本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及異甘草酸鎂在制備改善氨基糖苷類抗生素引起的腎損傷的治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

感染性疾病一直是對(duì)人類健康威脅極大的疾病之一。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，每年感染性疾病導(dǎo)致上千萬人死亡，占全球年死亡人數(shù)的三分之一；全球抗感染藥物的市場(chǎng)銷售額近千億美元，占全球治療性藥物市場(chǎng)額約10％，并且以每年不低于8％的速度增長(zhǎng)；而我國(guó)是世界上抗感染藥物銷售量最大的國(guó)家，并且這一需求將隨用藥人群的增加進(jìn)一步增大。但由于抗感染藥物的濫用及新型抗感染藥物的缺乏，細(xì)菌對(duì)抗感染藥物的耐藥性已成為嚴(yán)重威脅人類健康的全球性問題。而氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside，ags)作為臨床上廣泛使用的一類抗菌藥物，在治療革蘭氏陰性菌感染和多藥耐藥性感染中具有獨(dú)特的效能。如慶大霉素和阿米卡星在臨床上廣泛應(yīng)用于革蘭氏陰性菌引起的感染和細(xì)菌性心內(nèi)膜炎的治療；鏈霉素作為最早發(fā)現(xiàn)的氨基糖苷類抗生素，在抗結(jié)核藥物中仍作為一線用藥。近年來也有研究報(bào)道，氨基糖苷類藥物可能具有潛在的治療家族性遺傳病以及hiv的作用。但制約該類藥物廣泛使用的毒副作用為其較嚴(yán)重的腎毒性和不可逆的耳毒性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，氨基糖苷類抗生素造成的腎毒性的發(fā)生率在1.7％-58％，其物質(zhì)基礎(chǔ)可歸于藥物在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的靶向蓄積，進(jìn)而造成氧化應(yīng)激及線粒體損傷，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的凋亡壞死。因此，解決氨基糖苷類藥物的腎毒性副作用，充分發(fā)揮其在抗革蘭氏陰性菌及抗多藥耐藥菌方面的獨(dú)特作用，使其更好地應(yīng)用于臨床，已迫在眉睫。近年來，已有很多研究集中在通過聯(lián)用中草藥來干預(yù)氨基糖苷類抗生素腎損傷的發(fā)生。

中藥甘草具有“解百毒”的美譽(yù)，甘草酸是中藥甘草的活性物質(zhì)，是一種五環(huán)三萜系列皂苷，可水解為甘草次酸和兩分子葡萄糖醛酸，其結(jié)構(gòu)式如下：

甘草酸具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)作用。異甘草酸鎂(magnesiumisoglycyrrhizinate，mgig，商品名為天晴甘美)是第四代甘草酸制劑。臨床上使用甘草酸制劑治療肝臟疾病已經(jīng)超過了30年，也經(jīng)歷了三代制劑，分別為甘草甜素片、提取甘草酸單銨鹽的復(fù)方甘草酸制劑、甘草酸二銨α體和β體的混合制劑。異甘草酸鎂作為最新一代甘草酸制劑，是甘草酸(glycyrrhizicacid，ga)單一立體異構(gòu)體鎂鹽，其有效成分是18α，20β-羧基-11-氧代正齊墩果烷-12-烯-3β-基-2-o-β-d-葡萄吡喃糖苷醛酸基-α-d-葡萄吡喃糖苷醛酸鎂四水合物，它是一種多功能的肝細(xì)胞保護(hù)劑，具有較強(qiáng)的抗炎、抗生物氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能等藥理作用，臨床上用于治療慢性病毒性肝炎和急性藥物性肝損傷。近年來，一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)甘草酸對(duì)缺血再灌注性、高血糖性、藥物性、變態(tài)反應(yīng)性等不同類型腎損傷有一定的保護(hù)作用。已有臨床報(bào)道稱甘草酸對(duì)腎綜合征出血熱、阿昔洛韋致急性腎衰竭、心臟手術(shù)引起的缺血再灌注性腎損傷，以及慢性腎臟疾病的治療具有一定療效。甘草酸廣泛的生物活性使其在臨床愈發(fā)受到重視，但其在腎臟領(lǐng)域的研究和應(yīng)用才剛剛起步。因此，我們推測(cè)，異甘草酸鎂對(duì)于藥物性腎損傷是否也具有一定的保護(hù)作用呢？擬采用氨基糖苷類藥物慶大霉素和阿米卡星構(gòu)建藥物性腎損傷模型，并通過聯(lián)用異甘草酸鎂進(jìn)行干預(yù)，探索異甘草酸鎂對(duì)于藥物引起的腎損傷是否具有潛在的保護(hù)作用并闡明可能的機(jī)制，進(jìn)而對(duì)臨床上氨基糖苷類抗生素引起的腎損傷的治療提供新的思路。

專利cn201511024817.3公開了包括甘草在內(nèi)的中藥散劑對(duì)動(dòng)物蓄積性中毒引起的肝腎損傷的修復(fù)作用，其能提高動(dòng)物肝臟解毒能力和腎臟排毒能力，進(jìn)而比較徹底地清除動(dòng)物體內(nèi)的各種毒素。專利cn201110154228.2公開了一種甘草次酸衍生物在制備腎損傷性疾病的預(yù)防和治療藥物方面的應(yīng)用，甘草次酸衍生物ty-501琥珀酸單鈉鹽能夠減輕順鉑/慶大霉素在sd大鼠上所造成的急性腎損傷。專利201611147510.7公開了18β甘草次酸(或鹽)作為減輕化療藥順鉑引起的急性腎損傷的輔助治療藥物中的應(yīng)用，其保腎作用與抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供異甘草酸鎂的一種新的醫(yī)藥用途，即其可以用于降低氨基糖苷類抗生素慶大霉素和阿米卡星所致的腎毒性副作用。腎功能相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示慶大霉素/阿米卡星致腎損傷模型組血清肌酐、尿素氮水平均顯著上調(diào)，而聯(lián)用異甘草酸鎂均可以下調(diào)氨基糖苷類抗生素所致腎功能相關(guān)生化指標(biāo)的異常，進(jìn)而改善腎臟功能。病理研究結(jié)果顯示，慶大霉素/阿米卡星致腎損傷模型組腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見明顯的病理改變，且主要集中在腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)，而聯(lián)用異甘草酸鎂可以改善這一病變。熒光定量pcr測(cè)定結(jié)果顯示，慶大霉素/阿米卡星致腎損傷模型組腎臟組織線粒體生物修復(fù)調(diào)控因子、腎臟相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而聯(lián)用異甘草酸鎂，前述相關(guān)因子的表達(dá)水平均明顯上調(diào)。異甘草酸鎂與慶大霉素/阿米卡星在sd大鼠上聯(lián)合用藥時(shí)，可在不同程度上降低氨基糖苷類藥物在sd大鼠的組織分布量，提示聯(lián)用異甘草酸鎂可能通過減少腎毒性藥物在體內(nèi)的累積進(jìn)而發(fā)揮保腎作用。體外抗菌藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示異甘草酸鎂與慶大霉素聯(lián)用的抗菌藥效與慶大霉素單用相近，提示聯(lián)用異甘草酸鎂并不會(huì)影響慶大霉素自身的抗菌活性。

附圖說明

圖1：sd大鼠多次給藥后，對(duì)照組(control)，單用慶大霉素組(gm)，單用阿米卡星組(amk)，慶大霉素聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(gm+mgig)，阿米卡星聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(amk+mgig)的腎功能相關(guān)生化指標(biāo)

圖2：sd大鼠多次給藥后，對(duì)照組(control)，單用慶大霉素組(gm)，單用阿米卡星組(amk)，慶大霉素聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(gm+mgig)，阿米卡星聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(amk+mgig)的腎臟組織病理切片

圖3：實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)多次給藥后，對(duì)照組(control)，單用慶大霉素組(gm)，單用阿米卡星組(amk)，慶大霉素聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(gm+mgig)，阿米卡星聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(amk+mgig)的腎臟組織線粒體生物修復(fù)調(diào)控因子mrna水平的表達(dá)

圖4：實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)多次給藥后，對(duì)照組(control)，單用慶大霉素組(gm)，單用阿米卡星組(amk)，慶大霉素聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(gm+mgig)，阿米卡星聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組(amk+mgig)的腎臟組織相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體mrna水平的表達(dá)

圖5：lc-ms/ms檢測(cè)多次給藥后，慶大霉素(gentamicin，gm)和阿米卡星(amikacin，amk)單用及與異甘草酸鎂聯(lián)用(gentamicin+mgig/amikacin+mgig)，gm和amk在sd大鼠體內(nèi)的組織分布情況

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：sd大鼠多次給藥后腎功能相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定

主要步驟如下：

雄性sd大鼠36只，按體重隨機(jī)分配為六組，每組6只。

1.異甘草酸鎂對(duì)慶大霉素致腎損傷模型的保護(hù)作用：慶大霉素聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組：sd大鼠預(yù)給異甘草酸鎂5天(i.p50mg/kg/day)，從第6天開始，異甘草酸鎂給藥半小時(shí)后經(jīng)腹腔(i.p.)給予70mg/kg慶大霉素，連續(xù)給藥7天。單用慶大霉素組：在異甘草酸鎂預(yù)給藥期間，每天經(jīng)腹腔注射等體積的生理鹽水，從第6天開始，生理鹽水給予半小時(shí)后經(jīng)腹腔(i.p.)給予70mg/kg慶大霉素，連續(xù)給藥7天?？瞻讓?duì)照組：每天給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給予12天。最后一次給藥后4h，經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，經(jīng)血清生化儀測(cè)定腎功能相關(guān)生化指標(biāo)。

2.異甘草酸鎂對(duì)阿米卡星致腎損傷模型的保護(hù)作用：阿米卡星聯(lián)合異甘草酸鎂用藥組：sd大鼠預(yù)給異甘草酸鎂5天(i.p50mg/kg/day)，從第6天開始，異甘草酸鎂給藥半小時(shí)后經(jīng)腹腔(i.p.)給予210mg/kg阿米卡星，連續(xù)給藥13天。單用阿米卡星組：在異甘草酸鎂預(yù)給藥期間，每天經(jīng)腹腔注射等體積的生理鹽水，從第6天開始，生理鹽水給予半小時(shí)后經(jīng)腹腔(i.p.)給予210mg/kg阿米卡星，連續(xù)給藥13天。空白對(duì)照組：每天給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給予18天。最后一次給藥后4h，經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，經(jīng)血清生化儀測(cè)定腎功能相關(guān)生化指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

腎功能相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如圖1所示。與空白對(duì)照組相比，慶大霉素(gm)致腎損傷模型組及阿米卡星(amk)致腎損傷模型組血清肌酐(cr)、尿素氮(bun)的水平均顯著升高。慶大霉素/阿米卡星聯(lián)用異甘草酸鎂組(gm+mgig/amk+mgig)則均能明顯改善模型組腎功能相關(guān)生化指標(biāo)肌酐、尿素氮的異常。

實(shí)施例2：sd大鼠多次給藥后腎臟組織病理檢驗(yàn)

主要步驟如下：

氨基糖苷類藥物致腎損傷模型建立方法及給藥方案同實(shí)施例1。最后一天給藥4h后處死大鼠，左腎縱切，一半經(jīng)4％多聚甲醛固定后行病理組織學(xué)檢測(cè)(he/pas染色)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

病理切片檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。慶大霉素(gm)致腎損傷模型組及阿米卡星(amk)致腎損傷模型組he染色鏡下可見腎皮質(zhì)區(qū)腎小管壞死，腎小管擴(kuò)張，嗜堿性腎小管增多，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與空白對(duì)照組相比損傷嚴(yán)重；pas染色鏡下觀察，腎臟近曲小管刷狀緣明顯缺失。慶大霉素聯(lián)用異甘草酸鎂組及阿米卡星聯(lián)用異甘草酸鎂組(gm+mgig/amk+mgig)he染色鏡下可見腎皮質(zhì)區(qū)腎小管上皮輕度變性壞死，可見色素沉著，與gm/amk模型組相比病變程度均有所減輕；pas染色鏡下觀察，腎臟近曲小管刷狀緣缺失程度減輕。結(jié)果提示，異甘草酸鎂可降低氨基糖苷類藥物的腎臟毒性。

實(shí)施例3：sd大鼠多次給藥后腎臟組織線粒體生物修復(fù)調(diào)控因子的mrna水平的表達(dá)

主要步驟如下：

氨基糖苷類藥物致腎損傷模型建立方法及給藥方案同實(shí)施例1。最后一天給藥4h后處死大鼠，左腎縱切一半。按照takara總rna提取試劑盒操作提取腎組織rna，并進(jìn)行rna定量。按照rt-pcr試劑盒說明書，將mrna逆轉(zhuǎn)錄為cdna。按照thermalcyclerdicetmrealtimesystem(takaracode：tp800)使用說明書要求進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析。檢測(cè)腎組織線粒體生物修復(fù)調(diào)控因子：過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(pgc-1α)、核呼吸轉(zhuǎn)錄因子1(nrf1)的mrna水平的表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

定量pcr測(cè)定結(jié)果如圖3所示。慶大霉素(gm)致腎損傷模型組及阿米卡星(amk)致腎損傷模型組，與空白對(duì)照相比，腎組織線粒體生物修復(fù)調(diào)控因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(pgc-1α)、核呼吸轉(zhuǎn)錄因子1(nrf1)的表達(dá)顯著下調(diào)。慶大霉素聯(lián)用異甘草酸鎂組及阿米卡星聯(lián)用異甘草酸鎂組(model+mgig)，與gm/amk模型組相比，pgc-1α、nrf1的表達(dá)水平呈明顯上調(diào)。結(jié)果提示，異甘草酸鎂可能通過上調(diào)腎組織線粒體生物修復(fù)調(diào)控因子的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。

實(shí)施例3：sd大鼠多次給藥后腎臟組織相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的mrna水平的表達(dá)

主要步驟如下：

氨基糖苷類藥物致腎損傷模型建立方法及給藥方案同實(shí)施例1。具體實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施案例3。檢測(cè)腎組織相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平：有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(oct1)、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(oct2)的mrna水平的表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

定量pcr測(cè)定結(jié)果如圖4所示。慶大霉素(gm)致腎損傷模型組及阿米卡星(amk)致腎損傷模型組，與空白對(duì)照相比，腎組織轉(zhuǎn)運(yùn)體有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(oct1)、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(oct2)的表達(dá)顯著下調(diào)。慶大霉素聯(lián)用異甘草酸鎂組及阿米卡星聯(lián)用異甘草酸鎂組(model+mgig)，與gm/amk模型組相比，oct1，oct2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。結(jié)果提示，異甘草酸鎂可能通過上調(diào)腎組織相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。

實(shí)施例4：聯(lián)用異甘草酸鎂對(duì)ags在sd大鼠體內(nèi)組織分布的影響

主要步驟如下：

氨基糖苷類藥物致腎損傷模型建立方法及給藥方案同實(shí)施例1。最后一天給藥4h后經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，取心，肝，脾，肺，腎，腦，內(nèi)耳等重要臟器，測(cè)定氨基糖苷類藥物在sd大鼠各組織中的分布情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

lc-ms/ms檢測(cè)多次給藥后，慶大霉素(gentamicin，gm)和阿米卡星(amikacin，amk)單用及與異甘草酸鎂聯(lián)用(gentamicin+mgig/amikacin+mgig)，gm和amk在sd大鼠體內(nèi)的組織分布情況。結(jié)果如圖5所示，聯(lián)用異甘草酸鎂，能夠在不同程度上降低gm及amk在sd大鼠各組織中的分布量，提示聯(lián)用異甘草酸鎂可能通過減少氨基糖苷類抗生素在體內(nèi)的累積量進(jìn)而發(fā)揮潛在的保護(hù)作用。

實(shí)施例5：聯(lián)用異甘草酸鎂對(duì)gm體外抗菌藥效的影響

主要步驟如下：

稱取一定量的慶大霉素，配置成2mg/ml的慶大霉素原液，經(jīng)0.22μm濾膜無菌過濾，并貯存于4℃冰箱中備用。

根據(jù)慶大霉素抗菌譜廣的特性，實(shí)驗(yàn)中選用兩種主要致病菌(大腸桿菌atcc25922、金黃色葡萄球菌atcc292133)作為待測(cè)菌。將試驗(yàn)用菌接種至瓊脂營(yíng)養(yǎng)斜面，37℃培養(yǎng)過夜，使其生長(zhǎng)穩(wěn)定，狀態(tài)良好。再用接種環(huán)挑取少量菌落于4ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)6～8h，用無菌常量肉湯培養(yǎng)液稀釋成10⁶cfu/ml的細(xì)菌懸液，備用。

按試管倍比稀釋法，將慶大霉素原液稀釋至10個(gè)系列稀釋濃度，異甘草酸酸鎂注射液原液(5mg/ml)稀釋至3個(gè)系列稀釋濃度。取無菌96孔板，對(duì)兩種藥物于96孔板上以二維棋盤的縱(a至h)橫(2-11)兩方向分別進(jìn)行二倍的倍比稀釋，使得每孔中達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)定的不同濃度組合的兩種藥物混合液：慶大霉素的最終系列稀釋濃度為：8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.03125μg/ml，0.015625μg/ml。異甘草酸鎂的最終系列稀釋濃度為：0.625mg/ml，0.3125mg/ml，0.15625mg/ml。每孔中加入50μl制備好的前述細(xì)菌懸液，每孔最終接種菌量約為5*10⁵cfu/ml。置37℃培養(yǎng)20～24h，孔內(nèi)澄清無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即為藥物對(duì)待測(cè)菌株的mic。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

體外抗菌藥效試驗(yàn)結(jié)果如表1/表2所示。以最小抑菌濃度mic為指征，慶大霉素和異甘草酸鎂聯(lián)合用藥的抗菌藥效與慶大霉素(gm)單用相近，即聯(lián)用異甘草酸鎂(mgig)并不會(huì)影響慶大霉素對(duì)大腸桿菌/金黃色葡萄球菌的抗菌活性。

表1.異甘草酸鎂對(duì)于慶大霉素體外抗菌藥效的影響

注：“+”為有細(xì)菌生長(zhǎng)，“-”為無細(xì)菌生長(zhǎng)。

表2.聯(lián)用異甘草酸鎂對(duì)于慶大霉素mic值測(cè)定結(jié)果