專利名稱：人干細(xì)胞生長因子及其聚乙二醇修飾化產(chǎn)物的生產(chǎn)方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人干細(xì)胞生長因子的高效表達(dá)與純化方法，以及聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞生長因子(SCF)是由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白，它是一種重要的造血細(xì)胞因子，主要作用于早期的造血干細(xì)胞和原始造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化，在維持造血細(xì)胞存活，促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長發(fā)育中起著重要作用。人SCF基因定位在人染色體12q22 12qM上，長1. 41Λ，含有7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子。天然人干細(xì)胞因子具有兩種存在形式全長分子hSCF-α (成熟mRNA完全開放讀碼框972bp，編碼323個(gè)氨基酸，表達(dá)蛋白大小約為45KDa)和在C端保守的Ca2+依賴Hi只另Il結(jié)構(gòu)域(calcium dependent carbohydrate recognition domain,CRD)內(nèi)缺失78 氨基酸的截短型分子hSCF- β (成熟mRNA長738bp，編碼245個(gè)氨基酸，表達(dá)蛋白的大小約為^KDa)。它們?yōu)橥痪幋amRNA在不同位點(diǎn)剪切所致的不同產(chǎn)物。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)人干細(xì)胞生長因子具有多種生物學(xué)功能，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、精細(xì)化工等諸多領(lǐng)域。特別是近年來干細(xì)胞迅猛發(fā)展，利用干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行疾病治療具有很大的發(fā)展前景，尤其是對于血液病的治療具有極大的意義。骨髓移植和造血干細(xì)胞移植已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中治療血液病的一種主要手段，但是還存在著血液配型困難、干細(xì)胞數(shù)量少，擴(kuò)增困難等諸多問題。如果能從患者或與其配型相同的人的其他組織和器官中分離出成體干細(xì)胞，在體外實(shí)現(xiàn)造血細(xì)胞的定向分化，快速擴(kuò)增，這將對與造血干細(xì)胞移植具有重大的意義。但天然的可溶型SCF在人體和動(dòng)物體內(nèi)含量甚微，在血液中的濃度為3. 3ng/ml，故不可能從天然組織中分離純化足夠量樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用研究。 在大腸桿菌中表達(dá)的重組干細(xì)胞生長因子，常形成不可溶、無生物活性的包涵體，即使復(fù)性在體內(nèi)也沒有活性或活性降低，且融合表達(dá)常出現(xiàn)氨基酸缺失、純化方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。SUMO融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展的一種新型蛋白表達(dá)系統(tǒng)，與其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢:1)SUM0(small ubiquitin-related modifier，小泛素相關(guān)修飾因子)不僅可以提高蛋白質(zhì)在宿主菌中的表達(dá)量，而且能夠大大增加蛋白的可溶性； 2)準(zhǔn)確無誤地切除融合標(biāo)簽。由于融合標(biāo)簽會影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，所以融合蛋白必須切除融合標(biāo)簽，通常采用化學(xué)或酶學(xué)方法，如fe因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多問題，產(chǎn)率低、蛋白沉淀、酶切條件復(fù)雜、蛋白酶昂貴等，此外還經(jīng)常產(chǎn)生非預(yù)期的 N-端。和其他蛋白酶不同，SUMO酶識別SUMO標(biāo)簽的三級結(jié)構(gòu)，因而能準(zhǔn)確地切除，不會產(chǎn)生延伸的N-端，而且酶切條件(pH、溫度和離子強(qiáng)度)很寬松。但SUMO表達(dá)系統(tǒng)是否能用于SCF的表達(dá)尚未見報(bào)道。聚乙二醇(PEG)修飾，或稱PEG化(PEGylation)，是二十世紀(jì)70年代后期逐漸發(fā)展起來的一項(xiàng)熱門技術(shù)，是目前對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾最重要的技術(shù)之一，是用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效途徑。用PEG修飾蛋白質(zhì)和多肽藥物可大大增加蛋白質(zhì)和多肽藥物的抗蛋白水解酶的降解作用。對蛋白質(zhì)類藥物，由于PEG修飾后，其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期顯著增長，PEG修飾后，蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的藥效是增大的。但是，與PEG偶合后的蛋白質(zhì)和多肽，其空間構(gòu)象，空間位阻，靜電結(jié)合性，疏水性等理化性質(zhì)都會發(fā)生變化，與受體連接的親和力經(jīng)常因這些理化性質(zhì)的變化而降低，從而導(dǎo)致聚乙二醇修飾后蛋白質(zhì)和多肽藥物的體外藥效降低。由此可見，蛋白質(zhì)藥物在生物體內(nèi)易被蛋白酶降解，而經(jīng)過PEG修飾化的蛋白質(zhì)藥物可以延長其半衰期，但其體外藥效一般會降低。因此，如何同時(shí)提高SCF蛋白的促紅細(xì)胞增殖活性和延長半衰期，需要系統(tǒng)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種人干細(xì)胞生長因子的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
1、一種融合基因，其編碼SUMO-rhSCF-α融合蛋白。優(yōu)選的，所述的融合基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。2、含有上述融合基因的表達(dá)載體。3、人干細(xì)胞生長因子的生產(chǎn)方法，包括如下步驟
1)將2的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌中，誘導(dǎo)表達(dá)SUMO-rhSCF-a融合蛋白；
2)分離純化SUMO-rhSCF-a融合蛋白，切除SUMO部分，純化rhSCF-α蛋白。4、按照3的方法所得到的重組rhSCF- α蛋白。5、一種聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子的制備方法，包括如下步驟
1)將4所述的rhSCF-α蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG_ALD)在對 沈！或 3 5°C反應(yīng)10 14小時(shí)，加甘氨酸終止反應(yīng)；
2)分離純化得到聚乙二醇修飾的人干細(xì)胞生長因子。優(yōu)選的，步驟1)是在pH6. 0,50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行，所述rhSCF-α蛋白的濃度為4. 5 5. 5mg/mL。優(yōu)選的，所述rhSCF-α蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛的質(zhì)量比為2 3 1。優(yōu)選的，所述單甲氧基聚乙二醇丙醛為20kDa單甲氧基聚乙二醇丙醛 (mPEG-ALD-20kDa)。6、以上方法制備得到的聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子在制備治療貧血、放化療及骨髓移植術(shù)后造血功能的重建和恢復(fù)、干細(xì)胞體外擴(kuò)增、基因治療藥物以及在促進(jìn)表皮細(xì)胞新陳代謝、修復(fù)衰老和損傷皮膚細(xì)胞、延緩肌膚衰老等化妝品方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于
1)本發(fā)明將rhSCF-α基因與小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)基因進(jìn)行融合表達(dá)，并對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了 rhSCF-α蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性高表達(dá)。2)本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的SUMO-rhSCF- α融合蛋白帶有His標(biāo)簽，經(jīng)鎳離子親和層析和SUMO蛋白酶解去除SUMO蛋白和His標(biāo)簽后，可以實(shí)現(xiàn)rhSCF- α蛋白的大規(guī)模純化，所得的rhSCF-α蛋白活性高。
3)將人干細(xì)胞因子進(jìn)行聚乙二醇修飾化，采用mPEG-ALD修飾劑，修飾條件溫和， 交聯(lián)時(shí)未引進(jìn)其它活性基團(tuán)，對蛋白質(zhì)活性影響較小，同時(shí)便于產(chǎn)物的純化和鑒定。通過該修飾方法所得到的聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子的半衰期明顯延長，且其促紅細(xì)胞增殖活性也得到顯著的提高。


圖1是rhSCF- α基因PCR產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，長度為93^ρ ；
圖2是SUMO-rhSCF-α融合基因PCR產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，長度為1300bp ； 圖3是質(zhì)粒質(zhì)粒pET-3c (+)電泳圖4是SUMO-rhSCF- α重組質(zhì)粒酶切檢測結(jié)果電泳圖(M :maker, 1為BamH I單酶切， 2 為質(zhì)粒 pET-3c-SUM0-rhSCF- α，3 為 Nde I 和 BamH I 雙酶切，4 為 Nde I 單酶切；
圖5是SDS-PAGE分析不同的IPTG濃度誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)(M :maker, 1 未誘導(dǎo)；2 9 IPTG 添加濃度分別為 0. 1,0. 3,0. 5,0. 7,0. 9,1. 0,1. 5,2. OmM)；
圖6是SDS-PAGE分析在不同的0D600時(shí)誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)(M :maker，1 未誘導(dǎo)； 2 6 :0D600 分別為 0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 2)；
圖7是SDS-PAGE分析在不同溫度、誘導(dǎo)不同時(shí)間誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)(M :maker ；1、4、 7 在 37°C分別誘導(dǎo) 4h，12h，24h ；2、5、8 在 20°C分別誘導(dǎo) 4h，12h，24h ；3、6、，9 在 15°C分別誘導(dǎo) 4h，12h，Mh)；
圖8是目的蛋白SUMO-rhSCGF-α的電泳檢測圖(M :maker ；1 大腸桿菌BL21 ；2 :0. IM IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21 ;3 含質(zhì)粒pET-3c-SUM0_rhSCF-α的大腸桿菌BL21未誘導(dǎo)；4 0. IM IPTG誘導(dǎo)含質(zhì)粒pET-3c-SUM0-rhSCF-a的大腸桿菌BL21 ；5 誘導(dǎo)后蛋白上清；6 誘導(dǎo)后蛋白沉淀)；
圖9是SUMO-rhSCF-α的酶切產(chǎn)物的12% SDS-PAGE電泳圖； 圖10是rhSCF-α蛋白的western blot檢測圖11是rhSCF- a、mPEG_rhSCF- α分別和rmGM_CSF協(xié)同刺激BALA/c小鼠單核細(xì)胞形成GM-Colonies的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖12是hSCF- α或PEG-hSCF- α蛋白在37°C的穩(wěn)定性檢測圖； 圖13是hSCF-a或PEG-hSCF-α蛋白在SD大鼠中半衰期檢測圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1 人干細(xì)胞生長因子的重組表達(dá)一、構(gòu)建SUMO-rhSCF-α融合基因
1、引物設(shè)計(jì)
根據(jù) SUMO 基因序列(Genebank no :NC_011677. 1)及 rhSCF-α 基因序列(GenBank ΑΒ009244. 1)分別設(shè)計(jì)引物(見表1)。
表1用于合成SUMO-rhSCF-全長序列的引物!> ^OOCAOJUGtoyALMk^j. ^OtijCi 1GL 'CijGijGAuCACjAu AG StO H) NU -! + S AtΛ0(；/)ΓCf Γ; 1Λ(ιΑΛΙι06ΟΛΑ ； 'CGCA(5ΛΓ(ι {；·, Sl (J fl) \ι ι -注加粗為SUMO基因序列；下劃線加粗為His標(biāo)簽序列；下劃實(shí)線為15肽linker 基因序列；斜體為添加的酶切位點(diǎn)；下劃虛線為rhSCF-α基因序列。2、PCR 反應(yīng)
(1)從人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)中用常規(guī)方法提取mRNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得 rhSCF-α 的 cDNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA的合成(建立20 μ 1的反應(yīng)體系可以用于逆轉(zhuǎn)錄Ing 5 μ g總RNA或1 500ngmRNA)
1)將下組分加入無RNase的微量離心管中ol igo (dT) 1 μ 1，抽提的hUCMSCs RNA 2 μ 1，IOmM dNTP 混合物 1 μ 1，加入 3d /K 9 μ 1 至總體積 13 μ 1。2)混合物在65°C加熱5min，迅速冰上冷卻，短暫離心后，加入以下組分5X第一鏈合成緩沖液4 μ 1，0. IM DTT 2 μ 1，總體積19 μ 1。3)在離心管中輕輕將各種組分混合，短暫離心后，在37°C下孵育aiiin。4)在室溫下加入1 μ 1 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕吹打混勻。5)37°C下孵育 50min。6) 70°C加熱15min終止反應(yīng)。(2)以引物S1、S2擴(kuò)增SUMO基因及中間15肽linker基因，反應(yīng)體系及程序如下 PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)程序
權(quán)利要求
1.一種融合基因，其編碼SUMO-rhSCF-α融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合基因，其具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求1或2所述融合基因的表達(dá)載體。
4.人干細(xì)胞生長因子的生產(chǎn)方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌中，誘導(dǎo)表達(dá)SUMO-rhSCF-a融合蛋白；2 )分離純化SUMO-rhSCF-a融合蛋白，切除SUMO部分，純化rhSCF- α蛋白。
5.按照權(quán)利要求4的方法所得到的重組rhSCF-α蛋白。
6.一種聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子的制備方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求5所述的rhSCF-α蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG_ALD)在 24l6°C或；T5°C反應(yīng)10 14小時(shí)，加甘氨酸終止反應(yīng)；2)分離純化得到聚乙二醇修飾的人干細(xì)胞生長因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟1)是在pH6.0,50 mmol/ L的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行，所述rhSCF- α蛋白的濃度為4. 5^5. 5mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述rhSCF-α蛋白與單甲氧基聚乙二醇丙醛的質(zhì)量比為纊3:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述單甲氧基聚乙二醇丙醛為20kDa 單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD-20kDa)。
10.權(quán)利要求6、任一項(xiàng)的方法制備得到的聚乙二醇修飾化人干細(xì)胞生長因子在制備治療貧血、放化療及骨髓移植術(shù)后造血功能的重建和恢復(fù)、干細(xì)胞體外擴(kuò)增、基因治療藥物以及在促進(jìn)表皮細(xì)胞新陳代謝、修復(fù)衰老和損傷皮膚細(xì)胞、延緩肌膚衰老等化妝品方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了人干細(xì)胞生長因子及其聚乙二醇修飾化產(chǎn)物的生產(chǎn)方法及用途。通過將h-SCF-a與SUMO序列融合，構(gòu)建得到SUMO-rhSCF-α融合基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主菌得到工程菌，培養(yǎng)該工程菌并誘導(dǎo)表達(dá)SUMO-rhSCF-a融合蛋白，切除SUMO部分，得到rhSCF-α蛋白，實(shí)現(xiàn)了rhSCF-α蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性高表達(dá)及大規(guī)模純化，所得的rhSCF-α蛋白活性高。本發(fā)明還公開了人干細(xì)胞生長因子PEG修飾化產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，該方法所得到的PEG修飾化人干細(xì)胞生長因子的半衰期明顯延長，且其促紅細(xì)胞增殖活性也得到顯著的提高，可用于制備治療貧血、放化療及骨髓移植術(shù)后造血功能的重建和恢復(fù)、干細(xì)胞體外擴(kuò)增、基因治療藥物以及在促進(jìn)表皮細(xì)胞新陳代謝、修復(fù)衰老和損傷皮膚細(xì)胞、延緩肌膚衰老等化妝品方面的應(yīng)用等。
文檔編號A61K38/18GK102559725SQ20121001614
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者任哲, 利奕成, 王一飛, 趙振嶺 申請人:廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司