一種提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種通過兩種微生物共發(fā)酵來提高發(fā)酵菌生 產(chǎn)2, 3-丁二醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 2, 3-丁二醇可以作為一種潛在的平臺化合物，替代傳統(tǒng)的平臺化合物，用于大規(guī) 模合成甲乙酮(優(yōu)良溶劑）和1，3-丁二烯(廣泛應(yīng)用于合成橡膠、聚酯和聚亞胺酯等領(lǐng)域)。 除此之外，2, 3- 丁二醇還可用于制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥及藥 物手性載體等，2, 3-丁二醇的氧化產(chǎn)物3-羥基丁酮和丁二酮可作為食用香料使用；同時， 因其熱值較高，與乙醇、甲醇相當(dāng)，故可作為燃料添加劑；2, 3-丁二醇酯化后可生成聚氨酯 泡沫的前體；2, 3-丁二醇與乙酸反應(yīng)生成2, 3-丁二醇二乙酸酯，該酯可加到奶油中改善風(fēng) 味；2, 3-丁二醇在我國還被添加到白酒中，以改善白酒的風(fēng)味。2, 3-丁二醇脫氫變成雙乙 酰，雙乙酰在食品工業(yè)中作為一種具有很高價值的風(fēng)味。2, 3- 丁二醇的L型異構(gòu)體可用于 抗凍劑。2, 3- 丁二醇酯化物能作為制作藥物和化妝品的前體。目前2, 3- 丁二醇的合成主 要采用以石油裂解物為來源的化學(xué)法，但隨著石油資源的大量消耗和不可再生資源價格的 節(jié)節(jié)攀升，發(fā)展環(huán)境友好的生物基化學(xué)品的生物煉制技術(shù)已成為轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長方式、保障 生態(tài)鏈良性循環(huán)、實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。
[0003] 隨著生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，2, 3- 丁二醇主要以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn) 2, 3-丁二醇主要菌種有克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬（Serraiia)、芽孢桿菌屬 (ZfeciBw1S)和氣單孢菌菌屬其生物發(fā)酵工藝已相對成熟。隨著生物發(fā)酵生 產(chǎn)2, 3- 丁二醇研究的深入，克雷伯氏菌逐漸成為一種優(yōu)勢菌種，成為研究的熱點(diǎn)。
[0004] CN200910046726. 8公開了一種肺炎克雷伯氏菌及其制備氫氣和2, 3- 丁二醇的方 法，其在厭氧的條件下發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣和2, 3- 丁二醇，增加了生產(chǎn)的附加值，但是2, 3- 丁二 醇的產(chǎn)量很低。CN200710021641.5公開了一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其應(yīng)用，利用該產(chǎn)酸克 雷伯氏菌生物合成2, 3- 丁二醇并降低該過程中副產(chǎn)物有機(jī)酸的產(chǎn)量，但是該法處理前后 2,3-丁二醇產(chǎn)量增加并不明顯。0吧00810138838.1公開了一株肺炎克雷伯氏菌及其在制 備2, 3-丁二醇中的應(yīng)用，但是以葡萄糖為底物進(jìn)行2, 3-丁二醇的轉(zhuǎn)化屬于氧化代謝途徑， 克雷伯氏菌屬于典型的兼性厭氧微生物，在發(fā)酵初期生物量累積較慢，以至于發(fā)酵周期較 長。CN200410037692. 3公開了一種微生物兩段發(fā)酵法由甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇和2, 3 丁二 醇的方法，采用前期厭氧后期好氧兩段發(fā)酵的新工藝，雖然利用厭氧與好氧的條件控制，能 夠?qū)Πl(fā)酵菌株代謝過程進(jìn)行人為調(diào)控，但是對于由單一發(fā)酵菌株的發(fā)酵過程而言，這樣的 調(diào)控效果一般，而且會引入更多的發(fā)酵副產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)2, 3- 丁二醇的方法。 該方法將克雷伯氏菌和乳酸菌進(jìn)行共發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇，一方面以乳酸菌優(yōu)化糖代謝， 增加中間代謝產(chǎn)物的供給，提高2, 3- 丁二醇的發(fā)酵水平；另一方面，通過調(diào)控發(fā)酵過程中 氧氣的供給量，調(diào)節(jié)兩種菌的代謝途徑，在提高2, 3-丁二醇產(chǎn)量的同時，獲得經(jīng)濟(jì)效益更 好的高濃度雙乙酰。
[0006] 本發(fā)明微生物發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇的方法，包括以下步驟：（1)種子液培養(yǎng)：以 MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌的培養(yǎng)，獲得乳酸菌種子液；以LB培養(yǎng)基進(jìn)行克雷伯氏菌的培養(yǎng)，獲 得克雷伯氏菌種子液；（2)發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入兩種菌株混合的發(fā)酵種子液，在 發(fā)酵初始階段以厭氧或微氧發(fā)酵為主，當(dāng)光密度OD 65tl (OD65tl是指波長為650nm光照下測得 的OD值）大于5時增加通氣量，進(jìn)行好氧發(fā)酵。
[0007] 本發(fā)明方法中，所采用的乳酸菌為干酪乳桿菌；所采用克雷伯氏菌優(yōu)選肺炎克雷 伯氏菌。
[0008] 本發(fā)明方法中，乳酸菌種子液與克雷伯氏菌種子液按照1:1?1:3的比例配成發(fā) 酵種子液。
[0009] 本發(fā)明方法中，種子液培養(yǎng)過程如下：將菌種保藏液與種子培養(yǎng)基按體積 1:100?1:500的比例混合于培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)溫度為30°C?40°C，攪拌速度為 IOOrpm?400rpm，pH控制在4?7之間，種子液培養(yǎng)過程中保持微氧或厭氧條件。
[0010] 本發(fā)明方法中，微氧發(fā)酵時無空氣通入，依靠發(fā)酵液中溶解氧維持微氧狀態(tài)；厭氧 發(fā)酵時通入流速為〇· Ivvm?0· 5vvm的氮?dú)?；好氧發(fā)酵時通入流速為0· 5vvm?Ivvm的空 氣。
[0011] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵過程如下：發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為底物，發(fā)酵種子液體積和培 養(yǎng)基體積按1:9?1:20比例在生物反應(yīng)器內(nèi)混合，培養(yǎng)溫度為30°C?40°C，攪拌速度為 200rpm?500rpm，pH控制在5?7之間。
[0012] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵初始葡萄糖底物濃度控制在50g/L?100g/L ;發(fā)酵過程中，通 過流加形式補(bǔ)充葡萄糖，使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在20g/L?40g/L。
[0013] 本發(fā)明方法中，生物量的累積程度以培養(yǎng)液的OD值作為參考。通過濁度法測量培 養(yǎng)液中菌體濃度，根據(jù)所測的OD值與細(xì)胞濃度成正比的關(guān)系，以O(shè)D值判斷培養(yǎng)液中的菌體 濃度。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明方法所采用的乳酸菌、克雷伯氏菌是典型的兼性厭氧微生物，在好氧和厭氧 條件下，分別具有不同的代謝途徑。因此通過微氧(厭氧)、好氧的條件控制，對兩種菌株進(jìn) 行有針對性的代謝調(diào)控，即在發(fā)酵初期進(jìn)行微氧(厭氧）控制，以利于乳酸菌的EMP代謝，提 高中間代謝物(丙酮酸、3-磷酸甘油酸等）的濃度，促進(jìn)克雷伯氏菌生物量的積累；在發(fā)酵 的中后期進(jìn)行好氧控制，以利于克雷伯氏菌進(jìn)行2, 3- 丁二醇的生產(chǎn)。通過這樣的過程調(diào) 控強(qiáng)化了克雷伯氏菌生長的微氧增殖階段和2, 3-丁二醇積累的發(fā)酵階段，更有利于提高 2, 3- 丁二醇的發(fā)酵水平，提高2, 3- 丁二醇的產(chǎn)量。
[0015] 2、乳酸菌在微氧或厭氧條件下具有高效的葡萄糖分解能力，相對而言，克雷伯氏 菌的葡萄糖分解能力較慢，表現(xiàn)在發(fā)酵初期葡萄糖消耗較少，菌體生物量積累較慢，發(fā)酵周 期較長。因此通過乳酸菌的加入，利用其在厭氧條件下高效的EMP效率，加速葡萄糖的分 解，促進(jìn)克雷伯氏菌對中間代謝物的吸收利用，縮短了 2, 3- 丁二醇的發(fā)酵周期。
[0016] 3、乳酸菌不僅在微氧階段能夠進(jìn)行微氧代謝，形成高濃度的中間代謝物；并且在 轉(zhuǎn)入好氧階段后，能夠進(jìn)行好氧發(fā)酵，利用乙酰乳酸合成經(jīng)濟(jì)價值更高的雙乙酰，增加了發(fā) 酵生產(chǎn)的附加值。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的效果，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0018] 本發(fā)明實施例中，以Waters 2695分離系統(tǒng)與Waters 2414示差檢測器構(gòu)成液相 分析系統(tǒng)，其中分離柱選用Aminex HPX-87H有機(jī)酸和醇分析柱用于酸類和醇類的分離。以 葡萄糖、琥珀酸、乳酸、乙酸、2, 3- 丁二醇、乙醇標(biāo)準(zhǔn)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜，反應(yīng)過程中定時測 量反應(yīng)體系中葡萄糖的消耗情況、產(chǎn)物2, 3- 丁二醇的積累情況。
[0019] 本發(fā)明實施例中，所用的菌種為克雷伯桿菌來自 中國石化撫順石油化工研究院專利菌種，保藏編號CGMCC NO. 0798 ;干酪乳桿菌FY-04 (Lac casei )來自中國石化撫順石油化工研究院專利菌種，保藏編號CGMCC NO. 3269。上述菌株在中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC)保藏。
[0020] 本發(fā)明實施例中，種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如表1所示。
[0021] 表1培養(yǎng)某配方
【主權(quán)項】
1. 一種提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)2, 3- 丁二醇的方法，其特征在于包括以下步驟：（1)種子 液培養(yǎng)：以MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌的培養(yǎng)，獲得乳酸菌種子液；以LB培養(yǎng)基進(jìn)行克雷伯氏 菌的培養(yǎng)，獲得克雷伯氏菌種子液；（2)發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入兩種菌混合的發(fā)酵 種子液，在發(fā)酵初始階段以厭氧或微氧發(fā)酵為主，當(dāng)光密度〇D65(l大于5時增加通氣量，進(jìn)行 好氧發(fā)酵。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的乳酸菌為干酪乳桿菌，克雷伯氏菌 為肺炎克雷伯氏囷。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的乳酸菌種子液與克雷伯氏菌 種子液按照1:1?1:3的比例配成發(fā)酵種子液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的種子液的培養(yǎng)過程如下：將 菌種保藏液與種子培養(yǎng)基按體積1:1〇〇?1:500的比例混合于培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)溫度為 30°C?40°C，攪拌速度為lOOrpm?400rpm，pH控制在4?7之間，種子液培養(yǎng)過程中保持 微氧或厭氧條件。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微氧發(fā)酵時無空氣通入，依靠發(fā)酵 液中溶解氧維持微氧狀態(tài)；厭氧發(fā)酵時通入流速為〇. lvvm?0. 5vvm的氮?dú)?；好氧發(fā)酵時 通入流速為〇? 5vvm?lvvm的空氣。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述的發(fā)酵過程如下：培養(yǎng)基以葡萄 糖為底物，發(fā)酵種子液體積和培養(yǎng)基體積按1:9?1:20比例在生物反應(yīng)器內(nèi)混合，培養(yǎng)溫 度為30°C?40°C，攪拌速度為200rpm?500rpm，pH控制在5?7之間。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述的發(fā)酵初始葡萄糖底物濃度控制在 50g/L?100g/L ;發(fā)酵過程中，通過流加形式補(bǔ)充葡萄糖，使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在 20g/L?40g/L。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法，包括：（1）種子液培養(yǎng)：以MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌的培養(yǎng)，獲得乳酸菌種子液；以LB培養(yǎng)基進(jìn)行克雷伯氏菌的培養(yǎng)，獲得克雷伯氏菌種子液；（2）發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入兩種菌株混合的發(fā)酵種子液，在發(fā)酵初始階段以厭氧或微氧發(fā)酵為主，當(dāng)光密度OD650大于5時增加通氣量，進(jìn)行好氧發(fā)酵。本發(fā)明將克雷伯氏菌和乳酸菌進(jìn)行共發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇，一方面以乳酸菌優(yōu)化糖代謝，增加中間代謝產(chǎn)物的供給，提高2,3-丁二醇的發(fā)酵水平；另一方面，通過調(diào)控發(fā)酵過程中氧氣的供給量，調(diào)節(jié)兩種菌的代謝途徑，在提高2,3-丁二醇產(chǎn)量的同時，獲得經(jīng)濟(jì)效益更好的高濃度雙乙酰。
【IPC分類】C12P39-00, C12P7-18, C12R1-22, C12R1-245
【公開號】CN104611401
【申請?zhí)枴緾N201310537914
【發(fā)明人】張霖, 廖莎, 姚新武, 師文靜
【申請人】中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2013年11月5日