酮酸NADP+ 氧化還原酶基因可生成丙酮酸NADP+氧化還原酶即可，但理想的是，優(yōu)選酶活性被強(qiáng)化到
22可測(cè)定的程度，優(yōu)選0. 001U/mg (菌體蛋白)以上、更優(yōu)選0. 005U/mg以上、更優(yōu)選0. 01U/mg 以上。丙酮酸NADP+氧化還原酶對(duì)氧敏感，因而其活性表達(dá)和測(cè)定通常來(lái)說(shuō)也存在許多困 難(Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262 :9130_9135 ；Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18 :710-720)。在由于失活等原因無(wú)法測(cè)定活性的情況下，可以像實(shí)施例所述那樣，通 過(guò)Western印跡等方法來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)的表達(dá)。編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因除了作為光合成真核微生物(也被分類為 原生動(dòng)物)的纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸NADP+氧化還原酶基因(Nakazawa， Μ. et al. 2000. FEBS Lett. 479 155-156)、原生生物小球隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium parvum)的丙酮酸NADP+氧化還原酶基因(Rotte，C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18 710-720)之外，已知在硅藻假微型海鏈藻(Tharassiosira pseudonana)中也存在同源基 因(Ctrnacta，V.et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53 :225_231)。具體地，作為纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸NADP+氧化還原酶基因，可 以示例出具有SEQ ID NO :5所示的堿基序列的基因(GenBank登錄號(hào)AB021127)。SEQ ID NO 6中示出了該基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)BAB12024)。本發(fā)明的微生物還可以是經(jīng)過(guò)了如下的修飾而使得丙酮酸合酶的活性增強(qiáng)的微 生物，所述修飾使得與親本株例如野生株或非修飾株相比，將電子供體從氧化型再生為還 原型的活性(該活性對(duì)于丙酮酸合酶的活性而言是必需的)增強(qiáng)。將氧化型電子供體再生 為還原型的活性包括例如鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性。此外，還可以是經(jīng)過(guò)了如下的修 飾而使得丙酮酸合酶的活性增強(qiáng)的微生物，所述修飾除了增強(qiáng)電子供體的再生活性之外還 增加丙酮酸合酶基因的表達(dá)。而且，上述親本株可以是天然內(nèi)在地具有編碼電子供體的再 生活性的基因的微生物，也可以是并非天然具有電子供體的再生活性，但通過(guò)導(dǎo)入編碼該 活性的基因而被賦予了該活性，從而L-谷氨酸生產(chǎn)能力變得更高的微生物?！拌F氧還蛋白-NADP+還原酶”是指可逆地催化以下反應(yīng)的酶(EC1. 18. 1. 2)。還原型鐵氧還蛋白+NADP+-—氧化型鐵氧還蛋白+NADPH+H+本反應(yīng)是可逆反應(yīng)，能夠在NADPH和氧化型鐵氧還蛋白的存在下生產(chǎn)還原型鐵 氧還蛋白。鐵氧還蛋白可以替換成黃素氧還蛋白，命名為黃素氧還蛋白-NADP+還原酶 的酶也具有同等功能。已經(jīng)確認(rèn)鐵氧還蛋白-NADP+還原酶在從微生物到高等生物中普 遍存在(參照 Carrillo, N.和 Ceccarelli, Ε. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270 :1900_1915 ； Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698 :155_165)，其也被命名為鐵氧 還蛋白-NADP+氧化還原酶、NADPH-鐵氧還蛋白氧化還原酶。鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性已增強(qiáng)這一事實(shí)的確認(rèn)，可以通過(guò)從修飾前的微 生物和修飾后的微生物制備粗酶液，并比較它們的鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。 鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性可以按照例如Blaschkowski等的方法(Blaschkowski， H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123 :563-569)來(lái)測(cè)定。例如，可以通過(guò)以鐵氧還蛋白作 為底物、采用光譜學(xué)方法測(cè)定減少的NADPH的量來(lái)測(cè)定。1個(gè)酶活性單位(U)表示為每1分 鐘1 μ moINADPH的氧化量。當(dāng)親本株具有鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性時(shí)，如親本株的活 性充分高，則沒(méi)有增強(qiáng)的必要，但理想的是，與親本株相比較，酶活性上升優(yōu)選1. 5倍以上、 更優(yōu)選2倍以上、更優(yōu)選3倍以上。已經(jīng)在許多生物物種中發(fā)現(xiàn)了編碼鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的基因，這些基因只要在目的L-氨基酸生產(chǎn)株中有活性即可加以使用。在大腸桿菌中，作為黃素氧還蛋 白-NADP+還原酶，已經(jīng)鑒定出的有 fpr 基因(Bianchi，V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175 1590-1595)。此外，已知在惡臭假單胞菌(Psuedomonas putida)中NADPH-假單胞氧還蛋 白還原酶(Putidaredoxinreductase)基因和假單胞氧還蛋白(Putidaredoxin)基因以操 縱子的形式存在(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106 :831_836)。大腸桿菌的黃素氧還蛋白-NADP+還原酶包括，例如，位于大腸桿菌K-12株基因組 序列(Genbank登錄號(hào).U00096)的堿基序號(hào)4111749 4112495 (互補(bǔ)鏈)的、具有SEQ ID NO 7所示的堿基序列的fpr基因。SEQ ID NO :8中示出了 Fpr的氨基酸序列(Genbank登錄 號(hào).AAC76906)。此外，在谷氨酸棒桿菌基因組序列(Genbank登錄號(hào).BA00036)的堿基序號(hào) 2526234 2527211中發(fā)現(xiàn)了鐵氧還蛋白-NADP+還原酶基因(Genbank登錄號(hào).BAB99777)。對(duì)丙酮酸合酶的活性而言，存在鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白作為電子供體是必要 的。因此，也可以是經(jīng)過(guò)修飾使得鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產(chǎn)能力提高，從而丙酮酸 合酶的活性增強(qiáng)的微生物。此外，除了進(jìn)行修飾以增強(qiáng)丙酮酸合酶的活性或者增強(qiáng)黃素氧還蛋白-NADP+還原 酶和丙酮酸合酶的活性之外，還可以進(jìn)行修飾來(lái)提高鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產(chǎn)能 力。本發(fā)明中，“鐵氧還蛋白”是指含有非卟啉鐵原子(Fe)和硫原子，并結(jié)合有稱作 4Fe-4S、3Fe-4S、或者2Fe-2S簇的鐵-硫簇的蛋白質(zhì)，其作為單電子傳遞體發(fā)揮功能。“黃 素氧還蛋白”是指包含F(xiàn)MMFlavin-mononucleotide，黃素單核苷酸)作為輔基的、發(fā)揮單 電子或者雙電子傳遞體功能的蛋白質(zhì)。關(guān)于鐵氧還蛋白和黃素氧還蛋白，在McLean等的文 獻(xiàn)中有記載(McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33 :796_801)。而且，用于修飾的親本株可以是天然內(nèi)在地具有編碼鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白 的基因的菌株，也可以是天然不具有鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白基因、但通過(guò)導(dǎo)入鐵氧還 蛋白或黃素氧還蛋白基因而被賦予了活性，從而L-谷氨酸生產(chǎn)能力提高的菌株。鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產(chǎn)能力與親本株(例如野生株或非修飾株)相比 有所提高的事實(shí)，可以通過(guò)將鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的mRNA的量與野生型或者非修 飾株比較來(lái)加以確認(rèn)。作為表達(dá)量的確認(rèn)方法，可以列舉Nothern雜交、RT-PCR(Sambrook， J. et al.1989. Molecular Cloning ALaboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork)。關(guān)于表達(dá)量，只要是與野生株或者非修飾株相比較 有所上升即可，理想的是，例如與野生株、非修飾株相比，上升1.5倍以上、更優(yōu)選2倍以上、 更優(yōu)選3倍以上。此外，鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產(chǎn)能力與親本株(例如野生株或非修 飾株)相比有所提高的這一事實(shí)的確認(rèn)，可以通過(guò)SDS-PAGE、二維電泳或者使用抗體的 Western Ep^jft^illJ (Sambrook, J. et al. 1989. MolecularCloning A Laboratory Manual/ Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)。關(guān)于生產(chǎn)量，只要與 野生株或者非修飾株相比較有所提高可以是任何量，理想的是，例如與野生株、非修飾株相 比上升1. 5倍以上、更優(yōu)選2倍以上、更優(yōu)選3倍以上。鐵氧還蛋白以及黃素氧還蛋白的活性可以通過(guò)將其添加至適當(dāng)?shù)难趸€原反應(yīng) 體系中來(lái)測(cè)定。例如，Boyer等公開(kāi)了下述方法通過(guò)鐵氧還蛋白-NADP+還原酶還原產(chǎn)生的鐵氧還蛋白，對(duì)由生成的還原型鐵氧還蛋白引起的細(xì)胞色素C的還原進(jìn)行定量(Boyer， Μ. Ε. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94 :128_138)。此外，黃素氧還蛋白的活性可以通過(guò) 使用黃素氧還蛋白-NADP+還原酶以相同的方法測(cè)定。編碼鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的基因分布廣泛，任何基因，只要其編碼出的鐵 氧還蛋白或黃素氧還蛋白能夠被丙酮酸合酶和電子供體再生系統(tǒng)所利用，都可以加以使 用。例如，在大腸桿菌中，作為編碼具有2Fe_2S簇的鐵氧還蛋白的基因，有fdx基因(Ta， D.T.和 Vickery，L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267 11120-11125)，而 yfhL 基因被預(yù)想是編 碼具有4Fe-4S簇的鐵氧還蛋白的基因。此外，作為黃素氧還蛋白基因，已知有fldA基 因(Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173 :1729_1737)和 fldB 基因(Gaudu, P.和 Weiss,B. 2000. J. Bacteriol. 182 1788-1793)。在谷氨酸棒桿菌的基因組序列(Genbank 登 錄號(hào).BA00036)中，在堿基序號(hào)562643 562963位發(fā)現(xiàn)了鐵氧還蛋白基因fdx(Genbank 登錄號(hào).BAB97942)，而且在堿基序號(hào)1148953 1149270位發(fā)現(xiàn)了 fer (Genbank登錄 號(hào).BAB98495)。此外，在綠硫菌中，存在許多鐵氧還蛋白基因，其中，鐵氧還蛋白I以及鐵氧 還蛋白II被鑒定為作為丙酮酸合酶的電子受體的4Fe-4S型鐵氧還蛋白基因(Υοοη,Κ. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276 :44027_44036)。還可以使用嗜熱氫桿菌的鐵氧還蛋白基因等來(lái) 源于具有還原型TCA循環(huán)的細(xì)菌的鐵氧還蛋白基因或黃素氧還蛋白基因。具體地，大腸桿菌的鐵氧還蛋白基因包括例如位于大腸桿菌K-12株基因組序列 (Genbank登錄號(hào)· U00096)的堿基序號(hào)2654770 2655105位(互補(bǔ)鏈)的SEQ ID NO 9 所示的fdx基因、以及位于堿基序號(hào)2697685 2697945位的SEQ ID NO 11所示的yfhL 基因。SEQ ID NO 10以及SEQ ID NO 12中示出了 Fdx以及YfhL的氨基酸序列(分別為 Genbank登錄號(hào).AAC75578以及AAC75615)。作為大腸桿菌的黃素氧還蛋白基因，包括例如 位于大腸桿菌K-12株基因組序列(Genbank登錄號(hào).U00096)的堿基序號(hào)710688 710158 位(互補(bǔ)鏈)的SEQ ID NO :13所示的fldA基因、以及位于堿基序號(hào)3037877 3038398位 的 SEQ ID NO 15 所示的 fldB 基因。SEQ IDNO 14 以及 SEQ ID NO 16 中示出了 fldA 基因 以及fldB基因所編碼的氨基酸序列(分別為Genbank登錄號(hào).AAC73778以及AAC75933)。作為綠硫菌的鐵氧還蛋白基因，包括例如位于綠硫菌基因組序列(Genbank登錄 號(hào).NC_002932)的堿基序號(hào)1184078 1184266位的SEQ IDNO 17所示的鐵氧還蛋白I基 因、以及位于堿基序號(hào)1184476 1184664位的SEQ ID NO :19所示的鐵氧還蛋白II基因。 SEQ ID NO 18以及SEQ IDNO 20中示出了鐵氧還蛋白I以及鐵氧還蛋白II所編碼的氨基 酸序列(分別為Genbank登錄號(hào).AAM72491以及AAM72490)。此外，還可列舉嗜熱氫桿菌 的鐵氧還蛋白基因(Genbank登錄號(hào).BAE02673)、硫磺礦硫化葉菌基因組序列中的堿基序 號(hào)2345414 2345728位所示的硫磺礦硫化葉菌的鐵氧還蛋白基因。而且，還可以是基于 與上述示例的基因的同源性，從綠菌屬、脫硫菌屬(Desulfobacter)、產(chǎn)液菌屬(Aquifex)、 氫桿菌屬、熱變形菌屬(Thermoproteus)、熱棒菌屬(Pyrobuculum)細(xì)菌等克隆的基因， 而且還可以是從腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森菌屬等Y-變 形細(xì)菌，谷氨酸棒桿菌、乳發(fā)酵短桿菌等棒狀桿菌型細(xì)菌；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等假單胞菌屬細(xì)菌；以及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)等分 枝桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌等中克隆的基因。這些編碼丙酮酸合酶、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、鐵氧還蛋白、黃素氧還蛋白的基因(以下統(tǒng)稱為本發(fā)明的基因)還可以使用具有保守突變的基因，如所述基因的同源物或 人工變體等，以不損害編碼的蛋白質(zhì)的活性即功能為限。也就是說(shuō)，可以是編碼具有在公知 的蛋白質(zhì)的氨基酸序列或野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的1個(gè)或者數(shù)個(gè)位置上發(fā)生1個(gè)或 者數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列的保守變體的基因。這里所 說(shuō)的1個(gè)或者數(shù)個(gè)，因氨基酸殘基在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中的位置、氨基酸的種類而異，優(yōu)選是 1 20個(gè)、更優(yōu)選1 10個(gè)、特別優(yōu)選1 5個(gè)。上述突變優(yōu)選是保守取代，其是功能上無(wú)變化的中性突變。關(guān)于保守取代，當(dāng)取代 位點(diǎn)是芳香族氨基酸時(shí)為Phe、Trp和Tyr之間的相互取代的突變；當(dāng)取代位點(diǎn)是疏水氨基 酸時(shí)為L(zhǎng)eu、Ile和Val之間的相互取代的突變；當(dāng)取代位點(diǎn)是極性氨基酸時(shí)為Gln和Asn 之間的相互取代的突變；當(dāng)取代位點(diǎn)是堿性氨基酸時(shí)為L(zhǎng)ys、Arg和His之間的相互取代的 突變；當(dāng)取代位點(diǎn)是酸性氨基酸時(shí)為Asp和Glu之間的相互取代的突變；當(dāng)取代位點(diǎn)是具 有羥基的氨基酸時(shí)為Ser和Thr之間的相互取代的突變。更具體地，可以列舉用Ser或Thr取代Ala ；用Gln、His或Lys取代Arg ；用Glu、 Gin,Lys,His 或 Asp 取代 Asn ；用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp ；用 Ser 或 Ala 取代 Cys ；用 Asn、 Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln ；用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu ；用 Pro 取代 Gly ； 用 Asn、Lys, Gin、Arg 或 Tyr 取代 His ；用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 Ile ；用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu ；用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys ；用 lie、Leu、Val 或 Phe 取代 Met ； 用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取代 Phe ；用 Thr 或 Ala 取代 Ser ；用 Ser 或 Ala 取代 Thr ；用 Phe或Tyr取代Trp ；用His、Phe或Trp取代Tyr ；和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，這 樣的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于攜帶本發(fā)明的基因的微生物的 個(gè)體差異、種間差異等情形而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺 失、插入、添加或倒位。此外，還可以替換成在本發(fā)明的基因所導(dǎo)入的各個(gè)宿主中易于使用的密碼子。同 樣地，本發(fā)明的基因只要具有功能即可，所編碼的蛋白質(zhì)的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)可以被 延長(zhǎng)或截短。例如，延長(zhǎng)的長(zhǎng)度是50個(gè)以下、優(yōu)選20個(gè)以下、更優(yōu)選10個(gè)以下、特別優(yōu)選 5個(gè)以下的氨基酸殘基。編碼如上所述的保守變體的基因，例如可以通過(guò)定點(diǎn)突變方法對(duì)堿基序列進(jìn)行修 飾，使得被編碼的蛋白的特定位點(diǎn)上的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或添加，來(lái)獲得這 樣的基因。此外，還可以通過(guò)傳統(tǒng)公知的突變處理來(lái)獲得。突變處理包括例如用羥胺等對(duì) 本發(fā)明的基因進(jìn)行體外處理的方法，以及對(duì)攜帶該基因的微生物(例如埃希氏菌屬細(xì)菌) 采用紫外線照射或使用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等在常 規(guī)突變處理中使用的突變劑來(lái)進(jìn)行處理的方法。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插 入、增加或倒位等還包括因基于攜帶本發(fā)明的基因的微生物的個(gè)體差異、種間差異等情形 而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。至于 這些基因是否編碼有功能的丙酮酸合酶、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、鐵氧還蛋白或黃素氧 還蛋白，可以通過(guò)例如將這些基因?qū)刖哂蠰-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物，并測(cè)定各基因產(chǎn) 物的活性來(lái)予以確認(rèn)。本發(fā)明的基因可以是能夠與具有上述堿基序列的DNA或可由與具有所述堿基序 列的DNA制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼丙酮酸合酶、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、
26鐵氧還蛋白、或黃素氧還蛋白的DNA。這里，“嚴(yán)格條件”是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件。 將該條件明確地?cái)?shù)值化是困難的，舉一實(shí)例具有高同源性的DNA(例如具有70%以上，優(yōu) 選80%以上，更優(yōu)選90%以上，特別優(yōu)選95%以上同源性的DNA)目互雜交，而同源性較 之為低的DNA則不互相雜交的條件；或者在與常規(guī)Southern雜交的洗滌條件即60°C， 1XSSC、0. 1% SDS，優(yōu)選 0. 1XSSC、0. 1% SDS，更優(yōu)選 68°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS 相當(dāng)?shù)柠} 濃度、溫度下洗滌1次，優(yōu)選2 3次的條件。而且，在本說(shuō)明書(shū)中，“同源性”(homology) 有時(shí)是指“同一性”(identity)。探針也可以具有本發(fā)明的基因的一部分序列。這樣的探針可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的方法，以基于各基因的堿基序列制備的寡核苷酸為引物，以包含各基因的DNA片 段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)加以制備。而且，當(dāng)使用300bp左右長(zhǎng)度的DNA片段作為探針時(shí)， 作為在上述條件下雜交后的洗滌條件，例如可以是50°C、2XSSC、0. 1% SDS。上述關(guān)于保守變體的描述同樣適用于所述的L-氨基酸生產(chǎn)能力的賦予中描述的 酶和基因。如上文所述的用于增強(qiáng)本發(fā)明基因之表達(dá)的修飾，可以依照賦予L-氨基酸生產(chǎn) 能力的相關(guān)記載中描述的增強(qiáng)目的基因表達(dá)的方法來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的基因可以利用攜帶該 基因的微生物的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR法獲得。例如，綠硫菌的丙酮酸合酶基因可以使用基于SEQ ID N0:1的堿基序列制 備的引物，例如SEQ ID NO :35、36所示的引物，以綠硫菌的基因組DNA為模板，通過(guò) PCR(polymerase chain reaction) Tj ^ U ( # # White, Τ. J. et al. 1989. Trends Genet. 5 :185—189)。大腸桿菌的丙酮酸合酶基因可以使用基于SEQ ID N0. 3的堿基序列制備的引物， 使用例如SEQ ID NO :38、39所示的引物，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR來(lái)獲得。纖細(xì)裸藻的丙酮酸=NADP+氧化還原酶基因可以使用基于SEQ ID NO 5制備的引 物，例如如SEQ ID NO :40、41所示的引物，以纖細(xì)裸藻的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR法來(lái)獲得。大腸桿菌的黃素氧還蛋白-NADP+還原酶基因可以使用基于SEQ IDNO 7的堿基序 列制備的引物，例如SEQ ID NO :42、43所示的引物，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過(guò) PCR法獲得。大腸桿菌的鐵氧還蛋白基因fdx可以使用基于SEQ ID NO :9的堿基序列制備的引 物，例如SEQ ID NO :44、45所示的引物，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR法獲得。大腸桿菌的黃素氧還蛋白基因fidA和黃素氧還蛋白基因fldB可以分別使用基于 SEQ ID N0:13的堿基序列和基于SEQ ID NO 15的堿基序列制備的引物，以大腸桿菌的基 因組DNA為模板，通過(guò)PCR法獲得。此外，綠硫菌的鐵氧還蛋白I基因和鐵氧還蛋白II基因可以分別使用基于SEQ ID NO 17和基于SEQ ID NO 19的堿基序列制備的引物，以綠硫菌的基因組DNA為模板，通過(guò) PCR法獲得。對(duì)來(lái)源其它微生物的本發(fā)明的基因，也可以以基于上述各基因的序列信息或該微
27生物的公知基因或蛋白質(zhì)序列信息制備的寡核苷酸為引物，通過(guò)PCR法，或者，以基于所述 序列信息制備的寡核苷酸為探針，通過(guò)雜交法，從該微生物的基因組DNA或基因組DNA文庫(kù) 獲得。而且，基因組DNA可以從作為DNA供體的微生物采用例如Saito和Miura的方法(參 M Saito, H.和 MiuraX I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72,619-629 ；生物工學(xué)実験書(shū)，日 本生物工學(xué)會(huì)編，97 98頁(yè)，培風(fēng)館，1992年)等來(lái)制備。本發(fā)明基因以及L-氨基酸生物合成系統(tǒng)基因的表達(dá)的增強(qiáng)，可以通過(guò)采用如上 述的方法，利用轉(zhuǎn)化或同源重組來(lái)提高本發(fā)明基因的拷貝數(shù)，或者修飾本發(fā)明基因的表 達(dá)調(diào)節(jié)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，本發(fā)明基因的表達(dá)增強(qiáng)，可以通過(guò)擴(kuò)增能夠提高本發(fā)明基因 的表達(dá)的激活子(activator)、和/或缺失或弱化能夠降低本發(fā)明基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)子 (regulator)來(lái)實(shí)現(xiàn)。以下，對(duì)增強(qiáng)基因表達(dá)的方法進(jìn)行說(shuō)明。第一種方法是提高目的基因的拷貝數(shù)的方法。例如，可以通過(guò)將目的基因克隆在 適當(dāng)?shù)妮d體上，并用所得載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌，提高該基因的拷貝數(shù)。作為用于轉(zhuǎn)化的載體，可以列舉能夠在使用的微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒。例如， 作為能夠在屬于腸桿菌科類細(xì)菌的微生物中自主復(fù)制的質(zhì)粒，可以列舉pUC19、pUC18、 pBR322、RSFlO 10、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29 (pHSG、pSTV 可從 TAKARA Bio 公司獲得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可從NIPPON GENE 公司獲得) 等。此外，作為棒狀桿菌型細(xì)菌用的質(zhì)粒，可以列舉PAM330 (特開(kāi)昭58-67699號(hào)公報(bào))、 PHM1519 (特開(kāi)昭58-77895號(hào)公報(bào))>pSFK6 (參照特開(kāi)2000-262288號(hào)公報(bào))、pVK7 (美國(guó)專 利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū) 2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開(kāi)昭 58-192900 號(hào)公報(bào))、 pCGl (特開(kāi)昭57-134500號(hào)公報(bào))、pCG2 (特開(kāi)昭58-35197號(hào)公報(bào))、pCG4、pCGll (特開(kāi)昭 57-183799號(hào)公報(bào))、pHK4(特開(kāi)平5-7491號(hào)公報(bào))等。此外，從這些載體中取出具有使質(zhì) 粒得以在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制的能力的DNA片段，并將其插入到所述大腸桿菌用載 體中，可以作為能夠在大腸桿菌以及棒狀桿菌型細(xì)菌這兩者中自主復(fù)制的所謂穿梭載體來(lái) 使用。而且，還可以使用噬菌體DNA代替質(zhì)粒作為載體。作為轉(zhuǎn)化方法，可以列舉例如用氯化鈣處理受體菌細(xì)胞來(lái)增加DNA的透過(guò)性的 方法，如已被報(bào)道用于大腸桿菌K-12的方法(Mandel，Μ·和Higa，A. J. Mol. Biol. 1970.53 159-162)，或者從處于增殖階段的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞并導(dǎo)入DNA的方法，如已被報(bào)道用 于枯草芽孢桿菌的方法(Duncan，C. H. et al. 1997. Gene 1:153-167)?；蛘?，還可以應(yīng)用將 DNA受體菌的細(xì)胞制備成容易導(dǎo)入重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的狀態(tài)，再將重組DNA 導(dǎo)入DNA受體菌的方法，該方法已知用于枯草桿菌、放線菌類和酵母(Chang，S. and Choen, S. N.，1979. Mol. Gen. Genet. 168 :111_115 ；Bibb, Μ. J. et al. 1978. Nature 274 :398_400 ； Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933)。此外，采用電脈沖法 (特開(kāi)平2-207791號(hào)公報(bào))也能夠進(jìn)行微生物的轉(zhuǎn)化。提高基因的拷貝數(shù)還可以通過(guò)向微生物的基因組DNA上導(dǎo)入多個(gè)拷貝的目的基 因來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了將多個(gè)拷貝的目的基因?qū)氲轿⑸锏幕蚪MDNA上，可以利用基因組 DNA上以多拷貝存在的序列作為靶標(biāo)，通過(guò)同源重組來(lái)進(jìn)行(Millerl，J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, ColdSpring Harbor Laboratory) 作為基因組 DNA 上以多拷 貝存在的序列，可以利用重復(fù)DNA(repetitive DNA)、存在于轉(zhuǎn)座元件端部的反向重復(fù)序
28列。或者，還可以如特開(kāi)平2-109985號(hào)公報(bào)所公開(kāi)的那樣，將目的基因裝載在轉(zhuǎn)座子中，使 其發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而將多個(gè)基因拷貝導(dǎo)入基因組DNA中。另外，還可以通過(guò)使用Mu噬菌體的 方法(特開(kāi)平2-109985號(hào))將目的基因整合到宿主基因組上。目的基因轉(zhuǎn)移到了基因組 上的事實(shí)，可以通過(guò)以該基因的一部分為探針進(jìn)行Southren雜交來(lái)予以確認(rèn)。而且，當(dāng)提高基因拷貝數(shù)時(shí)，只要能夠增強(qiáng)目的基因的產(chǎn)物的活性即可，對(duì)于拷貝 數(shù)沒(méi)有特殊限制。在微生物本來(lái)就具有目的基因的情況下，優(yōu)選為2個(gè)以上；此外，在微生 物本來(lái)不具有本發(fā)明的基因時(shí)，導(dǎo)入的基因的拷貝數(shù)可以是1個(gè)，也可以是2個(gè)以上。第2種方法是在基因組DNA上或質(zhì)粒上、將目的基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列替 換為適當(dāng)強(qiáng)度的表達(dá)調(diào)節(jié)序列來(lái)增強(qiáng)目的基因的表達(dá)的方法。例如，thr啟動(dòng)子、Iac啟 動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、pL啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等是已知的常用啟動(dòng)子。作為棒狀 桿菌型細(xì)菌中的高表達(dá)型啟動(dòng)子，可以列舉延伸因子Tu(EF-Tu)基因tuf的啟動(dòng)子，編碼 共伴侶蛋白(cochaperonin)GroES-伴侶蛋白(chaperonin)GroEL,硫氧還蛋白還原酶、 磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等的基因的啟動(dòng)子(W02006/028063號(hào)公報(bào)、 EP1697525號(hào)公報(bào))。啟動(dòng)子強(qiáng)度的評(píng)價(jià)方法和強(qiáng)力啟動(dòng)子的例子記載于Goldstein和Doi 的論文(Goldstein,M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。此外，可以如國(guó)際公開(kāi)W000/18935所描述的那樣，通過(guò)在基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)?入數(shù)個(gè)堿基的堿基取代將其修飾成強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代例如可以像 使用溫度敏感型質(zhì)粒的基因取代那樣進(jìn)行。作為可以在大腸桿菌或Pantoea ananatis中 使用的、具有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的載體，可以列舉例如WO 99/03988號(hào)國(guó)際公開(kāi)小冊(cè)子 所述的溫度敏感型質(zhì)粒PMAN997或其衍生質(zhì)粒等。此外，表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代還可以通 過(guò)使用線性DNA的方法來(lái)進(jìn)行，如利用λ噬菌體的Red重組酶(Red recombinase)的稱 力 “Red 馬區(qū)云力·☆，， (Red-driven integration)白勺力夕去(Datsenko, K. A. andffanner, B. L.， 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 6640-6645)、以及將 Red 驅(qū)動(dòng)整合法與 λ 噬菌體來(lái)源 的切出系統(tǒng)(Cho, Ε. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184 =5200-5203)聯(lián)合使用的方法(參照 W02005/010175號(hào))等。而且，表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾可以與如上所述的提高基因的拷貝數(shù)的 方法聯(lián)合使用。而且，已知對(duì)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與起始密碼子之間的間隔序列中，特別是對(duì) 起始密碼子緊鄰上游的序列中的數(shù)個(gè)核苷酸的取代，對(duì)mRNA的翻譯效率有非常大的影響， 可以對(duì)所述序列進(jìn)行修飾來(lái)提高翻譯量。當(dāng)丙酮酸合酶由多個(gè)亞基構(gòu)成時(shí)，可以分別增強(qiáng)編碼各亞基的基因的表達(dá)，也可 以以多順?lè)醋拥男问酵瑫r(shí)增強(qiáng)這些基因的表達(dá)。此外，當(dāng)使用載體將基因?qū)胛⑸飼r(shí)，編 碼各亞基的基因可以同時(shí)擔(dān)載在單一載體分子上，也可以分別擔(dān)載在不同載體分子上。此 外，當(dāng)將基因插入基因組時(shí)，編碼各亞基的基因可以同時(shí)插入到基因組上的同一位點(diǎn)，也可 以分別插入到不同位置上。此外，本發(fā)明的微生物優(yōu)選除了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增 強(qiáng)之外，其蘋(píng)果酸酶活性也已降低。當(dāng)本發(fā)明的微生物是屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌 屬、克雷伯氏菌屬或沙雷氏菌屬的細(xì)菌時(shí)，特別優(yōu)選降低蘋(píng)果酸酶的活性。本發(fā)明中，蘋(píng)果酸酶的活性是指可逆地催化蘋(píng)果酸氧化脫碳酸生成丙酮酸的反應(yīng)的活性。上述反應(yīng)由以NADP為電子受體的NADP型蘋(píng)果酸酶(也記作蘋(píng)果酸脫氫酶 (malate dehydrogenase) ( ^-Wc^MM^'li. (oxaloacetate-decarboxylating)) (NADP+)) (EC :1. 1. 1. 40 b2463基因(也記作maeB基因)SEQ ID NO 54)、或者以NAD為電子受體的 NAD型蘋(píng)果酸酶(也記作蘋(píng)果酸脫氫酶(草酰乙酸脫羧性)(NAD+)) (EC :1· 1. 1. 38 sfcA基 因(也記作maeA基因)SEQ ID NO :52)這2種酶來(lái)催化。蘋(píng)果酸酶活性的確認(rèn)可以按照 Bologna 等的方法(Bologna, F. P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189 :5937_5946)來(lái)測(cè) 定。NADP依賴型蘋(píng)果酸酶NADP+(NADP-依賴性蘋(píng)果酸酶NADP+) +蘋(píng)果酸 (malate) — NADPH+C02+ 丙酮酸(pyruvate)NAD依賴型蘋(píng)果酸酶NAD+ (NAD-依賴性蘋(píng)果酸酶NAD+) +蘋(píng)果酸一NADH+C02+丙 酮酸酶活性的降低可以像后述的丙酮酸脫氫酶活性的降低那樣進(jìn)行。在本發(fā)明中，更優(yōu)選使NADP型蘋(píng)果酸酶與NAD型蘋(píng)果酸酶這兩者的活性均降低， 特別是，當(dāng)本發(fā)明的微生物是屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬或沙雷氏 菌屬的細(xì)菌時(shí)，優(yōu)選降低這兩種類型的蘋(píng)果酸酶的活性。此外，本發(fā)明的微生物優(yōu)選除了增強(qiáng)丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活 性之外，還降低丙酮酸脫氫酶活性。在本發(fā)明中，丙酮酸脫氫酶(以下也稱“PDH”)活性是指催化丙酮酸氧化脫 碳酸、生成乙酰-CoA(acetyl-CoA)的反應(yīng)的活性。上述反應(yīng)由PDH(Elp pyruvate dehydrogenase, EC :1· 2. 4. 1 aceE 基因 SEQ ID NO 46)、二氫硫辛?；阴＾D(zhuǎn)移酶(E2p dihydrolipoyltransacetylase,EC 2. 3. 1. 12 aceF 基因 SEQ ID NO 48)、二氫硫辛酰胺脫 氫酶(E3 :dihydrolipoamide dehydrogenase ；EC :1· 8. 1. 4 IpdA 基因 SEQ ID NO 50)這 3 種酶來(lái)催化。即，這3種亞單位分別催化以下反應(yīng)，而將催化這3個(gè)反應(yīng)合起來(lái)的反應(yīng)的 活性稱為PDH活性。PDH活性的確認(rèn)可以采用Visser和Strating的方法(Visser，J. and Strating, Μ. 1982. Methods Enzymo 1. 89 :391_399)來(lái)測(cè)定。Elp 丙酮酸+[ 二氫硫辛酰賴氨酸殘基琥珀酰轉(zhuǎn)移酶]硫辛酰賴氨酸一[二氫硫 辛酰賴氨酸殘基乙酰轉(zhuǎn)移酶]S-乙酰二氫硫辛酰賴氨酸+CO2E2p =CoA+酶N6_ (S-乙酰二氫硫辛酰)賴氨酸一乙酰-CoA+酶N6- ( 二氫硫辛酰) 賴氨酸E3 蛋白N6- ( 二氫硫辛酰)賴氨酸+NAD+ —蛋白N6-(硫辛酰)賴氨酸+NADH+H+酶活性的降低具體地可以通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)使染色體上的PDH編碼基因，具體 地說(shuō)是aceE、aceF和IpdA中的1個(gè)或2個(gè)以上基因的編碼區(qū)域的一部分或全部缺損，或 者對(duì)啟動(dòng)子、shine-dalgarno (SD)序列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾，等等。此外，對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié) 序列以外的非翻譯區(qū)的修飾也可以降低基因的表達(dá)量。而且，還可以缺失包括染色體上的 基因的前后的序列在內(nèi)的整個(gè)基因。此外，所述修飾還可以這樣完成通過(guò)基因重組向染 色體上的酶編碼區(qū)域中導(dǎo)入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、或者導(dǎo)入終止密碼子(無(wú)義突變)、 或者導(dǎo)入添加或缺失一 二個(gè)核苷酸的移碼突變(Wang，J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405_9410 ；Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594_602 ；Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272 :8611—8617 ；ffente, S. R. and Schachman, H. K. 1991.J. Biol. Chem. 266 :20833_20839)。在本發(fā)明中，優(yōu)選通過(guò)利用同源重組，使染色體上的基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng) 子區(qū)域、或編碼區(qū)域、或非編碼區(qū)域的一部分或全部缺損，或者在所述區(qū)域中插入其它序 列，來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)的酶活性。然而，只要是降低PDH活性的修飾即可，也可以是通過(guò)X射線 或紫外線照射、或者N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等突變劑進(jìn)行的常規(guī)突變處理引起的 修飾。就表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾而言，優(yōu)選為1個(gè)堿基以上，更優(yōu)選為2個(gè)堿基以上，特別 優(yōu)選為3個(gè)堿基以上。此外，在缺失編碼區(qū)域時(shí)，只要產(chǎn)生的酶蛋白質(zhì)的功能降低或缺失即 可，缺失的區(qū)域可以是N末端區(qū)域、內(nèi)部區(qū)域、C末端區(qū)域中的任何區(qū)域，也可以是整個(gè)編碼 區(qū)域。通常，缺失的區(qū)域越長(zhǎng)，越能夠切實(shí)地使基因失活。此外，優(yōu)選的是被缺失區(qū)域的上 游或下游的讀碼框不一致。在編碼區(qū)域中插入其他序列時(shí)，可以為基因的任何區(qū)域，但插入的序列越長(zhǎng)越能 夠切實(shí)地使編碼酶的基因失活。優(yōu)選的是插入部位前后的序列的讀碼框不一致。對(duì)于其他 序列沒(méi)有特殊限制，只要是能夠降低或缺損酶蛋白質(zhì)的功能即可，包括例如攜帶有抗生素 抗性基因或?qū)-氨基酸生產(chǎn)有用的基因的轉(zhuǎn)座子等。對(duì)染色體上的基因如上述地進(jìn)行修飾，可以通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)例如，制備缺失型 基因(其經(jīng)過(guò)了修飾使得基因的部分序列缺失、不產(chǎn)生正常功能的酶蛋白質(zhì))，用包含該基 因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過(guò)使缺失型基因與染色體上的基因發(fā)生同源重組，從而將染色體上 的基因替換成缺失型基因。缺失型基因所編碼的酶蛋白質(zhì)即使能夠產(chǎn)生，其與野生型酶蛋 白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)也不同，其功能降低或消失。這種基于利用同源重組進(jìn)行的基因取代的基 因破壞，還可以采用下述方法進(jìn)行前述的Red驅(qū)動(dòng)整合方法、組合使用Red驅(qū)動(dòng)整合法與 λ噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)的方法等使用線性DNA的方法，或者使用含溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn) 的質(zhì)粒、可接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，利用在宿主內(nèi)不含復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法(美國(guó) 專利第6303383號(hào)說(shuō)明書(shū)，或特開(kāi)平05-007491號(hào))等。上述關(guān)于降低PDH活性的描述同樣適用于前述的其它酶“活性的降低”、或其它基 因的“破壞”。此外，在厭氧或微需氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的場(chǎng)合，本發(fā)明的微生物還可以是經(jīng)過(guò) 修飾，使得除了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性被增強(qiáng)之外，不在厭氧或微 需氧的條件下產(chǎn)生有機(jī)酸或乙醇的微生物。這里，作為有機(jī)酸，可以列舉出乳酸、甲酸、乙 酸。作為進(jìn)行修飾使得不生產(chǎn)有機(jī)酸或乙醇的方法，包括例如破壞編碼乳酸脫氫酶的基因 的方法(Verumi，G. N. et al. 2002. J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 28 :325_332 ；特 開(kāi) 2005-95169)。此外，當(dāng)在包含脂肪酸作為碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，還可以提高本發(fā)明的微 生物的脂肪酸同化能力。提高脂肪酸同化能力的手段包括例如弱化或缺損fadR基因 的表達(dá)，增強(qiáng)涉及脂肪酸同化的fadL、fadE、fadD、fadB和/或fadA基因的表達(dá)，或增強(qiáng) 編碼細(xì)胞色素bo型氧化酶復(fù)合體(cytochrome bo terminal oxidase complex)的各亞 基的基因群(Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D. Neidhardt (ed.)， Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Societyfor Microbiology Press, Washington, D. C；Chepuri et al. 1990.J. Biol. Chem. 265 11185-11192)即 cyoABCDE 的表達(dá)等。"fadR基因”是編碼FadR的基因，所述FadR是在腸桿菌科細(xì)菌群中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)脂 肪酸代謝并具有DNA結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子(DiRusso，C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7 :311_322)，大腸桿菌的 fadR 基因可以示例出具有位于大腸桿菌的基因組序列(Genbank登錄號(hào)U00096)堿基序號(hào) 1234161 1234880的SEQ ID NO 82所示的堿基序列的基因。SEQ ID NO 83中示出了該 基因編碼的氨基酸序列。<2>本發(fā)明的L-氨基酸生產(chǎn)方法本發(fā)明的方法是以用培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，在培養(yǎng)基中或菌體內(nèi)生成并蓄 積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌體收集L-氨基酸為特征的L-氨基酸生產(chǎn)方法。這里，本發(fā)明的方法可以采用分批培養(yǎng)(batch culture)、流加培養(yǎng)(Fed-batch culture)、連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)中的任何方法，培養(yǎng)基中的乙醇或脂肪酸可 以包含在初始培養(yǎng)基中，也可以包含在流加培養(yǎng)基中，或者包含于這兩者中。這里，在本發(fā)明中，上述流加培養(yǎng)是指下述培養(yǎng)方法將培養(yǎng)基連續(xù)地或間歇地添 加至培養(yǎng)容器中，并且在培養(yǎng)完成之前不從容器中取出培養(yǎng)基。此外，連續(xù)培養(yǎng)指下述培養(yǎng) 方法連續(xù)地或間歇地將培養(yǎng)基流加至培養(yǎng)容器中，同時(shí)從容器中取出培養(yǎng)基(通常而言， 等于所流加的培養(yǎng)基的量)?！俺跏寂囵B(yǎng)基”的意思是在流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中，流加流加 培養(yǎng)基之前的分批培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基(培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的培養(yǎng)基)；“流加培養(yǎng)基”的意思是 在進(jìn)行流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，提供至發(fā)酵罐的培養(yǎng)基。此外，分批培養(yǎng)(batchculture) 是指每批制備一次新的培養(yǎng)基，將菌株接種到其中，并且直至收獲都不加入培養(yǎng)基。作為碳源，優(yōu)選是能夠產(chǎn)生乙酰CoA但不伴隨發(fā)生脫碳酸反應(yīng)的碳源，具體地可 以列舉出乙醇、脂肪酸、或者、通過(guò)分解可產(chǎn)生脂肪酸的脂肪酸酯包括油脂等。以下，就使 用乙醇或脂肪酸作為所述碳源的情況進(jìn)行示例說(shuō)明。乙醇是以分子式C2H5OH表示的一元醇，可以利用純乙醇，也可以直接利用含乙醇 的混合物，如乙醇發(fā)酵等中產(chǎn)生的培養(yǎng)液中的乙醇等。脂肪酸是以通式CmHnCOOH表示的一元羧酸。只要能夠被具有L-氨基酸生產(chǎn)能力 的細(xì)菌利用即可，可以是任何鏈長(zhǎng)的脂肪酸，也可以以任意比例含有任何鏈長(zhǎng)的脂肪酸。優(yōu) 選的脂肪酸是油酸(C17H33COOH)以及棕櫚酸(C15H31COOH),特別優(yōu)選油酸。關(guān)于油酸，可以 通過(guò)油脂的水解來(lái)獲得包含油酸的長(zhǎng)鏈脂肪酸混合物。用于本發(fā)明的油酸可以以棕櫚油等 油脂的水解物的形式獲得，可以使用從動(dòng)物油、植物油、廢食用油、其它混合油脂或巧克力 等包含脂肪成分的食品中提取的油酸。此外，脂肪酸可以以游離酸的形式利用，也可以以與 鈉、鉀等堿金屬的鹽或者銨鹽的形式加以利用。本發(fā)明的方法中使用的培養(yǎng)基中所含的乙醇或脂肪酸的量可以是任意的，只要本 發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌能夠作為碳源加以同化即可，當(dāng)作為單獨(dú)的碳源添加到培養(yǎng)基中 時(shí)，優(yōu)選包含20w/v %以下、優(yōu)選1 Ow/v %以下、更優(yōu)選2w/v %以下。此外，培養(yǎng)基中包含的 乙醇或脂肪酸可以是任意的，只要在其含量下能夠作為碳源被同化即可，當(dāng)作為單獨(dú)的碳 源添加到培養(yǎng)基中時(shí)，希望包含0. 001w/v%以上、優(yōu)選0. 05w/v%以上、更優(yōu)選0.以 上。此外，在作為流加培養(yǎng)基使用的情況下，當(dāng)作為單獨(dú)的碳源添加乙醇或脂肪酸時(shí)，
32培養(yǎng)基中優(yōu)選包含10w/v%以下、優(yōu)選5w/v%以下、更優(yōu)選以下，優(yōu)選包含0. OOlw/ 以上、優(yōu)選0. 05w/v%以上、更優(yōu)選0.以上。而且，乙醇的濃度可以采用各種方法來(lái)測(cè)定，酶法測(cè)定是簡(jiǎn)便且常規(guī)的(Swift， R. 2003. Addiction 98:73-80)。脂肪酸的濃度可以采用氣相色譜或HPLC等常規(guī)方法來(lái) 測(cè)定(Lehotay, S. J. and Hajslova, J. TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21 :686_697 ；Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808 :43_49)。而且，還可以將乙醇和脂肪酸混合后添加到本發(fā)明的培養(yǎng)基中。乙醇和脂肪酸的 添加濃度可以是任意的，只要本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌能夠作為碳源同化所述脂肪酸即 可，當(dāng)在培養(yǎng)基中僅添加乙醇和脂肪酸的混合物作為碳源時(shí)，優(yōu)選合計(jì)包含20w/v%以下、 優(yōu)選10w/v%以下、更優(yōu)選2w/v%以下。此外，培養(yǎng)基中的乙醇和脂肪酸的混合物的含量可 以是任意的，只要在其含量下本發(fā)明中使用的細(xì)菌能夠作為碳源加以同化即可。當(dāng)培養(yǎng)基 中僅添加乙醇和脂肪酸的混合作為碳源時(shí)，優(yōu)選與油酸合在一起包含0. 001w/v%以上、優(yōu) 選0. 05w/v%以上、更優(yōu)選0.以上。此外，乙醇與脂肪酸的混合比例可以是任意的，只要為本發(fā)明的方法中使用的細(xì) 菌能夠作為碳源同化的濃度即可，可以以相對(duì)于乙醇1脂肪酸為2以下、優(yōu)選1. 5以下、特 別優(yōu)選1以下左右的比例來(lái)進(jìn)行混合。作為下限，只要混合了脂肪酸即可，優(yōu)選相對(duì)于乙醇 1，混合0. 05以上、優(yōu)選0. 1以上的脂肪酸。而且，本發(fā)明的方法中使用的培養(yǎng)基中除了乙醇或脂肪酸或乙醇和脂肪酸這兩者 之外，還可以添加其它碳源。優(yōu)選的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、廢糖蜜、淀粉水解 物等糖類，甘油等多元醇類，富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。特別優(yōu)選葡萄糖、蔗糖、果 糖、甘油。作為甘油，也可以使用在生物柴油燃料生產(chǎn)中產(chǎn)生的粗甘油。碳源可以是1種， 也可以是2種以上的混合物。在使用其它碳源的情況下，碳源中的乙醇或脂肪酸、或乙醇和 脂肪酸的混合物的比例優(yōu)選為10重量％以上、優(yōu)選30重量％以上、更優(yōu)選50重量％以上。而且，在本發(fā)明中，可以在培養(yǎng)的所有步驟中均包含一定濃度的乙醇或者脂肪酸， 也可以僅在流加培養(yǎng)基或初始培養(yǎng)基中添加有乙醇或者脂肪酸，如果其它碳源充足，則也 可以存在乙醇或脂肪酸不足的一定時(shí)間。所謂“暫時(shí)性的”，意思是，例如，在發(fā)酵總時(shí)間的 10%、20%、最大至30%的時(shí)間內(nèi)脂肪酸處于不足的狀態(tài)。就培養(yǎng)基中添加的其它成分而言，可以使用除碳源外還含有氮源、無(wú)機(jī)離子和視 需要而定的其它有機(jī)成分的常規(guī)培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基中包含的氮源可以使用氨、硫酸 銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、醋酸銨、尿素等銨鹽或硝酸鹽等，PH調(diào)整中使用的氨氣、氨水也 可作為氮源利用。此外，還可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大 豆水解物等。培養(yǎng)基中也以只含這些氮源中的1種，也可以含有這些氮源中的2種以上。這 些氮源可以用于初始培養(yǎng)基，也可以用于流加培養(yǎng)基。此外，初始培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中可 以使用相同的氮源，也可以將流加培養(yǎng)基的氮源改變?yōu)榕c初始培養(yǎng)基不同。本發(fā)明的培養(yǎng)基中，除了碳源、氮源之外，優(yōu)選還包含磷酸源、硫源。作為磷酸源， 可以利用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作為硫源，只要包含硫原 子即可，優(yōu)選硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽等硫酸鹽，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫 氨基酸，這其中優(yōu)選硫酸銨。此外，培養(yǎng)基除碳源、氮源、硫源之外，還可以包含生長(zhǎng)促進(jìn)因子(具有生長(zhǎng)促進(jìn)效果的營(yíng)養(yǎng)素)。能夠使用的生長(zhǎng)促進(jìn)因子包括微量金屬、氨基酸、維生素、核酸以及含有所 述物質(zhì)的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解產(chǎn)物等。作為微量金屬，可以列 舉鐵、錳、鎂、鈣等；作為維生素，可以列舉維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙酰胺、維 生素B12等。這些生長(zhǎng)促進(jìn)因子可以包含在初始培養(yǎng)基中，也可以包含在流加培養(yǎng)基中。此外，在使用其生長(zhǎng)需求氨基酸等的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株時(shí)，優(yōu)選在培養(yǎng)基中添補(bǔ) 所需求的營(yíng)養(yǎng)素。特別是，可在本發(fā)明中使用的L-賴氨酸生產(chǎn)菌中大多如后述地強(qiáng)化了 L-賴氨酸生物合成途徑，而弱化了 L-賴氨酸分解能力，因此，優(yōu)選添加選自L-蘇氨酸、 L-高絲氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1種或2種以上。初始培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基的 培養(yǎng)基組成可以相同，也可以不同。此外，初始培養(yǎng)基與流加培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成可以相 同，也可以不同。而且，當(dāng)流加培養(yǎng)基的流加分多個(gè)階段進(jìn)行時(shí)，各流加培養(yǎng)基的組成可以 相同，也可以不同。培養(yǎng)優(yōu)選在發(fā)酵溫度20至45°C，特別優(yōu)選33至42°C的通氣條件下進(jìn)行。這里， 將氧濃度調(diào)節(jié)到5至50%，優(yōu)選至大約10%來(lái)進(jìn)行發(fā)酵。此外，優(yōu)選將pH控制在5至9進(jìn) 行通氣培養(yǎng)。如果在培養(yǎng)期間PH降低，可例如添加碳酸鈣或堿例如氨氣和氨水以中和培 養(yǎng)物。在這些條件下，進(jìn)行優(yōu)選大約10至120小時(shí)的培養(yǎng)，從而在培養(yǎng)液中蓄積顯著量的 L-氨基酸。蓄積的L-氨基酸的濃度只要是高于野生型菌株中的濃度并且在該濃度下能夠 將L-氨基酸從培養(yǎng)基收集和回收即可，可以是50g/L以上，理想的是75g/L以上，更理想的 是100g/L以上。當(dāng)目的氨基酸為堿性氨基酸時(shí)，可以采用通過(guò)下述方法進(jìn)行發(fā)酵、并回收目的堿 性氨基酸的方法來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)(參照特開(kāi)2002-065287號(hào))將培養(yǎng)中的pH控制在6. 5 9. 0、培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的培養(yǎng)基的pH控制在7. 2 9. 0、發(fā)酵中的發(fā)酵槽內(nèi)壓力控制為正的方法， 或者，向培養(yǎng)基供給二氧化碳或含二氧化碳的混合氣體，使得存在培養(yǎng)基中的碳酸氫根離 子和/或碳酸根離子為至少2g/L以上的培養(yǎng)期，并以所述碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 作為以堿性氨基酸為主的陽(yáng)離子的抗衡離子的方法。就培養(yǎng)結(jié)束后從培養(yǎng)液中收集L-氨基酸的方法而言，可以按照公知的回收方法 來(lái)進(jìn)行。例如，在采用離子交換樹(shù)脂法、沉淀法，或通過(guò)離心分離等從培養(yǎng)液中除去菌體后， 進(jìn)行濃縮晶析來(lái)進(jìn)行收集。在本發(fā)明中，為了確保高于一定水平的L-氨基酸蓄積，微生物的培養(yǎng)可以分為種 子培養(yǎng)(seed culture)和主培養(yǎng)(main culture)來(lái)進(jìn)行，種子培養(yǎng)可通過(guò)使用培養(yǎng)瓶等 的搖動(dòng)培養(yǎng)或通過(guò)分批培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行，而主培養(yǎng)可以以流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的形式進(jìn)行?；?者，種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)均可以以分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行。在本發(fā)明中，當(dāng)進(jìn)行流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，可以以間歇的方式流加流加培養(yǎng)基， 使乙醇或脂肪酸或其它碳源的流加發(fā)生暫時(shí)的停止。優(yōu)選的是，停止流加培養(yǎng)基供給的時(shí) 間為流加進(jìn)行時(shí)間的至多30%，理想的是至多20%，特別理想的是至多10%。當(dāng)間歇流加 流加培養(yǎng)液時(shí)，可添加一定時(shí)間的流加培養(yǎng)基，并如下控制第二次及以后的添加在某個(gè)添 加期前面的添加停止期中發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)碳源耗盡時(shí)PH的上升和溶氧濃度的上升通過(guò)計(jì)算 機(jī)被檢測(cè)到時(shí)，即開(kāi)始添加；從而培養(yǎng)罐(culture tank)中的基質(zhì)濃度總是自動(dòng)保持在低 水平(美國(guó)專利5，912，113號(hào)說(shuō)明書(shū))。流加培養(yǎng)中使用的流加培養(yǎng)基，優(yōu)選采用含乙醇或脂肪酸和其它碳源、以及具有生長(zhǎng)促進(jìn)效果的營(yíng)養(yǎng)素(生長(zhǎng)促進(jìn)因子)的培養(yǎng)基，并且可以進(jìn)行控制，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中 的脂肪酸濃度在一定濃度以下。這里，所謂一定濃度以下，是指制備添加10w/v%以下、優(yōu)選 5w/v%以下、更優(yōu)選以下的培養(yǎng)基。作為其它碳源，優(yōu)選葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油；作為生長(zhǎng)促進(jìn)因子，優(yōu)選氮源、磷 酸、氨基酸等。作為氮源，可以使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、醋酸銨、尿素等銨鹽 或硝酸鹽等。此外，作為磷酸源，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，作為氨基酸，在使用營(yíng) 養(yǎng)缺陷型突變株的場(chǎng)合，優(yōu)選添補(bǔ)所需求的營(yíng)養(yǎng)素。此外，流加培養(yǎng)基可以是1種，也可以 混合2種以上的培養(yǎng)基。在使用2種以上的流加培養(yǎng)基時(shí)，這些培養(yǎng)基可以混合起來(lái)通過(guò) 1個(gè)補(bǔ)料罐流加，也可以用多個(gè)補(bǔ)料罐流加。在將連續(xù)培養(yǎng)方法用于本發(fā)明時(shí)，可以同時(shí)進(jìn)行取出和流加；也可以取出一部分 后再進(jìn)行流加。此外，所述方法也可以是將包含L-氨基酸和細(xì)胞的培養(yǎng)液取出，然后僅將 細(xì)胞再循環(huán)回發(fā)酵罐，對(duì)菌體進(jìn)行再利用的連續(xù)培養(yǎng)方法(參照法國(guó)專利號(hào)2669935說(shuō)明 書(shū))。作為連續(xù)或間歇流加營(yíng)養(yǎng)源的方法，可以使用與流加培養(yǎng)中所用的相同方法。再利用菌體的連續(xù)培養(yǎng)方法是如下所述的方法在氨基酸濃度達(dá)到預(yù)定水平時(shí)， 將發(fā)酵培養(yǎng)基間歇或連續(xù)地取出，僅取出L-氨基酸，并且將包含菌體的過(guò)濾殘余物再循環(huán) 到發(fā)酵罐中，這種方法可通過(guò)參考例如法國(guó)專利號(hào)2669935說(shuō)明書(shū)來(lái)實(shí)施。其中，將培養(yǎng)液間歇取出時(shí)，可以在L-氨基酸濃度達(dá)到預(yù)定濃度時(shí)取出部分L-氨 基酸，并且新流加培養(yǎng)基來(lái)繼續(xù)培養(yǎng)。此外，至于添加的培養(yǎng)基的量，優(yōu)選進(jìn)行設(shè)定使其最 終與取出之前的培養(yǎng)液的量為等量。這里，“等量”的意思是取出之前培養(yǎng)液量的大約93 107%的量。在將培養(yǎng)液連續(xù)取出時(shí)，優(yōu)選在流加營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的同時(shí)或之后開(kāi)始取出。例如，開(kāi) 始取出的時(shí)間是添加開(kāi)始之后的5小時(shí)之內(nèi)，優(yōu)選3小時(shí)之內(nèi)，更優(yōu)選1小時(shí)之內(nèi)。此外， 至于培養(yǎng)液的取出量，優(yōu)選取出的量和流加的量為等量。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受其限制?！矊?shí)施例1〕<大腸桿菌來(lái)源的醇脫氫酶(AdhE)突變株的構(gòu)建>為了使大腸桿菌能夠以需氧方式同化乙醇，獲取了醇脫氫酶AdhE突變體。大腸桿 菌來(lái)源的野生型AdhE基因(adhe)的堿基序列及其編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO 21 禾口 SEQ ID NO :22。<1-1> 大腸桿菌 MG1655: :PL_tacadhE 株的構(gòu)建通過(guò) Datsenko 禾口 Wanner 開(kāi)發(fā)的稱為"Red—driven integration，，的方法 (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640_6645)禾口 λ 噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)(Cho, Ε. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184 =5200-5203)將大腸桿菌 adhE基因的啟動(dòng)子區(qū)域替換成Pptac;。通過(guò)本方法，使用以5'側(cè)設(shè)計(jì)有目的基因的一部分、3'側(cè)設(shè)計(jì)有抗生素抗性基 因的一部分的合成寡核苷酸作為引物而得到的PCR產(chǎn)物，可以一步式地構(gòu)建基因重組株。 進(jìn)而，結(jié)合使用λ噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)，可以將整合到基因重組株中的抗生素抗性基因 除去。
35
包含I\_ta。和編碼氯霉素抗性(CmK)基因的cat基因的片段，以國(guó)際專利申請(qǐng) W02006/043730記載的大腸桿菌MG1655PL_ta。xylE株的基因組為模板，使用SEQ ID NO :23和 SEQ ID NO :24所示的引物，通過(guò)PCR法來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。SEQ ID NO :23的引物包含adhE基因 的上游區(qū)域的互補(bǔ)序列，SEQID NO 24的引物包含adhE基因的5'區(qū)域的互補(bǔ)序列。PL_tac 的序列如 SEQ ID NO 25 所示。PCR 中使用了 Gene Amp PCRSystem 2700 擴(kuò) 增儀(Applied Biosystems)和Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)。所得擴(kuò)增片段采用瓊 脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行純化、回收。通過(guò)電穿孔將片段導(dǎo)入攜帶具有溫度敏感型的復(fù)制能力 的質(zhì)粒 PKD46 的大腸桿菌 MG1655/pKD46 株中。質(zhì)粒 pKD46 (Datsenko，K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)中包含 λ 噬菌體的總計(jì) 2154 個(gè)堿基 的DNA片段(GenBank/EMBL登錄號(hào)J02459，第31088位 33241位)，該片段中包含阿拉伯 糖誘導(dǎo)性ParaB啟動(dòng)子控制下的編碼λ Red同源重組系統(tǒng)的Red重組酶的基因(γ、β、exo 基因)。質(zhì)粒PKD46對(duì)于將PCR產(chǎn)物整合至MG1655株的染色體上而言是必要的。對(duì)于擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入 到包含具有溫度敏感型的復(fù)制能力的質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌MG1655株中。電穿孔用感受態(tài) 細(xì)胞按下述制備。具體地，將在含100mg/L的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵 母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中30°C培養(yǎng)過(guò)夜的MG1655/pKD46株用含氨芐青霉素(lOOmg/ L)和L-阿拉伯糖(IOmM)的5mL的LB培養(yǎng)基稀釋100倍。對(duì)于所得稀釋物，于30°C在通氣 條件下使其生長(zhǎng)至0D600為約0. 6后，100倍濃縮，用10%甘油洗滌3次，從而使其能夠用于 電穿孔。電穿孔使用70 μ L的感受態(tài)細(xì)胞與約IOOng的PCR產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行。在電穿孔后的杯 子中力口入 ImL 的 SOC 培養(yǎng)基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/SecondEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),于 37°C培養(yǎng) 1小時(shí)后，于37°C在含Cm(氯霉素)(40mg/L)的LB瓊脂培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取 物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L)上進(jìn)行平板培養(yǎng)，選擇出Cm抗性重組體。將Cm抗性株接種到含2 %乙醇的M9平板培養(yǎng)基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)上，從37°C、培養(yǎng)2-3日所生長(zhǎng)出的菌株中選取約100個(gè)克 隆，再于含2%乙醇的M9平板培養(yǎng)基上37°C進(jìn)行培養(yǎng)，選擇36小時(shí)以內(nèi)生長(zhǎng)出的菌株。為 了考察所述菌株的CmK基因與啟動(dòng)子區(qū)域的序列，使用SEQ ID NO 26和SEQ ID NO :27所 示的引物通過(guò)PCR法進(jìn)行了擴(kuò)增。對(duì)于經(jīng)確認(rèn)adhE基因的啟動(dòng)子區(qū)域中包含0^基因的一 個(gè)克隆，于37°C進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)除去溫度敏感型質(zhì)粒pKD46，從而得到了 MG1655: :PL_tacadhE株。<1-2>大腸桿菌MG1655 Δ adhE株的構(gòu)建對(duì)于大腸桿菌MG1655 (ATCC 700926)野生型的adhE基因，采用Datsenko和 Wanner開(kāi)發(fā)的方法將其替換成非活性型adhE基因。以質(zhì)粒pACYC177 (GenBank/EMBL accession number X06402、Fermentas 公司)為模板，使用 SEQ ID N0:28 禾口 SEQ ID NO 29 所示的引物，通過(guò)PCR法擴(kuò)增了包含編碼卡那霉素抗性(KanK)基因的kan基因的片段。SEQ ID NO :28的引物包含與adhE基因318bp上游的區(qū)域的40個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，SEQ IDNO 29 的引物包含與adhE基因3'側(cè)區(qū)域的41個(gè)堿基互補(bǔ)的序列。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems)禾口 Taq DNA 聚合酶(Fermentas 公司)。將所 得擴(kuò)增片段用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化、回收。對(duì)于該片段，通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入攜帶質(zhì)粒
36pKD46的大腸桿菌MG1655/pKD46株。為了確認(rèn)在含20 μ g/ml卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)上生長(zhǎng)出的克隆中存在KmK基因，使用SEQ ID N0:30和SEQ ID NO :31所示的引物，采用PCR法進(jìn)行了擴(kuò)增。對(duì)于一個(gè)已確認(rèn)在adhE基因區(qū)域中包含KmK 基因的克隆，通過(guò)在37°C進(jìn)行培養(yǎng)，除去溫度敏感型質(zhì)粒pKD46，從而得到了 MG1655AadhE 株。<1-3>突變型醇脫氫酶(AdhE*)的構(gòu)建為了將Glu568Lys (E568K)突變導(dǎo)入AdhE，使用與adhE基因的堿基序列 1662-1701和1703-1730互補(bǔ)、且第1702位的堿基引入g — a突變的SEQID NO 32所示的 引物、以及與adhE基因堿基序列的3’末端側(cè)區(qū)域同源的SEQ ID NO :33所示的引物，以大 腸桿菌MG1655株基因組為模板，進(jìn)行了 PCR。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700擴(kuò) 增儀(AppliedBiosystems)和Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造)。對(duì)于所得的1. 05kbp的擴(kuò) 增片段，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了純化、回收。以大腸桿菌MG1655: :PL_tacadhE株基因組為模板，使用SEQ ID NO 34所示的引物 以及導(dǎo)入了突變的1. 05kbp片段作為引物，進(jìn)行了 PCR。SEQ IDNO 34的引物是位于adhE 基因起始密碼子上游402-425bp的引物。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700擴(kuò)增 儀(Applied Biosystems)和TaKaRaLA DNA聚合酶(寶酒造)。對(duì)于所得4. 7kbp的擴(kuò)增片 段，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了純化、回收。為了使野生型adhE基因區(qū)域與突變型adhE基因重組，對(duì)于包含CmK基因和Pptac 下游的突變型adhE基因的4. 7kbp片段(cat_PL_ta。adhE*)，采用Datsenko和Wanner的方法， 通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入MG1655 Δ adhE/pKD46株。對(duì)于所得克隆，在包含2%乙醇作為唯一碳 源的M9平板培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。測(cè)定了生長(zhǎng)出的克隆的adhE基因的序列，結(jié)果鑒定出下述 引起氨基酸取代的突變Glu568Lys(gag_aag)、Ile554Ser(atc_agc)、Glu22Gly (gaa-gga)、 Met236Val (atg-gtg)、Tyr461Cys (tac-tgc)以及 Ala786Val (gca-gta)，將該克隆命名為 MG1655: :PL_ta。adhE* 株。以大腸桿菌MG1655:: PL_tacadhE*株作為供體，使P 噬菌體感染MG1655 Δ tdh rhtA* ^ 白勺 Pl ^ (Miller, J. H. (1972)Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview，NY)，得到了具有乙醇同化性的L-蘇氨酸生產(chǎn)株 MG1655 Δ tdh rhtA*PL_tacadhE* 株。MG1655 Δ tdhrhtA* 株是這樣得到的 L-蘇氨酸生產(chǎn)株 從MG1655株出發(fā)，采用Datsenko和Warmer的方法破壞編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因，并 在rhtA基因中通過(guò)Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入了來(lái)自于在極限培養(yǎng)基中對(duì)高濃度蘇氨酸具有抗性的菌株 VL614rhtA23 (Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154 :123-135)的 rhtA23 突變。<l-4>大腸桿菌WC196 Amez株來(lái)源的醇脫氫酶(AdhE)突變株的構(gòu)建為了對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)菌賦予乙醇同化性，以MG1655 Δ tdh rhtA*PL_ta。adhE*株作 為供體，對(duì)國(guó)際專利公報(bào)W02005/010175所述的L-賴氨酸生產(chǎn)菌WC196 Δ mez/pCABD2株進(jìn) 行了 Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)，得到了具有乙醇同化性的L-賴氨酸生產(chǎn)株WC196Amez PL_tacadhE*/pCABD2 株。WC196 Amez株是編碼蘋(píng)果酸酶(malic enzyme)的sfcA以及b2463基因被破壞的WC196 株(W02005/010175)。pCABD2是攜帶美國(guó)專利No. 6，040, 160所述的對(duì)L-賴氨酸反饋抑制呈抗性的dapA*基因、對(duì)L-賴氨酸反饋抑制呈抗性的IysC*基因、dapB基因以及ddh基因 的質(zhì)粒?！矊?shí)施例2〕<綠硫菌來(lái)源的丙酮酸合酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與活性測(cè)定><2-1>綠硫菌來(lái)源丙酮酸合酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建綠硫菌是最適生長(zhǎng)溫度為48°C的中高溫型自養(yǎng)細(xì)菌，綠硫菌TLS株的基因組序列 已由 Eisen 等闡明(Eisen,J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :9509_9514)。從 該菌株中分離出丙酮酸合酶基因，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒。<2-2>綠硫菌來(lái)源丙酮酸合酶基因表達(dá)株的丙酮酸合酶活性的測(cè)定以綠硫菌TLS株(ATCC49652)的染色體為模板，使用SEQ ID N0:35、36所示 的寡核苷酸進(jìn)行PCR，擴(kuò)增了丙酮酸合酶基因片段。將所得基因片段用SacI切割，插入 PSTV28 (TakaraBio公司制造)的SacI位點(diǎn)，構(gòu)建了質(zhì)粒，將其命名為pSTV-PS。在使用 BigDye Terminators vl. 1 Cycle SequencingKit 確認(rèn)了丙酮酸合酶基因全長(zhǎng)中沒(méi)有 PCR 錯(cuò)誤后，用SacI從pSTV-PS中切出將丙酮酸合酶基因，插入到pMW_Pthr的SacI位點(diǎn)，構(gòu)建 了丙酮酸合酶基因表達(dá)用質(zhì)粒pMW-Pthr-PS。pMW-Pthr是在載體pMW219 (NipponGene公司 制造)的HindIII位點(diǎn)與XbaI位點(diǎn)之間具有大腸桿菌K-12株的蘇氨酸操縱子(thrABC) 的啟動(dòng)子區(qū)域(Pthr)的質(zhì)粒，可通過(guò)在該啟動(dòng)子的下游克隆基因來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)。所使用 的蘇氨酸操縱子的啟動(dòng)子序列如SEQ IDNO 37所示。通過(guò)電穿孔在WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2中分別導(dǎo)入pMW_Pthr_PS以及比較對(duì) 照用載體pMW-Pthr，以卡那霉素抗性為指標(biāo)獲得了轉(zhuǎn)化體，確認(rèn)了質(zhì)粒的導(dǎo)入。將綠硫菌來(lái) 源的丙酮酸合酶基因表達(dá)株命名為WC196 Δ cadA Δ 1 dcC/pCABD2/pMW-Pthr-PS,將對(duì)照株命 名為 WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2/pMW_Pthr。將上述菌株接種于含20mg/L鏈霉素和40mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培 養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)離心分離回收菌體，懸浮于50mM HEPES緩沖液(pH 8.0)中。將懸浮液用超 聲波破碎機(jī)破碎，15000rpm離心15分鐘后，以所得上清作為粗酶液。使用Protein Assay CBB溶液(Nakalai Tesque公司制造)測(cè)定粗酶液中的蛋白 質(zhì)濃度，將相當(dāng)于250μ g總蛋白質(zhì)的粗酶液用于活性測(cè)定?；钚詼y(cè)定如下進(jìn)行。在下述反應(yīng)溶液2mL中加入粗酶液進(jìn)行反應(yīng)。首先，將包含 除底物丙酮酸以外的所有成分的反應(yīng)溶液加入光譜測(cè)定用比色皿中，用橡膠塞和鋁蓋將比 色皿密閉起來(lái)。使用注射器向比色池中吹入氬氣5分鐘，降低比色池內(nèi)的氧濃度。然后，將 比色皿置于分光光度計(jì)(日立公司制造U-3210 Spectrophotometer)上，使用注射器添加 丙酮酸溶液開(kāi)始反應(yīng)。37°C反應(yīng)30分鐘，其中通過(guò)經(jīng)時(shí)測(cè)定578nm的吸光度來(lái)觀察還原型 甲基紫精(methylviologen)的量的變化。結(jié)果如表1所示。表中，比活性的單位為U/mg 蛋白。IU定義為每1分鐘還原Inmol甲基紫精的活性?！卜磻?yīng)液〕MgCl2ImM二硫蘇糖醇ImM甲基紫精5mMCoA0. 25mM丙酮酸IOmM(測(cè)定即將開(kāi)始添加)
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HEPES (ρΗ8· 0)50mM表1表 權(quán)利要求
一種微生物，其具有生產(chǎn)選自L 賴氨酸、L 蘇氨酸、L 色氨酸、L 苯丙氨酸、L 纈氨酸、L 亮氨酸、L 異亮氨酸和L 絲氨酸中的L 氨基酸的能力，且經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化還原酶的活性。
2.權(quán)利要求1所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸合酶的活性。
3.權(quán)利要求1所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸=NADP+氧化還 原酶的活性是通過(guò)增加編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的表達(dá)量和/ 或增加所述基因的翻譯量而增強(qiáng)的。
5.權(quán)利要求4所述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性是 通過(guò)提高編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的拷貝數(shù)或修飾所述基因的 表達(dá)調(diào)節(jié)序列而增強(qiáng)的。
6.權(quán)利要求4或5所述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因編碼下述(A) (D)中任一項(xiàng)所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、 (I)和(J)的多肽(A)包含SEQID NO 2所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQID NO 2中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸 序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(C)包含SEQID NO 4所示的氨基酸序列的多肽；(D)包含在SEQID NO 4中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸 序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(E)下述(El)或(E2)的多肽(El)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(E2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能夠與至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù) 合體的多肽；(F)下述(Fl)或(F2)的多肽(Fl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(F2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能夠與至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù) 合體的多肽；(G)下述(Gl)或(G2)的多肽(Gl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(G2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù) 合體的多肽；(H)下述(Hl)或(H2)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的多肽；(I)下述(Il)或(12)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 65所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 65中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質(zhì)復(fù)合體的多肽；(J)下述(Jl)或(J2)的多肽(Jl)包含SEQ ID NO 67所示的氨基酸序列的多肽；(J2)包含在SEQ ID NO 67中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質(zhì)復(fù)合體的多肽。
7.權(quán)利要求4或5所述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因包含下述(a) (d)中任一項(xiàng)的DNA,或下述(e)、(f)、(g)和(h)的DNA,或下述(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和 (j)的 DNA (a)具有SEQID NO 1所示的堿基序列的DNA ；(b)與SEQID NO :1所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針在 嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(c)具有SEQID NO 3所示的堿基序列的DNA ；(d)與SEQID NO :3所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針在 嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(e)下述(el)或(e2)的DNA (el)具有SEQ ID NO 56所示的堿基序列的DNA ；(e2)與SEQ ID NO :56所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針 在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合 酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(f)下述(fl)或(f2)的DNA (Π)具有SEQ ID NO 58所示的堿基序列的DNA ；(f2)與SEQ ID NO :58所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針 在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合 酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(g)下述(gl)或(g2)的DNA (gl)具有SEQ ID NO 60所示的堿基序列的DNA、(g2)與SEQ ID NO :60所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針 在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合 酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ；(h)下述(hi)或(h2)的DNA (hi)具有SEQ ID NO 62所示的堿基序列的DNA、(h2)與SEQ ID NO :62所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針 在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ； ⑴下述(il)或( 2)的DNA: (hi)具有SEQ ID NO 64所示的堿基序列的DNA ；(h2)與SEQ ID NO :64所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針 在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮酸 合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA ； (j)下述(jl)或(j2)的 DNA: (jl)具有SEQ ID NO 66所示的堿基序列的DNA ；(j2)與SEQ ID NO :66所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針 在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮酸 合酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合體的DNA。
8.權(quán)利要求4或5所述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因編碼下 述㈧或⑶所示的多肽(A)包含SEQID NO 6所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQID NO 6中取代、缺失、插入或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸 序列，并且具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽。
9.權(quán)利要求4或5所述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因包含下 述(a)或(b)的 DNA (a)具有SEQID NO 5所示的堿基序列的DNA ；(b)與SEQID NO :5所示的堿基序列的互補(bǔ)序列或與能夠由該堿基序列制備的探針在 嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽的DNA。
10.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了鐵氧還 蛋白-NADP+還原酶的活性。
11.權(quán)利要求1、權(quán)利要求2 7或權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而 提高了產(chǎn)生鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的能力。
12.權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而降低了蘋(píng)果酸酶的活性。
13.權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾而降低了丙酮酸脫氫酶活性。
14.權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)所述的微生物，其經(jīng)過(guò)修飾從而能夠以需氧方式同化乙醇。
15.權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述微生物是屬于選自埃希氏菌 屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬中的屬的細(xì)菌。
16.權(quán)利要求15所述的微生物，其中，該微生物的NAD型蘋(píng)果酸酶和NADP型蘋(píng)果酸酶 二者的活性均已降低。
17.權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述微生物為棒狀桿菌型細(xì)菌。
18.—種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1 17中任一項(xiàng)所述 的微生物，使該培養(yǎng)基中或菌體內(nèi)生成并蓄積選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯 丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌 體收集L-氨基酸。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基的特征在于含有乙醇或脂肪酸作為碳源。
全文摘要
在培養(yǎng)基，例如包含乙醇或脂肪酸作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-氨基酸的生產(chǎn)能力、且經(jīng)過(guò)修飾而增加了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性的微生物，使該培養(yǎng)基中或菌體內(nèi)生成并蓄積所述L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌體采集L-氨基酸。
文檔編號(hào)C12P13/06GK101939412SQ200880105639
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2008年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日
發(fā)明者伊里納·B·奧爾特曼, 勞尼德·R·普蒂辛, 塔蒂亞納·A·亞姆波爾斯卡亞, 寺下優(yōu), 松井和彥, 納塔利亞·S·厄米納, 納塔利亞·V·斯托諾瓦, 臼田佳弘 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社