一種谷胱甘肽的抗干擾檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種谷胱甘肽的抗干擾檢測(cè)方法，目前，谷胱甘肽主要由生物法合成，因此產(chǎn)物中往往殘留半胱氨酸，其中巰基性質(zhì)接近導(dǎo)致對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)有干擾，亟需發(fā)明一種抗干擾檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明通過(guò)引進(jìn)干擾系數(shù)和補(bǔ)償系數(shù)來(lái)定量和補(bǔ)償干擾對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)結(jié)果的影響，修正檢測(cè)偏差，在不分離半胱氨酸的條件下，仍能排除半胱氨酸的干擾，檢測(cè)谷胱甘肽同時(shí)定量半胱氨酸。本發(fā)明填補(bǔ)了分光光度法檢測(cè)含干擾樣品中谷胱甘肽的技術(shù)空白，實(shí)現(xiàn)一種新的分光光度法的抗干擾檢測(cè)，有效簡(jiǎn)化谷胱甘肽檢測(cè)方法，是一種有應(yīng)用價(jià)值的抗干擾檢測(cè)方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種谷胱甘肽的抗干擾檢測(cè)方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種谷胱甘肽抗干擾檢測(cè)方法，可應(yīng)用在醫(yī)藥生產(chǎn)、科研檢測(cè)領(lǐng)域。
[0002]

【背景技術(shù)】
目前，谷胱甘肽(GSH)的生產(chǎn)主要依靠生物合成法，即半胱氨酸(Cys)、谷氨酸、甘氨酸三種氨基酸經(jīng)谷胱甘肽合成酶系催化而成，因此直接取樣分析的樣品往往同時(shí)存在半胱氨酸。GSH的檢測(cè)方法眾多，但對(duì)于同時(shí)含GSH、Cys的樣品，由于兩組分中巰基性質(zhì)接近，故檢測(cè)時(shí)除液相色譜法能通過(guò)毛細(xì)管柱分離而不干擾檢測(cè)外，大多數(shù)以巰基反應(yīng)為原理的方法會(huì)誤認(rèn)半胱氨酸為谷胱甘肽，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高，影響分析的準(zhǔn)確度。
[0003]紫外分光光度法在分析檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，技術(shù)成熟，相對(duì)操作簡(jiǎn)單、測(cè)定速度快、儀器價(jià)格便宜、樣品處理容易。朗伯-比爾定律原理在定量分析中常用來(lái)確定濃度與吸光度的線性關(guān)系。隨著紫外分光光度計(jì)儀器性能的提高，促進(jìn)了導(dǎo)數(shù)光譜法在檢測(cè)復(fù)雜成分中的應(yīng)用。目前導(dǎo)數(shù)光譜法利用干擾物質(zhì)在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收穩(wěn)定，即導(dǎo)數(shù)接近O來(lái)排除干擾，從而檢測(cè)導(dǎo)數(shù)較大的成分。該方法對(duì)于干擾物質(zhì)濃度變化對(duì)導(dǎo)數(shù)的影響考慮不全面，往往只能定性排除干擾，不能準(zhǔn)確定量干擾對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，且不能檢測(cè)干擾的含量。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

為了排除半胱氨酸對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)帶來(lái)的干擾，本發(fā)明運(yùn)用抗干擾補(bǔ)償，對(duì)檢測(cè)結(jié)果修正，該方法無(wú)需分離半胱氨酸，不僅準(zhǔn)確地檢測(cè)谷胱甘肽含量，而且能同時(shí)定量檢測(cè)半胱氨酸含量。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:以巰基與四氧嘧啶在堿性條件下生成的物質(zhì)在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)320nm波長(zhǎng)處有吸收為基礎(chǔ)，建立濃度_吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)干擾試驗(yàn)定量干擾對(duì)檢測(cè)的影響并補(bǔ)償，從而判斷未知樣品干擾情況并補(bǔ)償干擾帶來(lái)的谷胱甘肽檢測(cè)偏差，同時(shí)可定量檢測(cè)半胱氨酸的含量。
[0006]結(jié)合圖1與實(shí)施例的圖3、圖4和圖5，本發(fā)明所述檢測(cè)方法步驟如下:
1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制標(biāo)準(zhǔn)樣濃度為0.05、.25 mmol/L的GSH，各取I mL，分別加Λ I mL 0.05?0.50 mol/L 四氧嘧啶水溶液，2 mL 0.20?0.50 mol/L pH 為 10.(Tl0.8 的NaOH-Na2HPO4緩沖液，于超級(jí)恒溫槽中3(T60°C水浴10?20 min，水浴完成后降至室溫檢測(cè)。以水代替GSH添加四氧嘧啶、緩沖液后作空白樣，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣在320 nm處吸光度Abs320，制作GSH濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3);
2.干擾補(bǔ)償設(shè)計(jì):
(1)干擾試驗(yàn):配制不同濃度比例干擾的混合樣即GSH濃度0.05、.25 mmol/L, Cys濃度分別為GSH濃度的0-8倍，即干擾比例在1:0-1:8之間。在步驟I的條件下混合樣代替標(biāo)準(zhǔn)樣分別檢測(cè)其320 nm處吸光度Abs320和導(dǎo)數(shù)K320 ；
(2)引進(jìn)系數(shù):干擾的影響表現(xiàn)為吸光度與導(dǎo)數(shù)的變化，因此定義“干擾系數(shù)” a =K320/Abs320，表示對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾水平大小，制作干擾系數(shù)表(圖4)。若只用吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(圖3)可計(jì)算出干擾試驗(yàn)各個(gè)混合樣的回收率，表示干擾影響GSH檢測(cè)的結(jié)果，如102.7%表示偏高2.7%，因此定義該值為“補(bǔ)償系數(shù)”β，將結(jié)果除以β可修正檢測(cè)結(jié)果，制作補(bǔ)償系數(shù)表(圖5);
3.樣品檢測(cè)流程:參照?qǐng)D1，具體如下
(1)未知樣品按步驟I檢測(cè)，可得兩個(gè)數(shù)值，即吸光度Abs320和導(dǎo)數(shù)Κ320；
(2)計(jì)算干擾系數(shù)a=K320/Abs320,由Abs320與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(圖3)可計(jì)算得GSH中間濃度C1 ；
(3)α與C1R入干擾系數(shù)表，以數(shù)值接近為原則，確定干擾比例β ；β與C1R入補(bǔ)償系數(shù)表，確定補(bǔ)償系數(shù)Y ;
(4)計(jì)算GSH濃度Cgsh=C1/Y，Cys濃度CCys=CGSH/ β，至此流程結(jié)束。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:由于依據(jù)的是已知干擾試驗(yàn)的結(jié)果且有水浴控溫，因而重現(xiàn)性好，能定量干擾對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響且補(bǔ)償檢測(cè)結(jié)果，得以在不分離半胱氨酸的情況下，排除干擾，并同時(shí)檢測(cè)谷胱甘肽、半胱氨酸含量，達(dá)到抗干擾并快速檢測(cè)的目的。本發(fā)明填補(bǔ)了分光光度法檢測(cè)含干擾樣品中谷胱甘肽的技術(shù)空白，引進(jìn)干擾系數(shù)和補(bǔ)償系數(shù)以定量和補(bǔ)償不同濃度比例的干擾對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，實(shí)現(xiàn)一種新的分光光度法的抗干擾檢測(cè)，有效簡(jiǎn)化谷胱甘肽檢測(cè)方法，成本低，準(zhǔn)確度高，同時(shí)對(duì)于多組分混合樣的檢測(cè)有一定的借鑒意義。
[0008]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1是本發(fā)明的檢測(cè)流程圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)流程圖；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例的干擾系數(shù)表；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例的補(bǔ)償系數(shù)表；
圖1和圖2中特殊符號(hào)說(shuō)明:320nm處一階導(dǎo)數(shù)(K)，320nm處吸光度(Abs)，干擾系數(shù)(a)，GSH中間濃度(C1),干擾比例(β)，補(bǔ)償系數(shù)U)，谷胱甘肽濃度(Ccsh)，半胱氨酸濃度(Ccys)。
[0009]【具體實(shí)施方式】實(shí)施例操作步驟:
1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制標(biāo)準(zhǔn)樣濃度為0.05，0.10, 0.15，0.20, 0.25 mmol/L的GSH，各取 I mL，分別加入 I mL 0.10 mol/L 四氧嘧啶水溶液，2 mL 0.40 mol/L pH為 10.50±0.02的NaOH-Na2HPOJ^沖液，于超級(jí)恒溫槽中50°C水浴10 min，水浴完成后降至室溫檢測(cè)。以水代替GSH添加四氧嘧啶、緩沖液后作檢測(cè)空白樣，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣320nm處吸光度，制作GSH濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3);
2.干擾補(bǔ)償設(shè)計(jì):
(1)干擾試驗(yàn):配制不同濃度比例干擾的混合樣即GSH濃度0.05,0.10,0.15,0.20、
0.25 mmol/L，Cys濃度分別為GSH濃度的0.5-5倍，即干擾比例β在1: 0.5-1:5之間。在步驟I的條件下混合樣代替標(biāo)準(zhǔn)樣分別檢測(cè)其320 nm處吸光度Abs320和導(dǎo)數(shù)K320 ；
(2)引進(jìn)系數(shù):干擾的影響表現(xiàn)為吸光度與導(dǎo)數(shù)的變化，因此定義“干擾系數(shù)” a =K320/Abs320，表示對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾水平大小，制作干擾系數(shù)表(圖4)。若只用吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出干擾試驗(yàn)各個(gè)混合樣的回收率，表示干擾影響GSH檢測(cè)的結(jié)果，如102.7%表示偏高2.7%，因此定義該值為“補(bǔ)償系數(shù)” Y，將結(jié)果除以補(bǔ)償系數(shù)可修正檢測(cè)結(jié)果，制作補(bǔ)償系數(shù)表(圖5);
3.樣品檢測(cè)流程:參照?qǐng)D2，具體說(shuō)明如下
(1)未知樣品按步驟I檢測(cè)，可得兩個(gè)數(shù)值，即吸光度Abs320和導(dǎo)數(shù)K320；
(2)計(jì)算干擾系數(shù)a=K320/Abs320,由Abs320與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(圖3)可計(jì)算得GSH中間濃度C1 ；
(3)α與C1代入干擾系數(shù)表(圖4)，以數(shù)值接近為原則，確定干擾比例β，若干擾過(guò)大，則下結(jié)論此樣品干擾超過(guò)5倍，無(wú)法檢測(cè)，停止執(zhí)行流程；若在5倍以內(nèi)，β與(；代入補(bǔ)償系數(shù)表，確定補(bǔ)償系數(shù)Y ；
(4)計(jì)算GSH濃度Cgsh=C1/Y，Cys濃度CCys=CGSH/ β，至此流程結(jié)束。
【權(quán)利要求】
1.一種谷胱甘肽的抗干擾檢測(cè)方法，其特征是: A、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制標(biāo)準(zhǔn)樣濃度為0.05、.25 mmol/L的GSH，各取I mL，分別加入 I mL 0.05?0.50 mol/L 四氧嘧啶水溶液，2 mL 0.20?0.50 mol/L pH 為 10.(Tl0.8 的NaOH-Na2HPO4緩沖液，于超級(jí)恒溫槽中3(T60°C水浴10?20 min，水浴完成后降至室溫檢測(cè)；以水代替GSH添加四氧嘧啶、緩沖液后作空白樣，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣在320 nm處吸光度Abs320，制作GSH濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線； B、干擾補(bǔ)償設(shè)計(jì): (1)干擾試驗(yàn):配制不同濃度比例干擾的混合樣即GSH濃度0.05、.25 mmol/L, Cys濃度分別為GSH濃度的0-8倍，即干擾比例在1:0-1:8之間； 在步驟I的條件下混合樣代替標(biāo)準(zhǔn)樣分別檢測(cè)其320 nm處吸光度Abs320和導(dǎo)數(shù)K320 ； (2)引進(jìn)系數(shù):干擾的影響表現(xiàn)為吸光度與導(dǎo)數(shù)的變化，因此定義“干擾系數(shù)” a =K320/Abs320，表示對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾水平大小，制作干擾系數(shù)表；若只用吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出干擾試驗(yàn)各個(gè)混合樣的回收率，表示干擾影響GSH檢測(cè)的結(jié)果，如.102.7%表示偏高2.7%，因此定義該值為“補(bǔ)償系數(shù)” β，將結(jié)果除以β可修正檢測(cè)結(jié)果，制作補(bǔ)償系數(shù)表； C、樣品檢測(cè)流程如下 (1)未知樣品按步驟I檢測(cè)，可得兩個(gè)數(shù)值，即吸光度Abs320和導(dǎo)數(shù)K320； (2)計(jì)算干擾系數(shù)a=K320/Abs320,由Abs320與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算得GSH中間濃度C1; (3)α與C1R入干擾系數(shù)表，以數(shù)值接近為原則，確定干擾比例β ；β與C1R入補(bǔ)償系數(shù)表，確定補(bǔ)償系數(shù)Y ; (4)計(jì)算GSH濃度Cgsh=C1/Y，Cys濃度CCys=CGSH/ β，至此流程結(jié)束。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK104181119SQ201410378788
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】段學(xué)輝, 鄭希帆 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)