mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0055] 此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細胞的表型性狀，如安普霉素（apr)抗性、Amp抗性。
[0056] 包含上述的適當多核苷酸序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn) 化適當?shù)乃拗鳌?br>[0057] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行，例如氯化鈣 法，電轉(zhuǎn)化法。
[0058] 本發(fā)明用于重組表達的細胞是大腸桿菌；較佳地是Rosetta(DE3)。本發(fā)明人出 乎意料地發(fā)現(xiàn)，過表達谷胱甘肽雙功能酶（STH)、乙酸激酶（ack)和/或谷胱甘肽合成酶的 Rosetta (DE3)菌株，在裂解后用于生產(chǎn)GSH，可以顯著的提高GSH的產(chǎn)量。
[0059] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，所述方法包括：（1)在大腸桿菌細胞 中過表達（外源的）谷胱甘肽雙功能酶（STH)以及乙酸激酶（ack)，獲得重組表達細胞；和 (2)破碎（1)的細胞，將細胞破碎產(chǎn)物與L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸或其鹽（如鈉鹽）、 無機鹽和ATP混合反應(yīng)，生產(chǎn)谷胱甘肽。
[0060] 在本發(fā)明人的前期研究中，利用大腸桿菌表達了多種可能對于谷胱甘肽的生產(chǎn)有 利的酶，最終發(fā)現(xiàn)過表達谷胱甘肽雙功能酶（STH)以及乙酸激酶（ack)的菌體裂解液有利 于廣量的提商。
[0061] 此外，在前期研究中，本發(fā)明人也嘗試了應(yīng)用多種大腸桿菌（如JM109、 Origami (DE3)、DH5 a、BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)等）進行重組表達，最終發(fā)現(xiàn)應(yīng)用 Rosetta(DE3)來進行重組表達能夠產(chǎn)生出乎意料的技術(shù)效果。
[0062] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的谷胱甘肽雙功能酶來源于嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus);所述的乙酸激酶來源于舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis);或來源于大腸桿菌（Escherichia coli)。應(yīng)理解，保留天然來源的蛋 白基本相同的功能的蛋白變體、生物活性片段也包含在本發(fā)明中。
[0063] 本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)谷胱甘肽的試劑盒，所述試劑盒中包括：用于表達STH和 ack以及選擇性表達gshB的所述的重組表達載體；或所述試劑盒中包括可過表達STH和 ack以及選擇性表達gshB的大腸桿菌細胞或細胞裂解產(chǎn)物。所述的重組表達載體或細胞或 細胞裂解產(chǎn)物被置于適當?shù)娜萜髦小?br>[0064] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還包括用于后續(xù)化學(xué)反應(yīng)生產(chǎn)谷胱甘肽 的其它化學(xué)成分，包括但不限于：L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸或其鹽（如鈉鹽）、無機鹽 和ATP ;較佳地，所述的無機鹽包括：七水氯化鎂，乙酰磷酸二鋰鹽。
[0065] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還包括使用說明書，說明各種化學(xué)試劑 或表達載體或細胞或細胞裂解產(chǎn)物的濃度、用法用量。
[0066] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0067] 菌種構(gòu)建
[0068] 主要試劑：限制性內(nèi)切酶和Taq DNA聚合酶（fermentas), T4DNA連接酶、Klenow 片段、堿性磷酸酶CIAP和蛋白質(zhì)分子量標準（TAKARA)，K0D neo plusDNA聚合酶（Τ0Υ0Β0)， 質(zhì)粒抽提試劑盒和小量膠回收試劑盒（Axygen)，抗生素（上海生工）。引物合成、全基因合 成及亞克隆全部委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
[0069] 實施例1、產(chǎn)谷胱甘肽（GSH)的單酶表達菌種的構(gòu)建
[0070] I、pET24a_SAG 的構(gòu)建
[0071] 根據(jù)已報道的Streptococcus agalactiae來源谷胱甘肽雙功能酶SAG的基因序 列（NCBI登錄號：AE009948. 1)，全基因合成該序列，兩端設(shè)計酶切位點NdeI和HindIII，亞 克隆到載體pET24a (購自Novagen)上相應(yīng)位點，獲得重組質(zhì)粒pET24a-SAG，質(zhì)粒圖譜見圖 1〇
[0072] 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET24a_SAG用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21 (DE3)， 得到 BL21 (DE3)/pET24a-SAG。
[0073] 2、pET24a_STH的構(gòu)建及表達
[0074] 根據(jù)已報道Streptococcus thermophilus strain SIIM B218來源谷胱甘膚雙功 能酶STH的基因序列（NCBI登錄號：GU138096. 1)，全基因合成該序列，兩端設(shè)計酶切位點 EcoRI和XhoI，亞克隆到載體pET24a上相應(yīng)位點，獲得重組質(zhì)粒pET24a-STH，質(zhì)粒圖譜見圖 2〇
[0075] 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET24a_STH用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21 (DE3) 和 Rosetta (DE3)得到 BL21 (DE3)/pET24a-STH 和 Rosetta (DE3)/pET24a-STH。
[0076] 3、pET28b_gshA 的構(gòu)建
[0077] 根據(jù)已報道的Escherichia coli BL21 (DE3)來源谷氨酸-半胱氨酸連接酶基因 gshA 的基因序列（NCBI 登錄號：ΑΜ946981· 2)，設(shè)計引物如下：gshA-NcoI-F :CATGCCATGGGA ATCCCGGACGTATCACAGGC(SEQ ID NO: I), gshA-BamHI-R ：CGGGATCCTCAGGCGTGTTTTTCCAGCC(S EQ ID NO: 2)，以BL21 (DE3)基因組DNA為模板擴增gshA片段。PCR反應(yīng)體系包括：引物各 0.3以1\1，模板2001^，1父1(00 116〇卩1118 1311打61'，0.21111(11'〇1:>，1.51111]\%304，1(00 116〇卩1118111， 補 CldH2O 至總體系 50μ L。PCR擴增條件為：94°C 2min，98°C 10s，55°C 30s，68°C 45s，重復(fù) 30 個循環(huán)，68°C lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，檢測到一條大約1.5kb 左右的特異條帶，用膠回收試劑盒回收，NcoI和BamHI于37°C雙酶切3-6小時，酶切體系包 括：PCR 產(chǎn)物 42 μ L，IOXTango buffer5 μ L，NcoIL 5 μ L，BamHIL 5 μ L。膠回收試劑盒過 柱純化回收?；厥债a(chǎn)物與同樣酶切處理的表達載體pET28b (購自Novagen)用T4DNA連接 酶于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒pET28b-gshA，質(zhì)粒圖譜 見圖 3,提取后轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)得到 BL21 (DE3)/pET28b-gshA。
[0078] 4、pET24a_gshB 的構(gòu)建
[0079] 根據(jù)已報道的Escherichia coli BL21(DE3)來源谷胱甘肽合成酶基因 gshB的基 因序列（NCBI 登錄號：AM94698L 2)，設(shè)計引物如下：gshB-NdeI-F :GGAATTCCATATGatcaagct cggcatcgt(SEQ ID NO:3), gshB-BamHI-R ：CGGGATCCttactgctgctgtaaacgtg(SEQ ID NO:4), 以BL21 (DE3)基因組DNA為模板擴增gshB片段。PCR反應(yīng)體系包括：引物各0. 3 μ M，模板 200ng，IXKODneo plus buffer，?！?2mM dNTP，I. 5mM MgSO4, KOD neo pluslU，補 ddH20 至 總體系 50yL。PCR 擴增條件為：94°C 2min，98°C 10s，55°C 30s，68°C 30s，重復(fù) 30 個循環(huán)， 68°C lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，檢測到一條大約Ikb左右的特異 條帶，用膠回收試劑盒回收，NdeI和BamHI于37°C雙酶切3-6小時，酶切體系包括：PCR產(chǎn)物 37 μ L，IOXTango bufferlO μ L，NdeIL 5 μ L，BamHIL 5 μ L。膠回收試劑盒過柱純化回收。 回收產(chǎn)物與同樣酶切處理的表達載體pET24a用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒pET24a-gshB，質(zhì)粒圖譜見圖4,提取后轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)得 到 BL21(DE3)/pET24a-gshB。
[0080] 5、上述菌種的蛋白電泳
[0081] 將構(gòu)建好的菌種分別接種到含100 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C 220rpm培養(yǎng)過夜后，按1%(ν/ν)接種量接種到新鮮TB培養(yǎng)基中（含100 μ g/mL卡那 霉素），37°C 220rpm培養(yǎng)至0D600=5-6,加入終濃度為0· 2mMIPTG，28°C誘導(dǎo)過夜。
[0082] 取誘導(dǎo)后的菌液IOml收集菌體后用20ml0,1M PBS緩沖液（pH7. 0)重懸，超聲破 碎，分別設(shè)置全細胞液（Iml破胞液）、上清液（Iml破胞液離心后取上清）、沉淀液（Iml破 胞液離心后棄上清，加入Iml緩沖液重懸沉淀）三份樣品，將電泳樣品各20μ 1與5μ 15X 樣品緩沖液混合煮沸5分鐘，離心后取上清10 μ L進行SDS-PAGE分析。采用5%濃縮膠和 12%分離膠，電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍R250染色。結(jié)果如圖17-18。
[0083] 6、pTrc99a_STH 的構(gòu)建及表達
[0084] 重組質(zhì)粒pET24a-STH用EcoRI和XhoI于37°C雙酶切3-6小時，酶切體系包括： 質(zhì)粒 37 μ L，10 X Tango buffer 10 μ L，EcoRI 1.5 μ L，XhoI 1.5 μ L。凝膠電泳膠回收試劑盒 回收2. 2kb STH片段。