專利名稱：造血細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種造血細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種通過攪拌式生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)造血細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
造血細(xì)胞包括各類血液細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，在體內(nèi)造血系統(tǒng)的發(fā)育中，所有的造血細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化而來。造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)是在模擬體內(nèi)造血系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育的基礎(chǔ)上，添加造血細(xì)胞因子和各類營(yíng)養(yǎng)成分，控制培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)條件，從而實(shí)現(xiàn)造血細(xì)胞的增殖和發(fā)育，生產(chǎn)可用于醫(yī)療的造血干/祖細(xì)胞或各類成熟造血細(xì)胞的技術(shù)。
在造血細(xì)胞培養(yǎng)中，為了能及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境，人們開發(fā)出了灌注反應(yīng)器。早期的連續(xù)灌注反應(yīng)器培養(yǎng)比換液培養(yǎng)提高了骨髓細(xì)胞的擴(kuò)增量，而且它能獲得LTC-IC的擴(kuò)增。連續(xù)灌注培養(yǎng)更能使培養(yǎng)物中的葡萄糖和IL-3保持在高濃度而使乳酸保持低濃度。根據(jù)Palsson BO，Paek SH，Schwartz RM，et.al，Expansion of human bone marrow progenitorcells in a high cell density continuous perfusion system[J].Biotechnology.1993，11(3)368-72.文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Palsson等成功的利用灌注系統(tǒng)擴(kuò)增了人骨髓CFU-GM和BFU-E。
根據(jù)Sandstrom CE，Bender JG，Papoutsakis ET，Miller WM.Effects ofCD34+cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral bloodmononuclear cells.Blood.1995，86(3)958-70.文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Sandstrom CE等人通過改進(jìn)平板床培養(yǎng)腔，開發(fā)了無基質(zhì)細(xì)胞的灌注式培養(yǎng)體系，成功地將CFU-GM擴(kuò)增了17～19倍。這種培養(yǎng)腔包括多個(gè)微槽(與培養(yǎng)基流動(dòng)的方向垂直)，它能提供均一的環(huán)境，允許營(yíng)養(yǎng)物的擴(kuò)散，但把細(xì)胞保留在腔體中。另外，這種培養(yǎng)系統(tǒng)能支持基質(zhì)層細(xì)胞的形成。但這種系統(tǒng)由于幾何形狀的原因，放大比較困難，而且，它并沒有完全消除濃度梯度的問題，細(xì)胞收獲操作復(fù)雜。
根據(jù)Koller MR，Manchel I，Maher RJ，Goltry KL，Armstrong RD，SmithAK.Clinical-scale human umbilical cord blood cell expansion in a novelautomated perfusion culture system.Bone Marrow Transplant.1998，21(7)653-63.文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Koller等成功的設(shè)計(jì)了一個(gè)全新的自動(dòng)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)，并達(dá)到了臨床規(guī)模。利用小規(guī)模的培養(yǎng)，該系統(tǒng)培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞，比靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞總數(shù)提高了93％，CFU-GM提高了82％，LTC-IC提高了350％。
以上發(fā)明均為靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，其存在著培養(yǎng)環(huán)境不均一的問題，培養(yǎng)基中pH、溶氧、代謝物存在濃度梯度，而且，此濃度梯度還會(huì)由于初始條件如接種濃度、造血細(xì)胞類型的分布、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)樣品的擴(kuò)增程度不同而在各批培養(yǎng)之間造成很大的差異。另外，靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)如孔板和方瓶是不可能進(jìn)行在線監(jiān)控，采集數(shù)據(jù)需要很煩瑣的操作。最后，靜態(tài)系統(tǒng)還受它能提供的表面積的限制而不能培養(yǎng)大量的細(xì)胞，這在放大時(shí)將造成很大的困難。因此，靜態(tài)培養(yǎng)的缺點(diǎn)在于培養(yǎng)效率不高、重復(fù)性差、難以放大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種造血細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟將懸浮于培養(yǎng)基中的造血單個(gè)核細(xì)胞接種至攪拌式反應(yīng)器中培養(yǎng)；然后將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于反應(yīng)器，流出反應(yīng)器的培養(yǎng)液在沉降截留裝置中截留分離，截留分離的活細(xì)胞返回反應(yīng)器。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方法，包括如下步驟(1)將懸浮于培養(yǎng)基中的造血單個(gè)核細(xì)胞以1×106cells/mL的密度接種至反應(yīng)器中，反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為10～50r/min，溫度控制為37℃，pH為7.0～7.2，溶氧為15～30％(空氣飽和度)，培養(yǎng)2～6天，優(yōu)選4天；(2)將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于反應(yīng)器，在起始灌注培養(yǎng)的4天中，灌注速率為D/V＝1/5～1/3，流出反應(yīng)器的培養(yǎng)液在沉降截留裝置中截留分離，截留分離的活細(xì)胞返回反應(yīng)器，第5天開始，調(diào)整灌注速率為D/V＝1/3～1/1，再培養(yǎng)7～14天。
其中D/V指的是每天灌注入反應(yīng)器的培養(yǎng)基體積與反應(yīng)器的工作體積之比。
所說的沉降截留裝置可采用常規(guī)的沉降截留裝置，優(yōu)選采用中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00310109264.2的造血細(xì)胞連續(xù)灌注懸浮培養(yǎng)過程細(xì)胞沉降截留裝置；所說的造血單個(gè)核細(xì)胞來源于骨髓、動(dòng)員的外周血和臍血；所說的造血單個(gè)核細(xì)胞包括單個(gè)核細(xì)胞和純化的CD34+細(xì)胞。
所說的培養(yǎng)基可采用常規(guī)的培養(yǎng)基，如IMDM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基，并添加重量百分比為10％～30％的胎牛血清(FBS)，以及細(xì)胞因子組合SCF 20ng/mL～100ng/mL，IL-620ng/mL～50ng/mL，IL-3 1ng/mL～3ng/mL，F(xiàn)L 20ng/mL～100ng/mL，TPO 20ng/mL～100ng/mL。
造血細(xì)胞的攪拌懸浮培養(yǎng)中，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果有重要影響的參數(shù)為pH、溶氧水平和攪拌轉(zhuǎn)速。
pH對(duì)造血細(xì)胞分化和發(fā)育有著重要的影響，必須控制在合適的范圍內(nèi)。造血細(xì)胞對(duì)于剪切力非常敏感，因此，攪拌培養(yǎng)中攪拌轉(zhuǎn)速不能過高，否則過大的剪切力會(huì)使細(xì)胞受到損傷，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速不可過低，否則細(xì)胞不能有效懸浮，沉在反應(yīng)器底部，則不能實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。
細(xì)胞因子對(duì)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增結(jié)果有著非常重要的影響。在造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增中，要求所采用的細(xì)胞因子能促進(jìn)干細(xì)胞高效地增殖，但同時(shí)不可促進(jìn)干細(xì)胞的分化，使培養(yǎng)得到的干細(xì)胞具有高增殖潛能和體內(nèi)重建造血的能力。另外，在體外培養(yǎng)過程中，祖細(xì)胞(如CFU-GM)和成熟細(xì)胞的產(chǎn)生是不可避免的，祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞的劑量也是保證移植成功的關(guān)鍵因素，CFU-GM和CFU-Mk以及成熟的粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞的含量對(duì)移植中的成功有著重要影響，因此，所用的細(xì)胞因子要在避免刺激干細(xì)胞分化的同時(shí)能產(chǎn)生大量的CFU-GM、CFU-Mk和成熟的粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)的初期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，處于延遲期，此時(shí)不需進(jìn)行灌注，培養(yǎng)到第4～6天時(shí)，細(xì)胞開始生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞因子消耗開始增多，但此時(shí)細(xì)胞量較少，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物需求較少，產(chǎn)生的代謝物也較少，因此，灌注速率宜控制在較小的范圍內(nèi)，灌注速率以D/V＝1/5～1/3為適宜，細(xì)胞灌注培養(yǎng)到第7-9天時(shí)，細(xì)胞密度增加較快，而且其代謝旺盛，需要增加灌注速率以及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物和移出代謝物，此時(shí)，灌注速率以D/V＝1/3～1為適宜。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，攪拌培養(yǎng)中，溶氧水平控制在15～30％(空氣飽和度)時(shí)，細(xì)胞的擴(kuò)增較高，干細(xì)胞特性的維持較好。pH控制在7.00～7.20，最有利于細(xì)胞的擴(kuò)增。而攪拌轉(zhuǎn)速控制在10～50轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)，細(xì)胞能有效懸浮而且不至于造成強(qiáng)烈的剪切。
本發(fā)明采用灌注培養(yǎng)技術(shù)，能及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，并及時(shí)移出培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝廢物，培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)恒定，而減少了補(bǔ)料培養(yǎng)過程中培養(yǎng)環(huán)境的波動(dòng)。灌注培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)，這就可以避免補(bǔ)料培養(yǎng)中存在的細(xì)胞培養(yǎng)到后期補(bǔ)料體積大大超過培養(yǎng)的初始體積，甚至出現(xiàn)反應(yīng)器工作體積不能滿足細(xì)胞培養(yǎng)所需體積的情況。灌注培養(yǎng)中，細(xì)胞密度可達(dá)到107cells/mL，對(duì)于1L體積的反應(yīng)器，可獲得1010個(gè)細(xì)胞，這個(gè)數(shù)量能確保造血細(xì)胞的臨床應(yīng)用。利用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，消除了靜態(tài)培養(yǎng)中濃度梯度引起的問題，其培養(yǎng)環(huán)境均一，有利于檢測(cè)和實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)控，而且有利于建立標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)工藝。由于采取了灌注培養(yǎng)，反應(yīng)器中總細(xì)胞、CFU-GM、和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)都顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)，其中反應(yīng)器中總細(xì)胞擴(kuò)增56倍，CFU-GM擴(kuò)增41倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增19倍。


圖1為工藝流程圖。
圖2為總細(xì)胞擴(kuò)增效果。
圖3為CFU-GM細(xì)胞擴(kuò)增效果。
圖4為CD34+細(xì)胞擴(kuò)增效果。
具體實(shí)施例方式
參見圖1，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將懸浮于培養(yǎng)基中的造血單個(gè)核細(xì)胞接種至攪拌反應(yīng)器1中培養(yǎng)；(2)將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于反應(yīng)器1，流出反應(yīng)器1的培養(yǎng)液在沉降截留裝置2中截留分離，截留分離的活細(xì)胞返回反應(yīng)器1。
實(shí)施例1臍血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)梯度離心后，收集單個(gè)核細(xì)胞，并以IMDM培養(yǎng)基洗滌兩次。體外培養(yǎng)基本培養(yǎng)基用IMDM，使用時(shí)添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF(50ng/mL)、IL-3(2ng/mL)、IL-6(20ng/mL)、FL(50ng/mL)和TPO(20ng/mL)，用上述培養(yǎng)基懸浮臍血單個(gè)核細(xì)胞，以1×106cells/mL接種至反應(yīng)器中。反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為30r/min，溫度控制為37℃，pH控制在7.1，溶氧為22％(空氣飽和度)。
培養(yǎng)到第4天，開始進(jìn)行灌注培養(yǎng)，灌注所用培養(yǎng)基與接種時(shí)培養(yǎng)基相同，7天時(shí)，灌注速率為D/V＝1/5，細(xì)胞培養(yǎng)到第7天以后，調(diào)整灌注速率為D/V＝1/3。
以方瓶靜態(tài)培養(yǎng)做靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)照，其中方瓶置于37℃，5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，方瓶靜態(tài)培養(yǎng)到第4天開始，每2天換液50％。
由圖2，3和4可見，由于采取了灌注培養(yǎng)，反應(yīng)器中總細(xì)胞、CFU-GM、和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)都顯著高于方瓶，其中反應(yīng)器中總細(xì)胞擴(kuò)增56倍，CFU-GM擴(kuò)增41倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增19倍。
權(quán)利要求
1.一種造血細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)方法，其特征在于，將懸浮于培養(yǎng)基中的造血單個(gè)核細(xì)胞接種至攪拌式反應(yīng)器中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于反應(yīng)器，流出反應(yīng)器的培養(yǎng)液在沉降截留裝置中截留分離，截留分離的活細(xì)胞返回反應(yīng)器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將懸浮于培養(yǎng)基中的造血單個(gè)核細(xì)胞接種至反應(yīng)器中，反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為10～50r/min，溫度控制為37℃，pH為7.0～7.2，溶氧為15～30％，空氣飽和度，培養(yǎng)2～6天；(2)將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于反應(yīng)器，在起始灌注的4天中，灌注速率為D/V＝1/5～1/3，流出反應(yīng)器的培養(yǎng)液在沉降截留裝置中截留分離，截留分離的活細(xì)胞返回反應(yīng)器，第5天開始，調(diào)整灌注速率為D/V＝1/3～1/1，再培養(yǎng)7～14天；其中D/V指的是每天灌注入反應(yīng)器的培養(yǎng)基體積與反應(yīng)器的工作體積之比。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于將懸浮于培養(yǎng)基中的造血單個(gè)核細(xì)胞以1×106cells/mL的密度接種至反應(yīng)器中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的造血單個(gè)核細(xì)胞來源于骨髓、動(dòng)員的外周血和臍血。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的造血單個(gè)核細(xì)胞包括單個(gè)核細(xì)胞和純化的CD34+細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的培養(yǎng)基為常規(guī)的IMDM培養(yǎng)基，并添加重量百分比為10％～30％的胎牛血清(FBS)，以及細(xì)胞因子組合SCF20ng/mL～100ng/mL，IL-6 20ng/mL～50ng/mL，IL-31ng/mL～3ng/mL，F(xiàn)L20ng/mL～100ng/mL，TPO20ng/mL～100ng/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于沉降截留裝置為重力沉降截留裝置。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種造血細(xì)胞在攪拌式生物反應(yīng)器中的灌注培養(yǎng)方法，包括如下步驟將分離得到的造血細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中并接種至攪拌式反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)；然后將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于反應(yīng)器，流出反應(yīng)器的培養(yǎng)液在沉降截留裝置中截留分離，截留分離的活細(xì)胞返回反應(yīng)器。由于采取了灌注培養(yǎng)，反應(yīng)器中總細(xì)胞、CFU－GM、和CD3文檔編號(hào)C12N5/02GK1556198SQ200410015668
公開日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2004年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月5日
發(fā)明者譚文松, 遲占有, 蔡海波 申請(qǐng)人:上海伯瑞生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 華東理工大學(xué)