一種生產(chǎn)谷胱甘肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的生產(chǎn)谷胱甘肽的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽（Glutathione，GSH)是一種重要的調(diào)節(jié)生理功能的藥物，在臨床上的應(yīng) 用越來越廣，已成為醫(yī)學(xué)重要的具有調(diào)節(jié)人體免疫功能和輔助抗癌的藥物之一。GSH的抗氧 化性又使它在食品工業(yè)中的應(yīng)用備受人們關(guān)注，在食品貯藏保鮮和改善產(chǎn)品風(fēng)味、提高產(chǎn) 品營養(yǎng)價值方面的作用越來越被看好。谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸縮合 而成的一種含Y 2谷氨酰基和巰基的生物活性三肽類化合物，在蛋白質(zhì)和DNA的合成、氨基 酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的保護(hù)等重要的生物學(xué)現(xiàn)象中起著直接或間接作用。它主要分布于動物、植 物、微生物細(xì)胞中，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動保健、食品加工等很多領(lǐng)域。因此，GSH已 成為各國科學(xué)家研究和探索的熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外生產(chǎn)谷胱甘肽的方法主要有萃取法、化學(xué) 合成法、發(fā)酵法、酶法。由于發(fā)酵法生產(chǎn)GSH具有菌種易于培養(yǎng)、原料來源方便廉價、反應(yīng)步 驟簡單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)速率快等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方法。
[0003] 目前現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)存在一系列生產(chǎn)GSH的菌株，通常能在很廣的培養(yǎng)條件下生 長并積累GSH，但產(chǎn)量普遍很低。目前還有很多理論和技術(shù)上亟待攻克的課題，如高產(chǎn)菌株 的選育及培養(yǎng)條件的優(yōu)化等。因此，本領(lǐng)域亟需進(jìn)一步研究生物合成或生物結(jié)合化學(xué)法生 產(chǎn)谷胱甘肽的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的生產(chǎn)谷胱甘肽的方法。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，所述方法包括：
[0006] (1)在大腸桿菌細(xì)胞中過表達(dá)（外源的）谷胱甘肽雙功能酶（STH)以及乙酸激酶 (ack)，獲得重組表達(dá)細(xì)胞；和
[0007] (2)破碎（1)的細(xì)胞，將細(xì)胞破碎產(chǎn)物與L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸或其鹽 (如鈉鹽）、無機(jī)鹽和ATP混合反應(yīng)，生產(chǎn)谷胱甘肽。
[0008] 在一個優(yōu)選例中，步驟（1)中，還在大腸桿菌細(xì)胞中過表達(dá)（外源的）谷胱甘肽合 成酶。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)中，所述的谷胱甘肽雙功能酶編碼基因和乙酸激酶編 碼基因和/或谷胱甘肽合成酶編碼基因 gshB表達(dá)于同一大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；或表達(dá) 于不同的大腸桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)中。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，步驟⑴包括：
[0011] (a)提供一種重組大腸桿菌細(xì)胞，所述重組大腸桿菌細(xì)胞中包含以下基因的重組 表達(dá)盒：谷胱甘肽雙功能酶編碼基因和乙酸激酶編碼基因，以及選擇性含有谷胱甘肽合成 酶編碼基因 gshB ;或
[0012] 提供重組大腸桿菌細(xì)胞，包括：一種包含谷胱甘肽雙功能酶編碼基因的重組表達(dá) 盒的大腸桿菌細(xì)胞和一種包含乙酸激酶編碼基因的重組表達(dá)盒的大腸桿菌細(xì)胞和/或一 種包含谷胱甘肽合成酶編碼基因 gshB的重組表達(dá)盒的大腸桿菌細(xì)胞；和
[0013] (b)培養(yǎng)（a)的重組大腸桿菌細(xì)胞，從而過表達(dá)谷胱甘肽雙功能酶以及乙酸激酶。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的大腸桿菌是Rosetta(DE3)。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽雙功能酶是來源于嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)的谷胱甘肽雙功能酶（較佳地，其基因序列如NCBI登錄號：⑶138096. 1，或 其按照大腸桿菌密碼子偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列）；
[0016] 所述的乙酸激酶是來源于舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis)(較 佳地，其基因序列如NCBI登錄號：AB035799. 1，或其按照大腸桿菌密碼子偏愛性進(jìn)行密碼 子優(yōu)化后的序列）；或來源于大腸桿菌（Escherichia coli)(較佳地，其基因序列如NCBI登 錄號：CP001509,或其按照大腸桿菌密碼子偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列）的乙酸激酶。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)中，所述的無機(jī)鹽包括：鎂鹽，乙酰磷酸鹽。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，步驟⑵中，反應(yīng)體系包括：L-半胱氨酸：80±40mM ;甘氨 酸：120±40mM ;L-谷氨酸鈉：120±40mM ;七水氯化鎂：40±30mM ;乙酰磷酸二鋰鹽： 120±40mM ;ATP :1±0. 5mM ;細(xì)胞破碎產(chǎn)物：10 ?30%V/V。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞破碎產(chǎn)物指：步驟（1)的重組表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)物離心后， 用4倍體積磷酸緩沖液重懸后的破碎產(chǎn)物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)的溫度為30 ±5 °C ;較佳地30 ±2 °C。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)的pH為7. 0±0. 5 ;較佳地7. 0±0. 2。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)載體所述的重組表達(dá)載體包括以下基因 的重組表達(dá)盒：谷胱甘肽雙功能酶編碼基因和乙酸激酶編碼基因和/或谷胱甘肽合成酶編 碼基因 gshB。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的大腸桿菌細(xì)胞，所述的大腸桿菌細(xì)胞包括 所述的表達(dá)載體，或
[0024] 所述的大腸桿菌細(xì)胞的基因組中整合以下基因的重組表達(dá)盒：谷胱甘肽雙功能 酶（STH)編碼基因和乙酸激酶（ack)編碼基因，以及選擇性含有谷胱甘肽合成酶編碼基因 gshB ;較佳地，所述的大腸桿菌是Rosetta (DE3)。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組表達(dá)載體或所述的重組大腸桿菌細(xì)胞的用 途，用于轉(zhuǎn)化L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸為谷胱甘肽。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于生產(chǎn)谷胱甘肽的試劑盒，所述試劑盒中包括： 所述的重組表達(dá)載體或所述的重組的大腸桿菌細(xì)胞。
[0027] 在一個優(yōu)選例中，所述的用于生產(chǎn)谷胱甘肽的試劑盒，所述試劑盒中還包括： L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸或其鹽（如鈉鹽）、無機(jī)鹽和ATP ;較佳地，所述的無機(jī)鹽包 括：七水氯化鎂，乙酰磷酸二鋰鹽。
[0028] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0029] 圖1、重組質(zhì)粒pET24a_SAG的質(zhì)粒圖譜。
[0030] 圖2、重組質(zhì)粒pET24a_STH的質(zhì)粒圖譜。
[0031] 圖3、重組質(zhì)粒pET28b_gshA的質(zhì)粒圖譜。
[0032] 圖4、重組質(zhì)粒pET24a_gshB的質(zhì)粒圖譜。
[0033] 圖5、重組質(zhì)粒pTrc99a_STH的質(zhì)粒圖譜。
[0034] 圖6、重組質(zhì)粒pSUGAP的質(zhì)粒圖譜。
[0035] 圖7、重組質(zhì)粒pSUGAP-STH的質(zhì)粒圖譜。
[0036] 圖8、重組質(zhì)粒pET32amal的質(zhì)粒圖譜。
[0037] 圖9、重組質(zhì)粒pET32amal_STH的質(zhì)粒圖譜。
[0038] 圖10、重組質(zhì)粒pET24a_ack的質(zhì)粒圖譜。
[0039] 圖11、重組質(zhì)粒pET24a_ECack的質(zhì)粒圖譜。
[0040] 圖12、重組質(zhì)粒pMWK的質(zhì)粒圖譜。
[0041] 圖13、重組質(zhì)粒pET24a_gshB_ack的質(zhì)粒圖譜。
[0042] 圖14、重組質(zhì)粒pMWK-gshB-ack的質(zhì)粒圖譜。
[0043] 圖15、重組質(zhì)粒pTrc99a-gshB-ack_773的質(zhì)粒圖譜。
[0044] 圖16、重組質(zhì)粒pTrc99a-ECack_773的質(zhì)粒圖譜。
[0045] 圖 17、BL21 (DE3)/pET24a-SAG 和 BL21 (DE3)/pET24a-STH 的蛋白電泳。其中， 1-3 :BL21(DE3)/pET24a-SAG 的全細(xì)胞，上清和沉淀；10-12 :BL21(DE3)/pET24a-STH 的全細(xì) 胞，上清和沉淀；4-6 :Rosetta(DE3)/pTrc99a-STH/pMWK-gshB_ack 的全細(xì)胞，上清和沉淀； 7-9 :Rosetta(DE3)/pTrc99a-STH的全細(xì)胞，上清和沉淀；M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（KDa)。
[0046] 圖 18、BL21 (DE3)/pET24a-gshA 和 BL21 (DE3)/pET24a-gshB 的蛋白電泳。
[0047] I :BL21 (DE3) /pET28b-gshA 的沉淀；
[0048] 2 :BL21 (DE3) /pET28b-gshA 的上清；
[0049] 3 :BL21 (DE3) /pET24a_gshB 的沉淀；
[0050] 4 :BL21 (DE3) /pETMa-gshB 的上清。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 為了提高谷胱甘肽（Glutathione，GSH)產(chǎn)量，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，通過篩 選重組表達(dá)宿主以及選擇合適的酶進(jìn)行過表達(dá)，獲得了可高效轉(zhuǎn)化L-半胱氨酸、L-谷氨酸 和甘氨酸為谷胱甘肽的重組菌株，應(yīng)用所述菌株可有效地提高了 GSH的產(chǎn)量。本發(fā)明的方 法可提高谷胱甘肽產(chǎn)量50%以上。
[0052] 如本文所用，如本文所用，所述的"表達(dá)盒"是指包含有表達(dá)目的多肽（本發(fā)明中 為谷胱甘肽雙功能酶（STH)、乙酸激酶（ack)和/或谷胱甘肽合成酶gshB)所需的所有必要 元件的基因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括以下元件：啟動子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外 還可選擇性包括信號肽編碼序列等；這些元件是操作性相連的。
[0053] 因此，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括：STH、ack以及選擇性地包括 gshB的表達(dá)盒。所述的表達(dá)盒具備基因表達(dá)所需的所有元件（包括啟動子、編碼DNA以及 終止子等），從而可完整地表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。
[0054] 通常，所述的構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述 的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟 知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成 技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)