專(zhuān)利名稱(chēng)：環(huán)二肽類(lèi)化合物的生物制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已知環(huán)二肽類(lèi)化合物的生物制備方法及用途。
背景技術(shù)：
環(huán)二肽類(lèi)化合物在人、動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)不同的環(huán)二肽，其生物功能差異顯著，具體包括有抑制雜草、調(diào)節(jié)鈣離子通道、抗菌、專(zhuān)一催化立體構(gòu)型和作為細(xì)菌生理調(diào)控的信號(hào)分子等生物活性。因此，環(huán)二肽類(lèi)化合物在藥物、抗生素和農(nóng)用生物除草劑的研制等方面具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。
國(guó)內(nèi)有幾家科研院所在進(jìn)行環(huán)二肽類(lèi)化合物的研究開(kāi)發(fā)，中山大學(xué)周世寧等從南海紅樹(shù)林真菌和海洋細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純到環(huán)二肽化合物；中國(guó)科學(xué)院昆明植物化學(xué)開(kāi)放研究實(shí)驗(yàn)室汪有初等從北五味子果實(shí)中分離得到3個(gè)環(huán)二肽即環(huán)(亮-脯)、環(huán)(苯丙-異亮)和環(huán)(苯丙-亮)；蚌埠醫(yī)學(xué)院陶林等用化學(xué)方法合成環(huán)L-苯丙-L-脯；中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室熊江等從多蕊商陸根的乙醇提取物中分離到環(huán)二肽類(lèi)化合物。
國(guó)外對(duì)環(huán)二肽類(lèi)化合物的研究比較活躍，主要集中在對(duì)生物活性的探討上，Yasuo kimura等從penicillium sp.中分離得到環(huán)(L-色-L-苯丙)，研究表明其在100ml/l下能強(qiáng)烈抑制水芹種子萌發(fā)，促進(jìn)萵苣根的生長(zhǎng)；Milne，P.J.等研究了4個(gè)環(huán)二肽化合物環(huán)(L-苯丙-L-脯)、環(huán)(L-酪-L-脯)、環(huán)(L-色-L-脯)和環(huán)(L-色-L-色)，結(jié)果表明這4個(gè)環(huán)二肽化合物均具有潛在的抗肌肉緊張、抗瘤和抗生素活性；Holden，Matthew T.G.等從假單胞菌發(fā)酵液中分離得到2個(gè)環(huán)二肽化合物環(huán)(D-丙-L-纈)、環(huán)(L-酪-L-脯)，研究表明對(duì)生物發(fā)光起信號(hào)調(diào)節(jié)作用。
從上世紀(jì)90年代開(kāi)始，對(duì)環(huán)二肽類(lèi)化合物研究開(kāi)始轉(zhuǎn)向細(xì)菌，但是從野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種發(fā)酵液中提取分離純化得到環(huán)二肽類(lèi)化合物在國(guó)內(nèi)外尚屬首次；而且從該發(fā)酵液中提取環(huán)二肽類(lèi)化合物方法簡(jiǎn)便可行，較化學(xué)合成成本低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于以微生物學(xué)原理為基礎(chǔ)，以從根際土壤或植物組織上分離得的野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種為菌種，經(jīng)發(fā)酵、分離、提純，得到環(huán)二肽類(lèi)化合物；進(jìn)一步的生物活性試驗(yàn)表明該類(lèi)化合物對(duì)部分雜草及水稻有較強(qiáng)抑制作用。因此，本發(fā)明的著眼點(diǎn)在于以新篩選的植物致病細(xì)菌為菌種用生物的方法制備具有廣泛生物活性的環(huán)二肽類(lèi)化合物及其在雜草防除中的應(yīng)用。
本發(fā)明的環(huán)二肽類(lèi)化合物(式1)的生物制備方法，cyclo-(-A1-A2-)(式1)其中，A1為Pro、Phe、Leu、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；A2為T(mén)ry、Phe、Ile、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；其特征是包括以下步驟1)以保藏編號(hào)為CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonas campestris pv.retroflexus)為菌種，在常規(guī)固體培養(yǎng)基中對(duì)該菌種進(jìn)行斜面培養(yǎng)，復(fù)壯，25-30℃培養(yǎng)9-24h；然后進(jìn)行種子培養(yǎng)，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水補(bǔ)足體積；調(diào)初始PH6.0-7.4，在121-125℃下滅菌20-30min，冷卻后以1％的接種量接種，25-30℃培養(yǎng)12-32h。
2)發(fā)酵罐中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方同上述種子液體培養(yǎng)基的配方，以6-12％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶0.6-1.5，25-30℃培養(yǎng)54-120h，得發(fā)酵液；3)發(fā)酵液離心得上清液減壓濃縮，用丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調(diào)至3-7，用等體積的乙酸乙酯提取數(shù)次，然后合并乙酸乙酯提取液，將其減壓蒸餾濃縮至干，用1-5毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從10∶1到4∶6梯度洗脫；再將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離，薄層層析法分析后將性質(zhì)相同的組分合并，制得環(huán)二肽類(lèi)化合物。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.用生物的方法從菌發(fā)酵液中分離提純到環(huán)二肽類(lèi)化合物，相對(duì)于化學(xué)合成，其方法簡(jiǎn)便可行，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染；2.用生物的方法從菌發(fā)酵液中分離提純到環(huán)二肽類(lèi)化合物，相對(duì)于化學(xué)合成，其周期短(一般為5-7天一個(gè)循環(huán))；所用原料廉價(jià)，易于形成大規(guī)模批量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低；
3.用高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)為菌種發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)二肽類(lèi)化合物，部分環(huán)二肽產(chǎn)率較高；該環(huán)二肽類(lèi)化合物表現(xiàn)有較強(qiáng)的生物活性，可用于開(kāi)發(fā)成為生物除草劑。


圖1是環(huán)二肽類(lèi)化合物的生物制備工藝流程圖；圖2是環(huán)(-脯-苯丙-)對(duì)植物根的生物抑制活性測(cè)定圖；圖3是環(huán)(-脯-苯丙-)對(duì)植物莖的生物抑制活性測(cè)定圖；圖4是環(huán)(-異亮-苯丙-)對(duì)植物根的生物抑制活性測(cè)定圖；圖5是環(huán)(-異亮-苯丙-)對(duì)植物莖的生物抑制活性測(cè)定圖；圖6是環(huán)(-色-苯丙-)對(duì)植物根的生物抑制活性測(cè)定圖；圖7是環(huán)(-色-苯丙-)對(duì)植物莖的生物抑制活性測(cè)定圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1環(huán)二肽類(lèi)化合物的生物制備1)將高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)菌種，在常規(guī)固體培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，復(fù)壯，25℃培養(yǎng)24h；然后進(jìn)行種子培養(yǎng)，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量/體積比)牛肉膏2.2％，蛋白胨0.4％，葡萄糖0.2％，NH4H2PO40.5％，NaCl2.0％，以水補(bǔ)足體積；調(diào)初始PH值為6.0，在121℃下滅菌20min，冷卻后以1％的接種量接種，25℃培養(yǎng)32h。
2)發(fā)酵罐中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方同上述種子液體培養(yǎng)基的配方，以10％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶1.5，27℃培養(yǎng)120h，得發(fā)酵液；3)發(fā)酵液離心得上清液，減壓濃縮，丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調(diào)至7，用等體積的乙酸乙酯提取三次，最后減壓蒸餾濃縮至干，用4毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從10∶2到4∶6梯度洗脫；再按常規(guī)方法將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離純化，薄層層析法分析后將性質(zhì)相同的組分合并，得8個(gè)組分，經(jīng)氣、液色譜，質(zhì)譜，核磁共振分析證實(shí)為環(huán)(-脯-苯丙-)、環(huán)(-異亮-苯丙-)、環(huán)(-色-苯丙-)、環(huán)(-脯-色-)、環(huán)(-脯-亮-)、環(huán)(-苯丙-苯丙-)、環(huán)(-脯-酪-)、環(huán)(-色-色)，其中環(huán)(-脯-苯丙-)、環(huán)(-異亮-苯丙-)的含量分別達(dá)200mgL-1和100mgL-1。以10噸的發(fā)酵罐為例，發(fā)酵一次，經(jīng)分離純化可分別得純環(huán)(-脯-苯丙-)和環(huán)(-異亮-苯丙-)各1.5kg和0.8kg。
實(shí)施例2環(huán)二肽類(lèi)化合物的生物制備1)將高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)菌種，在常規(guī)固體培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，復(fù)壯，25℃培養(yǎng)24h；然后進(jìn)行種子培養(yǎng)，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.5％，蛋白胨0.2％，葡萄糖0.5％，NH4H2PO40.05％，NaCl0.5％，以水補(bǔ)足體積；調(diào)初始PH值為6.0，在121℃下滅菌20min，冷卻后以1％的接種量接種，25℃培養(yǎng)28h。
2)發(fā)酵罐中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方同上述種子液體培養(yǎng)基的配方，以6％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶0.6，25℃培養(yǎng)100h，得發(fā)酵液；3)發(fā)酵液離心得上清液，減壓濃縮，丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調(diào)至7，用等體積的乙酸乙酯提取三次，最后減壓蒸餾濃縮至干，用5毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從9∶2到5∶5梯度洗脫；再按常規(guī)方法將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離純化，薄層層析法分析后將性質(zhì)相同的組分合并，得8個(gè)組分，經(jīng)氣、液色譜，質(zhì)譜，核磁共振分析證實(shí)為環(huán)(-脯-苯丙-)、環(huán)(-異亮-苯丙-)、環(huán)(-色-苯丙-)、環(huán)(-脯-色-)、環(huán)(-脯-亮-)、環(huán)(-苯丙-苯丙-)、環(huán)(-脯-酪-)、環(huán)(-色-色)，其中環(huán)(-脯-苯丙-)、環(huán)(-異亮-苯丙-)的含量分別達(dá)100mgL-1和50mgL-1。以10噸的發(fā)酵罐為例，發(fā)酵一次，經(jīng)分離純化可分別得純環(huán)(-脯-苯丙-)和環(huán)(-異亮-苯丙-)各0.8kg和0.4kg。
實(shí)施例3環(huán)(-脯-苯丙-)的植物生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定將反枝莧、早熟禾等雜草和水稻種子催芽，選飽實(shí)露白種子各10粒置培養(yǎng)皿內(nèi)，將環(huán)(-脯-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三個(gè)濃度梯度，每皿加液10ml，各設(shè)三個(gè)重復(fù)，置于人工氣候箱內(nèi)，在溫度25、濕度75％、12小時(shí)光照條件下培養(yǎng)6天，測(cè)根莖長(zhǎng)度，與清水對(duì)照對(duì)比，求出抑制率，見(jiàn)圖2，圖3。試驗(yàn)表明，環(huán)(-脯-苯丙-)對(duì)所測(cè)三種植株的根莖均有抑制作用，其中對(duì)根的抑制明顯高于對(duì)莖的抑制，而不同植物又呈現(xiàn)差異，其中對(duì)反枝莧雜草的抑制又明顯高過(guò)其它兩種植物。
實(shí)施例4環(huán)(-異亮-苯丙-)的植物生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定將反枝莧、早熟禾等雜草和水稻種子催芽，選飽實(shí)露白種子各10粒置培養(yǎng)皿內(nèi)，將環(huán)(-異亮-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三個(gè)濃度梯度，每皿加液10ml，各設(shè)三個(gè)重復(fù)，置于人工氣候箱內(nèi)，在溫度25、濕度75％、12小時(shí)光照條件下培養(yǎng)6天，測(cè)根莖長(zhǎng)度，與清水對(duì)照對(duì)比，求出抑制率，見(jiàn)圖4，圖5。試驗(yàn)表明，環(huán)(-異亮-苯丙-)對(duì)所測(cè)三種植株的根莖均有抑制作用，其中對(duì)根的抑制明顯高于對(duì)莖的抑制，但總體活性要低于環(huán)(-脯-苯丙-)。
實(shí)施例5環(huán)(-色-苯丙-)的植物生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定將反枝莧、早熟禾等雜草和水稻種子催芽，選飽實(shí)露白種子各10粒置培養(yǎng)皿內(nèi)，將環(huán)(-色-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三個(gè)濃度梯度，每皿加液10ml，各設(shè)三個(gè)重復(fù)，置于人工氣候箱內(nèi)，在溫度25、濕度75％、12小時(shí)光照條件下培養(yǎng)6天，測(cè)根莖長(zhǎng)度，與清水對(duì)照對(duì)比，求出抑制率，見(jiàn)圖6，圖7。試驗(yàn)表明，環(huán)(-色-苯丙-)對(duì)所測(cè)三種植株的根莖均有抑制作用，其中對(duì)根的抑制要高于對(duì)莖的抑制，不同植物抑制率不同，其中對(duì)早熟禾雜草根的抑制明顯高過(guò)其它兩種植物。
權(quán)利要求
1.環(huán)二肽類(lèi)化合物(式1)的生物制備方法，cyclo-(-A1-A2-)(式1)其中，A1為Pro、Phe、Leu、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；A2為T(mén)ry、Phe、Ile、一種脂肪族氨基酸或一種芳香族氨基酸；其特征是包括以下步驟1)以保藏編號(hào)為CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種(Xanthomonas campestris pv.retroflexus)為菌種，在常規(guī)固體培養(yǎng)基中對(duì)該菌種進(jìn)行斜面培養(yǎng)，復(fù)壯，25-30℃培養(yǎng)9-24h；然后進(jìn)行種子培養(yǎng)，在400ml三角瓶中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水補(bǔ)足體積；調(diào)初始PH值為6.0-7.4，在121-125℃下滅菌20-30min，冷卻后以1％的接種量接種，25-30℃培養(yǎng)12-32h。2)發(fā)酵罐中盛2/3體積的液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配方同上述種子液體培養(yǎng)基的配方，以6-12％的接種量接種，通氣量按體積比為1∶0.6-1.5，25-30℃培養(yǎng)54-120h，得發(fā)酵液；3)發(fā)酵液離心得上清液，減壓濃縮，用丙酮多次沉淀去除多糖，減壓蒸去丙酮，將剩留液pH調(diào)至3-7，用等體積的乙酸乙酯提取數(shù)次，然后合并乙酸乙酯提取液，將其減壓蒸餾濃縮至干，用1-5毫升的甲醇溶解，用硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯按體積比從10∶1到4∶6梯度洗脫；再將鹽酸水解后茚三酮顯色的部分用硅膠柱分離，薄層層析法分析后將性質(zhì)相同的組分合并，制得環(huán)二肽類(lèi)化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)二肽類(lèi)化合物的用途，其特征在于該環(huán)二肽類(lèi)化合物用于防除反枝莧、藜、決明、早熟禾和馬唐雜草。
全文摘要
本發(fā)明的環(huán)二肽類(lèi)化合物的生物制備方法是以保藏編號(hào)為CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種為菌種，經(jīng)發(fā)酵、分離、提純得多個(gè)環(huán)二肽類(lèi)化合物，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便可行，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染；所用原料廉價(jià)，易于形成大規(guī)模批量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)率較高。經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明方法制得的環(huán)二肽類(lèi)化合物對(duì)反枝莧、藜、決明、早熟禾、馬唐等雜草表現(xiàn)出較好的生物除草活性。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1557961SQ200410015840
公開(kāi)日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者李永泉, 李明智, 莊曉峰, 孫自玲, 徐凌 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)