專利名稱：人結(jié)締組織生長因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中國人種的結(jié)締組織生長因子。
九十年代以來，在對細胞分子生物學全面了解的基礎(chǔ)上，一類新的基因反應(yīng)--“即刻早期基因反應(yīng)”受到普遍關(guān)注。這是細胞受到外界信號刺激后立即產(chǎn)生的一種基因反應(yīng)，它由多種刺激信號途徑所激發(fā)，對各種信號刺激作出自身的以及相應(yīng)組織或其它細胞的整體反應(yīng)，以確保整個組織或機體的平衡。在研究各種生長因子對于組織再生和修復的作用中，發(fā)現(xiàn)了由內(nèi)皮細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的結(jié)締組織生長因子，這種新的生長因子可能在人類組織的正常發(fā)育、生長和修復過程中發(fā)揮重要作用。
科學試驗表明，在細胞即刻早期反應(yīng)中，有一部分反應(yīng)產(chǎn)物就是一些具有較強生物學功能的細胞因子，當其在特定刺激下產(chǎn)生后，它們能通過其它細胞或組織，發(fā)揮其特定的生物學效應(yīng)，以保證機體的代償平衡。
人結(jié)締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor-縮寫CTGF)就是這樣的即刻早期基因產(chǎn)物。在正常情況下，血中和體液中無可檢測到的CTGF，當在創(chuàng)傷刺激或某些細胞因子的信號刺激下，它以即刻早期基因產(chǎn)物形式被迅速合成分泌并作用于結(jié)締組織中的細胞基質(zhì)、成纖維細胞以及血管內(nèi)皮細胞等。同時對其它炎性細胞表現(xiàn)一種趨化作用，通過這一系列的生物學效應(yīng)，它能促進創(chuàng)傷的修復，調(diào)節(jié)創(chuàng)傷部位纖維組織、血管內(nèi)皮細胞等的生長。CTGF作為一個具有促進創(chuàng)傷修復的生物活性因子，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
但是，迄今為止，CTGF作為一種具有應(yīng)用價值的細胞因子，僅在理論上得到認識。其純化技術(shù)、活性檢測系統(tǒng)均未完全建立，有待進一步深入研究。
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，從克隆中國人種的CTGF基因入手，建立中國人種的CTGF基因克隆，并明確其系列結(jié)構(gòu)，從而建立CTGF的表達體系，完善產(chǎn)物純化方法及產(chǎn)物活性檢測方法。
本發(fā)明公開的人結(jié)締組織生長因子(HCTGF)具有以下特征1、序列特征本發(fā)明hCTGF的cDNA位序列含有一個1050個核苷酸的開放閱讀框，起始位點位于第120位，TGA終止位點位于第1179位，編碼350個氨基酸。在3’端非編碼區(qū)與國外已發(fā)表的序列有明顯的差異性，這個差異的意義目前尚不能肯定，僅就一般原則而言，可能與CTGF表達調(diào)控的不同有一定關(guān)系(從這個角度亦證明本發(fā)明所分離的這個基因的獨立性)。同時，對數(shù)個基因片段中的有關(guān)位置進行無義點突變修飾后，使該基因增加了一個KpnⅠ位點，一個xhoⅠ位點(酶切位點的引入并不影響CTGF的氨基酸編碼系列)，該二位點亦可作為該基因的特征之一。本發(fā)明中包括5’和3’非翻譯區(qū)的多核苷酸；含啟動子的5’調(diào)控區(qū)。CTGF開放閱讀框編碼的多肽含39個半胱氨酸殘基，表明這是一種具有許多分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)。該肽的氨基端含一段疏水信號序列，提示這是一種分泌蛋白，而且該肽在氨基酸系列的28位和225位天冬酰胺基上有兩個N-連接的糖基化位點。CTGF多肽的特征是以單體形式存在，分子量為36～38KD。
2、來源克隆中國人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞mRNA3、序列描述(見后頁)
120Encodingregion 5｀...../ATGACCGCCGCCAGTATGGGCCCCGTCCGCGTCGCCTTCGTGGTCCTCCTCGCCCTCTGCAGCCGGCGGGCCGTCGGCCACAACTGCAGCGGGCCGTGCCGGTGCCCGGACGAGCCGGCGCCGCGCTGCCCGGCGGGCGTGAGCCTCGTGCTGGACGGCTGCGGCTGCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCTGGGCGAGCTGTGCACCGAGCGCGACCCCTGCGACCCGCACAAGGGCCTCTGTGACTTCGGCTCCCCGGCCAACCGCAAGATCGGCGTGTGCACCGCCAAAGATGGTGCTCCCTGCATCTTCGGTGGTACGGTGTACCGCAGCGGAGACTGGTTCCAGAGCAGCTGCAAGTACCAGTGCTCGTGCCTGGACGGGGCGGTGGGCTGCATGCCCCTGTGCAGCATGGACGTTCGTCTGCCCAGCCCTGACTGCCCCTTCCCGAGGAGGGTCAACCTGCCCGGGAAATGCTGCGAGGAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGGACCAAACCGTGGTTGGGCCTGCCCTCGCGGCTTACCGACTGGAAGACACGTTTGGCCCAGACCCAACTATGATTAGAGCCAACTGCCTGGTCCAGACCACAGAGAAGCAGAGCCGCCTGTGCATGGTCAGGCCTTGCGAAGCTGACCTGGAAGAGAACATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCATCCGTACTCCCAAAATCTCCAAGCCTATCAATTTGAGCTTTCTGGCTGCACCAGCATGAAGACATACCGAGCTAAATTCTGTGGAGTATGTACCGACGGCCGATGCTGCACCCCCCACAGAACCACCACCCTGCCGGTGGAGTTCAAGTGCCCTGACGGCGAGGTCAAGAAGAAGAACATGATGTTCATCAAGACCTGTGCCTGCCATTACAACTGTCCCGGAGACAATGACATCTTTGAATCGCTGTACTACAGGAAGATGTACGGAGACAT1179 Noncoding region GGCATGA/AGCCAGAGAGTGAGAGACATTAACTCATTAGACTGGAACTTGAACTGATTCACATCTCATTTTTCCGTAAAAATGATTTCAGTGGCACAAGTTATTTAAATCTTTTTTTCTAACTGGGGGAAAAGGTCCCACCCAATTCAAACATTGTGCCATGTCAAACAAATAGTCTATCTTCCCAGCACTGGTTTGAAGAATGTAATACTTGACAGTGGAACTACATTAGTACACAGCACCAGAATGTATATTAAGGTGTGGCTTTAGGAGCACTGGGAGGGTACCGGCCCGGTTAGTATCGTCAGATCGACTCTTATAAGAGTAATATGCCTGCTATTTGAAGTGTAATGGAGAAGGAAAATTTTAGCGTGCTCACTGACCTGCCTGTAGCCCCAGTGACAGCTAGGATGTGCATTCTCCAGCCATCAAGAGACTGAGTCAAGTTGTTCCTTAAGTCAGAACAGCAGACTCAGCTCTGACATTCTGATTCGAATGACACTGTTGTATGCAGCTATTCTAGTAGAATGTGTAGCCCCACTTAATGAAAAAATCCTTATAAAAACTGAAAAACTCTATATAGGTGATCAGNNNTTTCACCNGGAAGCATTTGGTTCTACTTTATATGACTNNNTCGGACAGTTTATTGTTGAGAGTGTGAAAAAAAGTTACATGTTTGCACCTTCTAGTTAAAATAAAGTTCATGTTCGCCCTTTCTAGTTGAAGAAAGTGTATATTTTTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3′
本發(fā)明提供了人結(jié)締組織生長因子的制備方法，該法包括從初產(chǎn)婦的胎盤臍靜脈得到可維持培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞；再從經(jīng)PDGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中提取的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到CTGFcDNA片段；經(jīng)基因修飾、連接并擴增得到CTGF編碼區(qū)基因片段；然后對所得的各CTGF亞克隆片段進行修飾、連接制得。
本發(fā)明還提供了表達載體的構(gòu)建及產(chǎn)物的純化方法在CTGF的表達方面，構(gòu)建了以融合蛋白形式表達載體-pGEX-CTGF，并實現(xiàn)較高水平的表達。重組產(chǎn)品的純化工作，目前仍是基因工程中的一個重點和難點技術(shù)，CTGF原核表達中的純化問題，由于其沒有相關(guān)的資料，故是一個較為復雜的過程，pGEX表達載體產(chǎn)物-即與GST融合的蛋白，由于CTGF的獨特特性，是一種具有許多分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)，所形成的融合蛋白以不溶形式存在。表達蛋白沉淀以7M鹽酸胍溶解，PBS透析復性后，使用排阻層析和Sepharose4B Glutathion親和層析純化后，以凝血酶酶解，已能獲得約90％純度的重組體蛋白。
本發(fā)明同時提供其活性檢測方法經(jīng)過重組技術(shù)所生產(chǎn)的CTGF，選用人胚胎成纖維細胞KMB-17作為基質(zhì)細胞進行檢測，當其以純化的CTGF作為細胞生長刺激劑時，此細胞對CTGF的刺激表現(xiàn)出相對明顯的增殖效應(yīng)，從而說明所得CTGF的確具有刺激成纖維細胞生長繁殖的活性，此外，CTGF對腺體細胞SGC和Vero細胞也表現(xiàn)一定的刺激作用，這進一步肯定了其生物學活性。MTT法檢測結(jié)果說明在0.3～100ng/ml的濃度范圍內(nèi)，CTGF可有效刺激成纖維細胞增殖，以3ng/ml時效果最佳。
本發(fā)明對CTGF活性機理的研究-CTGF作用后KMB-17細胞原癌基因表達分析研究表明，受CTGF刺激后伴隨KMB-17細胞增殖過程所出現(xiàn)的src原癌基因表達與正常細胞相比有明顯差異，src基因產(chǎn)物是一類具有SH功能域的信號傳遞分子，因此其表達的增加意味著細胞在信號傳遞方面功能的增強。
-CTGF作用于KMB-17細胞后蛋白磷酸化分析研究表明，細胞內(nèi)有17KD的蛋白分子出現(xiàn)磷酸化現(xiàn)象，且在特定的時間(2hrs)較為明顯，提示CTGF對細胞的信號刺激是通過特定的磷酸化傳導的。利用特異性抗磷酸化酪氨酸抗體所做的免疫沉淀實驗結(jié)果證實CTGF作用細胞后產(chǎn)生的磷酸化蛋白分子為酪氨酸磷酸化蛋白。本發(fā)明對藥效學觀察在促進創(chuàng)傷的修復，調(diào)節(jié)創(chuàng)傷部委纖維組織、血管內(nèi)皮細胞生長試驗中，已取得滿意的效果。
-CTGF對燙傷小鼠皮膚的愈合研究結(jié)果表明，CTGF在10～60ng/ml濃度范圍內(nèi)對小鼠皮膚淺Ⅰ度燙傷的愈合有一定的促進作用。
-CTGF基因治療家兔外周缺血性模型的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因產(chǎn)物的導入可刺激新生血管的形成，并可明顯增加血流量。
-正處于治療外周及冠狀動脈缺血性疾病的試驗研究階段，并積極進行著新藥開發(fā)工作。
本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點1、本發(fā)明從培養(yǎng)得到的人臍靜脈脈內(nèi)皮細胞中，克隆到了CTGF的編碼基因。并明確了其序列結(jié)構(gòu)，在3′端非編碼區(qū)與國外已發(fā)表的序列有明顯差異，從該角度也證明了中國人種CTGF具有獨立性。同時該全基因經(jīng)無義突變引起了KpnⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點，是其主要特征。構(gòu)建了原核表達載體PGEX-CTGF，靶蛋白表達量可達20％以上。
2、CTGF多肽的主要生物學活性是其絲裂原性，或刺激靶細胞增殖的能力。這種絲裂原活性在體內(nèi)的最終結(jié)果是靶組織的生長，CTGF也具有趨化活性，即指細胞與特殊的分子相互作用，結(jié)果引起細胞的化學誘導性運動。此前尚未發(fā)現(xiàn)對結(jié)締組織細胞具有絲裂原活性和趨化活性的生長因子，因此CTGF蛋白的發(fā)現(xiàn)及編碼這種分子的cDNA的克隆具有重要意義。
3、藥效學觀察表明，本發(fā)明所述的人結(jié)締組織生長因子(HCTGF)，在某些臨床情況，如燒傷、燙傷等創(chuàng)傷的愈合及心血管疾病中可作為一種治療制劑。
4、本發(fā)明的實驗進展顯示，當HCTGF與相應(yīng)受體結(jié)合后，所產(chǎn)生的信號傳遞過程中，在小分子蛋白的酪氨酸位置上會發(fā)生磷酸化，這個蛋白的酪氨磷酸合過程與細胞的增殖及原癌基因Src表達的增加有關(guān)聯(lián)。六種原癌基因探針對其在細胞受CTGF刺激后表達情況的分析表明，受CTGF刺激后伴隨KMB-17增殖過程所出現(xiàn)的原癌基因表達與正常細胞相比有明顯差異的是src基因的表達，而其余的fos,myc,intmos,ras均與正常細胞相同。原癌基因在正常細胞中是以一些執(zhí)行正常細胞調(diào)控功能的特殊因子形式出現(xiàn)的，src基因產(chǎn)物事實上是一類具有SH功能域的信號傳遞分子，因此，其表達的增加意味著細胞在信號傳遞方面功能的增強。本發(fā)明的基礎(chǔ)研成果對將細胞因子類的基因工程產(chǎn)品實際應(yīng)用于臨床，對多種疾病的治療和預(yù)防具有廣泛的應(yīng)用前景和重要意義。


圖1為形成單層的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(200x)；圖2為經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-PCR擴增得到的CTGFcDNA片段；圖3為經(jīng)基因修飾，連接并擴增得到的CTGF編碼區(qū)基因片段，a．CTGF編碼基因，b．DNA標準分子量，c．pGEX載體；圖4為CTGF各個亞克隆基因片段的連接方案；圖5為CTGF刺激KMB-17細胞后六種原癌基因的表達趨向a、b、c、d、e、f分別為CTGF刺激KMB-17細胞及細胞對照的c-fos、myc、int、src、mos、ras原癌基因的表達情況。
圖6為各濃度CTGF對人成纖維細胞的增殖作用。
通過下面給出的本發(fā)明的具體實施例可以進一步清楚地了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限定。
除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。
制備實施例包括以下的工藝步驟和條件1、人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)臍帶組織取自云南省第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科健康初產(chǎn)婦，采用MEM培養(yǎng)液(SIGMA公司產(chǎn)品)保存臍帶，10分鐘后，將經(jīng)MEM培養(yǎng)液洗凈的臍靜脈分離，并剪下其內(nèi)皮層，初步剪碎后加入0.1％胰酶-0.2％膠原酶Ⅰ(SIGMA公司產(chǎn)品)，常溫下攪拌消化10分鐘，用MEM培養(yǎng)液洗兩次，細胞溶液懸于DMEM-8％胎牛血清(GIBLCO公司產(chǎn)品)，1％雙抗，pH7.4培養(yǎng)液，37℃靜止培養(yǎng)，2～3天后形成單層備用。
2、原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞mRNA的提取單層細胞先經(jīng)無血清的DEME洗三遍，加入含有PDGF(0.5ng/ml)的無血清DEME，37℃培養(yǎng)1小時，冷PBS洗二次，使用Quickprop mRNA純化試劑盒(Pharmacia公司產(chǎn)品)提取細胞總mRNA。經(jīng)冷乙醇沉淀后，離心，干燥，以含有RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯處理過的去離子水溶解，定量為o.4ug/ml,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 3、CTGFmRNA的逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增根據(jù)CTGF基因中全基因長度及其序列情況，分別合成三對引物①a．GAGAATTCATGACCGCCGCCAG；b．AGAGAATTCTGCCAGCTGCTCTGGAA；②a．GAATTCAGCAGCTGCAAGTAC；b．GAGAATTCCGTGTCTTCCAGTC；③a．GAGAATTCCTTACGACCTGGAA；b．GAGAATTCTCATGCCATGTCTCC；a均為5′端引物，b均為3′端引物。三對引物都設(shè)計以EcoRⅠ位點置于5′端和3′端。首先以cDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(pharmacia)公司產(chǎn)品，使用3′端引物，從上述臍靜脈內(nèi)皮細胞mRNA中取出三份，每份5ul，均含mRNA 0.5ug,mRNA在75℃變性5分鐘，冰浴，加入引物，冰浴10分鐘，繼續(xù)加入試劑盒內(nèi)的相關(guān)成分，37℃,90分鐘，再以該逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為引物，PCR擴增所得的CTGF cDNA條件為94℃3分鐘變性，94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘，30個循環(huán)，72℃延伸反應(yīng)6分鐘。完成的樣品上樣電泳，剩余樣品經(jīng)酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀純化，溶于ddH2O,-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、DNA連接反應(yīng)及細菌轉(zhuǎn)化所需連接的各種核酸-CTGF分段基因和全基因，與各種載體，包括克隆載體和表達載體，經(jīng)全部酶切，檢測，酚∶氯仿抽提、乙醇純化過程，沉淀，溶于ddH2O按含量比例混合，加入新鮮配制的ATP，連接緩沖液，連接酶(T4ligase,Bio-Red公司產(chǎn)品)。16℃,18小時。取出總體積的1/10,1/5各一份，加入預(yù)先制備好的鈣轉(zhuǎn)化細菌(DH5a BL21 JM-109等)50ul,0℃45分鐘，42℃90秒，0℃2分鐘，加入等量LB,37℃1小時，涂布于有選擇性抗菌素(包括氨卞抗性和卡那抗性等)的LB-瓊脂平板上，37℃15～18小時。觀察重組菌體生長情況。
5、重組DNA質(zhì)粒的鑒定重組連接DNA質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化細菌，菌落從帶有相應(yīng)抗菌素培養(yǎng)基上小量擴增后，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，先經(jīng)酶的鑒定，再經(jīng)測序確定其讀碼框架正確與否。
6、DNA測序反應(yīng)各類重組質(zhì)粒DNA的測序均使用T7測序試劑盒(pharma-cia公司產(chǎn)品)。測序引物包括通用引物和設(shè)計的各種引物，其中用于CTGF序列測定的引物分別為a．5′AACTGCCTGGTCCAG3′；b．5′AAAGATGGTGCTCC3′；c．3′GGCTCTAATCATCGT5′；d．5′AACTGCCTGGTCCAG3′；e．5′CATGTTCTTCTTCATG3′；用于CTGF表達載體的測序引物為a．5′AACTGCCTGGTCCAG3′用于pGEX-CTGF測序；b．5′AAAGATGGTGCTCC3′用于pBV-CTGF測序；C．3′GGCTCTAATCATCGT5′用于pSVK3-CTGF測序。
7、CTGF基因修飾及全碼區(qū)連接逆轉(zhuǎn)錄后克隆所得到的CTGF基因共三個片段，為將其完整地連接為全編碼區(qū)CTGF基因，使用了點突變方法，在三個片段的5′及3′末端，均引入了新的酶切位點。但此點突變位點均為無義突變，具體突變?yōu)槠?、CTGF-1:5′-GGTACG(C)GTG3′(含KPnⅠ切點)；片段2、CTGF-2:5′-GGTGGTACG(c)-CTG(C)GAA(G)GAC3′(含KpnⅠ和Ⅺ切點)，片斷3、CTGF-3:5′TACCGACTG(C)GAA(G)-3′(含XhoⅠ切點)，突變方法為寡核苷酸點突變，該突變引物以PCR方法獲得三個帶突變堿基的片段，純化后，分別經(jīng)kpnⅠ和XhoⅠ酶切，再提純，再按小片段連接方法連接三個片段，加入PEG8000可縮小連接體積，再以帶有EcoRⅠ位點的兩個引物A)5′GAGAATTCATGACCGCCGCCAG3′
B)5′GAGAATTCTCATGCCATGTCTCC3′它們含CTGF基因全編碼區(qū)基因范圍，將上述三個片段的連接產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增，最后得到CTGF編碼區(qū)全基因，即人結(jié)締組織生長因子(HCTGF)。
試驗1對燙傷小鼠皮膚的愈合試驗將過濾無菌置4℃保存的制備實施例所述的CTGF分別稀釋成10ng/ml,60ng/ml,360ng/ml的溶液，用含0.2％的人白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基作為溶劑，每次給藥前臨時配制。各組小鼠在燙傷4小時后，開始涂擦相應(yīng)濃度的CTGF溶液，每只小鼠0.2ml，每日2次，早晚各一次，共擦7天。對照組以同樣的方法涂擦含0.2％的人白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基。每日觀察動物傷口愈合情況。于第15天紀錄各組小鼠燙傷傷口的愈合情況，結(jié)果如表1。
表1

*與對照組相比，P＜0.05試驗2各濃度CTGF對人成纖維細胞的增殖作用如附圖7所示，在所測定的濃度范圍內(nèi)(0.3ng/ml～100ng/ml)，從0.3ng/ml～3ng/ml，隨著CTGF濃度的增加，所測得的人成纖維細胞的OD值亦增加，呈典型的量效關(guān)系，3ng/ml時達到峰值。當CTGF濃度超過3ng/ml后，OD值稍有減少，但其OD值仍高于不加CTGF時的OD值。試驗結(jié)果說明，在所測試的濃度范圍內(nèi)，CTGF能有效刺激人成纖維細胞的增殖，以3ng/ml時刺激效果最佳。
權(quán)利要求
1.一種人結(jié)締組織生長因子，其序列特征為①hCTGF的cDNA位序列含有一個1050個核苷酸的開放閱讀框，起始位點位于第120位，TGA終止位點位于第1179位，編碼350個氨基酸；對數(shù)個基因片段中的有關(guān)位置進行無義點突變修飾后，使該基因增加了一個KpnⅠ位點，一個xhoⅠ位點；包括5’和3’非翻譯區(qū)的多核苷酸；含啟動子的5’調(diào)控區(qū)；CTGF開放閱讀框編碼的多肽含39個半胱氨酸殘基；該肽的氨基端含一段疏水信號序列，在氨基酸系列的28位和225位天冬酰胺基上有兩個N-連接的糖基化位點。CTGF多肽的特征是以單體形式存在，分子量為36～38KD；②來源克隆中國人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞mRNA；③序列描述120Encoding region 5｀...../ATGACCGCCGCCAGTATGGGCCCCGTCCGCGTCGCCTTCGTGGTCCTCCTCGCCCTCTGCAGCCGGCGGGCCGTCGGCCACAACTGCAGCGGGCCGTGCCGGTGCCCGGACGAGCCGGCGCCGCGCTGCCCGGCGGGCGTGAGCCTCGTGCTGGACGGCTGCGGCTGCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCTGGGCGAGCTGTGCACCGAGCGCGACCCCTGCGACCCGCACAAGGGCCTCTGTGACTTCGGCTCCCCGGCCAACCGCAAGATCGGCGTGTGCACCGCCAAAGATGGTGCTCCCTGCATCTTCGGTGGTACGGTGTACCGCAGCGGAGACTGGTTCCAGAGCAGCTGCAAGTACCAGTGCTCGTGCCTGGACGGGGCGGTGGGCTGCATGCCCCTGTGCAGCATGGACGTTCGTCTGCCCAGCCCTGACTGCCCCTTCCCGAGGAGGGTCAACCTGCCCGGGAAATGCTGCGAGGAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGGACCAAACCGTGGTTGGGCCTGCCCTCGCGGCTTACCGACTGGAAGACACGTTTGGCCCAGACCCAACTATGATTAGAGCCAACTGCCTGGTCCAGACCACAGAGAAGCAGAGCCGCCTGTGCATGGTCAGGCCTTGCGAAGCTGACCTGGAAGAGAACATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCATCCGTACTCCCAAAATCTCCAAGCCTATCAATTTGAGCTTTCTGGCTGCACCAGCATGAAGACATACCGAGCTAAATTCTGTGGAGTATGTACCGACGGCCGATGCTGCACCCCCCACAGAACCACCACCCTGCCGGTGGAGTTCAAGTGCCCTGACGGCGAGGTCAAGAAGAAGAACATGATGTTCATCAAGACCTGTGCCTGCCATTACAACTGTCCCGGAGACAATGACATCTTTGAATCGCTGTACTACAGGAAGATGTACGGAGACAT1179 Noncodingregion GGCATGA/AGCCAGAGAGTGAGAGACATTAACTCATTAGACTGGAACTTGAACTGATTCACATCTCATTTTTCCGTAAAAATGATTTCAGTGGCACAAGTTATTTAAATCTTTTTTTCTAACTGGGGGAAAAGGTCCCACCCAATTCAAACATTGTGCCATGTCAAACAAATAGTCTATCTTCCCAGCACTGGTTTGAAGAATGTAATACTTGACAGTGGAACTACATTAGTACACAGCACCAGAATGTATATTAAGGTGTGGCTTTAGGAGCACTGGGAGGGTACCGGCCCGGTTAGTATCGTCAGATCGACTCTTATAAGAGTAATATGCCTGCTATTTGAAGTGTAATGGAGAAGGAAAATTTTAGCGTGCTCACTGACCTGCCTGTAGCCCCAGTGACAGCTAGGATGTGCATTCTCCAGCCATCAAGAGACTGAGTCAAGTTGTTCCTTAAGTCAGAACAGCAGACTCAGCTCTGACATTCTGATTCGAATGACACTGTTGTATGCAGCTATTCTAGTAGAATGTGTAGCCCCACTTAATGAAAAAATCCTTATAAAAACTGAAAAACTCTATATAGGTGATCAGNNNTTTCACCNGGAAGCATTTGGTTCTACTTTATATGACTNNNTCGGACAGTTTATTGTTGAGAGTGTGAAAAAAAGTTACATGTTTGCACCTTCTAGTTAAAATAAAGTTCATGTTCGCCCTTTCTAGTTGAAGAAAGTGTATATTTTTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’
2.一種權(quán)利要求1所述的人結(jié)締組織生長因子的制備方法，包括以下步驟①從初產(chǎn)婦的胎盤臍靜脈得到可維持培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞；②再從經(jīng)PDGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中提取的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到CTGFcDNA片段；③經(jīng)基因修飾、連接并擴增得到CTGF編碼區(qū)基因片段；④然后對所得的各CTGF亞克隆片段進行修飾、連接制得。
3.一種權(quán)利要求1所述的人結(jié)締組織生長因子的表達載體的構(gòu)建及產(chǎn)物的純化方法將表達蛋白沉淀以7M鹽酸胍溶解，PBS透析復性后，使用排阻層析和Sepharose4B Glutathion親和層析純化后，以凝血酶酶解，獲得90％純度的重組體蛋白。
4.一種權(quán)利要求1所述的人結(jié)締組織生長因子的活性檢測方法經(jīng)過重組技術(shù)所生產(chǎn)的CTGF，選用人胚胎成纖維細胞KMB-17作為基質(zhì)細胞進行檢測，當其以純化的CTGF作為細胞生長刺激劑時，此細胞對CTGF的刺激表現(xiàn)出相對明顯的增殖效應(yīng)，從而說明所得CTGF的確具有刺激成纖維細胞生長繁殖的活性，此外，CTGF對腺體細胞SGC和Vero細胞也表現(xiàn)一定的刺激作用，這進一步肯定了其生物學活性；MTT法檢測結(jié)果說明在0.3～100ng/ml的濃度范圍內(nèi)，CTGF可有效刺激成纖維細胞增殖，以3ng/ml時效果最佳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人結(jié)締組織生長因子(HCTGF)及其制備方法,包括以下步驟:從初產(chǎn)婦的胎盤臍靜脈得到可維持培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞;再從經(jīng)PDGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中提取的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到CTGFcDNA片段;經(jīng)基因修飾、連接并擴增得到CTGF編碼區(qū)基因片段;然后對所得的各CTGF亞克隆片段進行修飾、連接制得。
文檔編號C12N15/12GK1314415SQ0110722
公開日2001年9月26日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者李琦涵, 趙紅玲, 王炯, 王麗春, 趙樹棟, 孫明, 和紹清, 董承紅, 胡方, 劉龍丁, 董少忠, 王晶晶, 馬紹輝 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所