本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及虎杖苷及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和治療大氣污染物pm2.5所致肺部損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：研究表明大氣中的pm2.5污染物會(huì)造成人體肺部的功能性損傷1,2，而附著在pm2.5上的化學(xué)物質(zhì)包括了大量的硫酸鹽，銨鹽，硝酸鹽，芳香烴類物質(zhì)以及鋁，鉛，鐵，鉻等重金屬污染物3.人體可接受的大氣中pm2.5的含量為35μg/m3,4,然而在京津冀地區(qū)2013年的平均pm2.5含量為106μg/m3,5，事實(shí)上，pm2.5已經(jīng)成為中國(guó)大陸居民健康殺手之一6。pm2.5主要影響機(jī)體的呼吸系統(tǒng)，并引起相關(guān)的炎癥反應(yīng)和降低肺功能，而造成相關(guān)損傷的原理與其氧化勢(shì)能有著密切的關(guān)系7，因此，尋找能夠顯著降低pm2.5氧化勢(shì)能并保護(hù)肺部功能的藥物可以大大降低大氣中pm2.5對(duì)于機(jī)體的損傷?；⒄溶?二苯乙烯-3-o-葡萄糖苷)是從虎杖中分離得到的一個(gè)天然產(chǎn)物，它同時(shí)存在于葡萄籽以及紅酒中9。該化合物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠明顯降低pm2.5的氧化勢(shì)能。在對(duì)其保護(hù)肺部組織的抗氧化實(shí)驗(yàn)中，pm2.5模型大鼠連續(xù)4周口服50mg/kg能夠降低pm2.5所導(dǎo)致的肺部損傷。本發(fā)明藥理實(shí)驗(yàn)中表5-表15顯示了其抗肺功能降低、抗炎活性，抗氧化作用。(表7，p<0.01,最大吸氣量、最大呼氣量等肺功能流量指標(biāo)；表8，p<0.05,潮氣量、呼氣量等肺功能容量指標(biāo))，(表10,p<0.05,mda；表11，p<0.01,gsh-px)，(表14，p<0.01,mon％,eos％)。同時(shí)該化合物對(duì)動(dòng)物體重的增長(zhǎng)具有明顯的改善作用。中國(guó)政府在2013年頒布了一項(xiàng)控制大氣污染的國(guó)際行動(dòng)計(jì)劃并要求盡快降低大氣中的pm2.5顆粒10。另一方面，保護(hù)個(gè)體不受pm2.5的損傷已經(jīng)成為一個(gè)緊急的公眾問題。目前的研究首次發(fā)現(xiàn)了虎杖苷能夠保護(hù)人體免受pm2.5的傷害。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供虎杖苷及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療和/或預(yù)防pm2.5所致的肺損傷產(chǎn)品中的應(yīng)用，以及富含虎杖苷的藥物組合物或復(fù)方在制備治療和/或預(yù)防pm2.5所致的肺損傷產(chǎn)品中的應(yīng)用。為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明技術(shù)方案的第一方面是提供了如式(i)所示的虎杖苷及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療pm2.5所致肺損傷產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述的藥學(xué)上可接受的鹽包括化合物的一價(jià)或二價(jià)金屬鹽。所述的產(chǎn)品包括藥物、保健品?；⒄人幉慕?jīng)80％乙醇回流提取，濃縮后浸膏通過有機(jī)溶劑萃取、大孔吸附樹脂層析分離純化，得到虎杖苷，并通過uv、nmr等譜學(xué)手段分析鑒定其結(jié)構(gòu)。上述化合物的波譜信息及核磁信號(hào)歸屬如下：白色粉末,uvλmax(meoh)nm:312,218；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:7.41(2h,d,j＝8.5,2′,6′-h),7.04(1h,d,j＝16.0,hb-h),6.88(1h,d,j＝16.0,ha-h),6.77(2h,d,j＝8.5,3′,5′-h),6.74(1h,s,2-h),6.58(1h,s,6-h),6.35(1h,s,4-h),4.82(1h,d,j＝7.5,1″-h)本發(fā)明技術(shù)方案的第二方面是提供了一種藥物組合物或復(fù)方，其含有有效劑量的第一方面所述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體或其他活性成分。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1～95％重量的本發(fā)明化合物。在單元?jiǎng)┬椭斜景l(fā)明化合物一般含量為0.1～100mg，優(yōu)選的單元?jiǎng)┬秃?～50mg。本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。例如為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、單硬脂酸甘油脂、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。例如，將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍：本發(fā)明的化合物的用量為0.001～100mg/kg體重，優(yōu)選為0.1～60mg/kg體重，更優(yōu)選為1～30mg/kg體重，最優(yōu)選為2～15mg/kg體重。成人患者服用的本發(fā)明化合物每日為10～500mg，優(yōu)選為20～100mg，可一次服用或分2～3次服用；兒童服用的劑量按照每kg體重5～30mg，優(yōu)選為10～20mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥，這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及治療手段的給藥方案。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。有益技術(shù)效果：本發(fā)明的虎杖苷具有明顯的預(yù)防和治療大氣污染物pm2.5所致肺部損傷的作用。附圖說明圖1.虎杖苷顯著降低pm2.5的氧化勢(shì)圖2虎杖苷改善pm2.5所致肺組織病理學(xué)改變圖3.虎杖苷和pm2.5對(duì)脂質(zhì)代謝的影響具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例及藥理活性實(shí)驗(yàn)用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1、虎杖苷的制備10kg虎杖藥材經(jīng)80％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，提取液濃縮后使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次，正丁醇部位回收溶劑，使用蒸餾水分散溶解，上清液通過hp20型大孔吸附樹脂，使用乙醇/水溶劑系統(tǒng)洗脫，收集30％乙醇洗脫部分，回收溶劑后經(jīng)硅膠柱層析，凝膠lh-20反復(fù)純化得到虎杖苷，經(jīng)uv、nmr等譜學(xué)手段分析鑒定其結(jié)構(gòu)。藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1、pm2.5造模大鼠給予虎杖苷后對(duì)炎癥相關(guān)的神經(jīng)酰胺具有調(diào)節(jié)作用1.1方法：高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，進(jìn)行血漿和肺臟勻漿液分析，通過opls-da分析，獲得生物標(biāo)志物信息；色譜條件：色譜柱：peekec8sr(150×3.0mm,3μm)。流動(dòng)相a：水(含0.1％甲酸，1mm甲酸銨)，流動(dòng)相b：甲醇(含0.1％甲酸，1mm甲酸銨)。流動(dòng)相梯度為：0-10min80％-100％b，10-18min100％b，18-18.1min100％-80％b，18.1-25min80％b。流速0.5ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣體積6μl。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(esi)，采用正離子mrm模式采集數(shù)據(jù)。干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：10l/min，霧化氣壓力：30psi，毛細(xì)管電壓：4000v。1.2動(dòng)物試驗(yàn)方法：采用hope-med8052粉塵類口鼻動(dòng)式染毒設(shè)備模擬大氣污染環(huán)境，構(gòu)建細(xì)顆粒物慢性染毒大鼠模型。具體制備過程如下：spf級(jí)sd大鼠(180～200g)，口鼻部暴露于染毒艙內(nèi)，染毒倉(cāng)設(shè)有一個(gè)進(jìn)氣系統(tǒng)和排氣系統(tǒng)。將適量細(xì)顆粒物放入設(shè)備藥粉盒中，通過進(jìn)氣系統(tǒng)霧化至整個(gè)染毒艙，通過采樣系統(tǒng)計(jì)算細(xì)顆粒物濃度及染毒劑量，并測(cè)定染毒狀態(tài)下可吸入顆粒物的粒徑分布。染毒同時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，每天給藥1次，虎杖苷給藥劑量為50mg/kg，給予連續(xù)染毒與給藥至4周。染毒期結(jié)束前一日禁食，戊巴比妥鈉(40mg/kg,i.p.)麻醉，放血處死動(dòng)物，收集大鼠血液和肺組織。1.3生物樣品處理：取100μl臟器勻漿液或血漿樣品于玻璃管中，加入20μl內(nèi)標(biāo)溶液，1.5ml甲醇和5mlmtbe，大功率渦旋15min，加入1.5ml去離子水后相分離，4500rpm離心10min，吸取上層有機(jī)相置于另一玻璃管中。下層水相二次萃取，大功率渦旋15min，4500rpm離心10min，吸取上層有機(jī)相合并，氮?dú)獯蹈珊笥?00μl流動(dòng)相復(fù)溶。1.4具體數(shù)據(jù)；虎杖苷對(duì)一些造模后變化顯著的炎癥相關(guān)的神經(jīng)酰胺具有顯著的恢復(fù)性調(diào)節(jié)作用。具體數(shù)據(jù)見表1和2。表1.pm2.5造模大鼠給予虎杖苷后大鼠血漿中炎癥相關(guān)的神經(jīng)酰胺變化表2.pm2.5造模大鼠給予虎杖苷后大鼠肺組織中炎癥相關(guān)的神經(jīng)酰胺變化實(shí)驗(yàn)例2、給藥后大鼠血液和肺臟中虎杖苷和白藜露醇含量測(cè)定2.1方法：高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，odsc18分析柱(150mm"2.1mm,3.5μm)分離。色譜條件:柱溫設(shè)定為30℃；線性梯度洗脫:a相為0.01％甲酸,b相為乙腈,起始時(shí)b相15％,5min后b相100％,維持10min；流速為0.3ml.min-1。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(esi)，采用正離子sim模式采集數(shù)據(jù)，白藜蘆醇m/z229,虎杖苷m/z391。干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：10l/min，霧化氣壓力：30psi，毛細(xì)管電壓：4000v。2.2數(shù)據(jù)給藥后20分鐘大鼠血漿和肺中可檢測(cè)到虎杖苷和白藜蘆醇，主要成分是虎杖苷，60分鐘后仍可檢測(cè)到較高濃度的虎杖苷和濃度較低的白藜蘆醇，虎杖苷是主要藥效成分，白藜蘆醇是虎杖苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。具體數(shù)據(jù)見表3。表3.給藥后大鼠血液和肺臟中虎杖苷和白藜露醇含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)例3、虎杖苷降低pm2.5氧化勢(shì)測(cè)定3.1方法ddt分光光度法利用二硫蘇糖(dithiothreitol(dtt))催化pm2.5的電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)，將dtt過量，然后催化5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)反應(yīng)生成5-巰基-2-硝基苯甲酸，采用酶標(biāo)儀在412nm測(cè)定其含量，計(jì)算pm2.5消耗的dtt，換算為pm2.5的氧化勢(shì)。0.7mlpm2.5提取物與0.1mldtt(1mm)，0.2磷酸緩沖(0.1m,ph7.4)混合，37℃溫育15min。準(zhǔn)確吸取0.5ml溶液與25uldtnb(20mm甲醇溶液)混合，測(cè)量412nm下的吸收。0.1～1.2mg/mldtt工作曲線按上法測(cè)量得到。濃度為0.5、1、5、10、50、100μg/ml的虎杖苷溶液與pm2.5提取物混合，其它操作同上，計(jì)算pm2.5消耗的dtt，換算為pm2.5的氧化勢(shì)。3.2數(shù)據(jù)采用ddt分光光度法測(cè)定的虎杖苷氧化活性值見表4和圖1，隨著虎杖苷濃度的增加，pm2.5的氧化活性顯著降低。表4.虎杖苷氧化活性值氧化活性值虎杖苷的濃度(μg/ml)-0.004041000.08712500.13371100.1553450.1865910.23140.5實(shí)驗(yàn)例4、sd大鼠染毒后呼吸功能改善實(shí)驗(yàn)4.1方法：采用hope-med8052粉塵類口鼻動(dòng)式染毒設(shè)備模擬大氣污染環(huán)境，構(gòu)建細(xì)顆粒物慢性染毒大鼠模型。具體制備過程如下：spf級(jí)sd大鼠(180～200g)，口鼻部暴露于染毒艙內(nèi)，染毒倉(cāng)設(shè)有一個(gè)進(jìn)氣系統(tǒng)和排氣系統(tǒng)。將適量細(xì)顆粒物放入設(shè)備藥粉盒中，通過進(jìn)氣系統(tǒng)霧化至整個(gè)染毒艙，通過采樣系統(tǒng)計(jì)算細(xì)顆粒物濃度及染毒劑量，并測(cè)定染毒狀態(tài)下可吸入顆粒物的粒徑分布。染毒同時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，每天給藥1次，虎杖苷給藥劑量為50mg/kg，給予連續(xù)染毒與給藥至4周、8周。染毒期結(jié)束前一日禁食，戊巴比妥鈉(40mg/kg,i.p.)麻醉，放血處死動(dòng)物，收集大鼠血液、肺泡灌洗液和肺組織。檢測(cè)指標(biāo)包括臨床一般癥狀觀察、清醒大鼠肺功能的測(cè)定(采用emka動(dòng)物肺功能監(jiān)測(cè)系統(tǒng))、血液生化指標(biāo)測(cè)定、呼吸道刺激性觀察、呼吸系統(tǒng)臟器系數(shù)測(cè)定、組織病理學(xué)觀察、灌洗液中白細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)測(cè)定，以及血清、肺組織樣本和灌洗液中的氧化損傷指標(biāo)和炎性因子進(jìn)行檢測(cè)，考察大鼠口鼻部吸入暴露模型中細(xì)顆粒物對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)的急慢性損傷。4.2動(dòng)物：spf級(jí)sd大鼠(180～200g，訂購(gòu)時(shí))，48只，購(gòu)自北京維通利華生物。4.3具體數(shù)據(jù)；4.3.1虎杖苷對(duì)pm2.5所致大鼠整體毒性的保護(hù)作用(1)體重連續(xù)8周測(cè)定大鼠體重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8周觀察期結(jié)束時(shí)，各組大鼠體重分別增長(zhǎng)了84.4％(對(duì)照組，control)、62.9％(染毒組，pm2.5)和72.2％(給藥組，pm2.5+pd)。說明pm2.5暴露明顯抑制體重增長(zhǎng)(表5)，且從暴露第一周起至結(jié)束均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而給藥組大鼠體重略高于染毒組，說明虎杖有效部位對(duì)pm2.5引起的大鼠體重變化有一定程度的改善作用。表5虎杖苷對(duì)pm2.5所致大鼠體重改變的改善作用*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比。(2)臟器系數(shù)由表6可知，暴露4周時(shí)各組大鼠主要臟器系數(shù)并無明顯改變，而8周可觀察到染毒大鼠肺和腦體系數(shù)明顯升高，給藥組更接近于正常值。說明肺和腦可能更易受pm2.5的影響，而虎杖苷可適度減輕這一毒性效應(yīng)。表6虎杖苷對(duì)pm2.5所致大鼠臟器系數(shù)改變的改善作用*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比。4.3.2虎杖苷對(duì)大鼠呼吸功能的改善作用功能指標(biāo)可判斷空氣細(xì)顆粒物所引起肺功能受損的氣道通暢性、呼吸肌肉力量、肺組織彈性、通氣功能和儲(chǔ)存能力的狀態(tài)。本研究對(duì)大鼠通氣功能進(jìn)行了測(cè)定。由表7可知，4周起pm2.5導(dǎo)致肺功能流量指標(biāo)最大吸氣流量、最大呼氣流量、呼氣中流量的降低，并持續(xù)至8周，反映通氣功能和/或氣道阻力升高?；⒄溶湛擅黠@改善pm2.5所致的作用，使上述指標(biāo)接近正常水平。從表8可知，sd大鼠連續(xù)吸入空氣細(xì)顆粒物2周起，pm2.5導(dǎo)致潮氣量和呼氣量呈現(xiàn)時(shí)間依賴性降低，呼吸的容積量明顯下降。吸入細(xì)顆粒物4周開始，每分通氣量降低并持續(xù)至8周，表明肺通氣功能儲(chǔ)備量亦降低?；⒄溶兆饔每擅黠@改善上述指標(biāo)，接近正常水平。結(jié)果說明肺功能的儲(chǔ)氣功能受到損傷，虎杖苷可顯著提升連續(xù)吸入細(xì)顆粒物造成的大鼠肺功能中與容量相關(guān)指標(biāo)的減低。由表9可知，8周時(shí)可觀察到模型組呼氣時(shí)間和放松時(shí)間也明顯升高，而pd給藥后與對(duì)照組更為接近。說明當(dāng)模型組大鼠與流量和容量相關(guān)的肺功能指標(biāo)受到了顯著抑制后，動(dòng)物必須通過延長(zhǎng)呼氣時(shí)間與放松時(shí)間才能維持相對(duì)需要的肺功能，而連續(xù)服用虎杖苷4周和8周，在顯著提升改善連續(xù)吸入細(xì)顆粒物造成的大鼠肺功能中與容量和容量相關(guān)指標(biāo)的減低的同時(shí)，也可以適當(dāng)降低模型組增加的時(shí)間指標(biāo)，具有一定的改善作用。本研究的結(jié)果說明，吸入pm2.5導(dǎo)致大鼠呼吸流量、容量和時(shí)間相關(guān)的指標(biāo)呈時(shí)間依賴性改變，肺功能的正常通氣功能受到了損傷。連續(xù)服用虎杖提取物2周至8周具有顯著的改善作用，說明虎杖苷對(duì)空氣細(xì)顆粒物造成的大鼠肺功能損害具有顯著的保護(hù)作用。表7虎杖苷對(duì)pm2.5導(dǎo)致肺功能流量指標(biāo)改變的改善作用*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比；#p<0.05，##p<0.01,與pm2.5組相比。表8虎杖苷對(duì)pm2.5導(dǎo)致肺功能容量指標(biāo)改變的改善作用*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比；#p<0.05，##p<0.01,與pm2.5組相比。表9虎杖苷對(duì)pm2.5導(dǎo)致肺功能時(shí)間指標(biāo)改變的改善作用*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比。4.3.3病理組織學(xué)檢查組織病理學(xué)結(jié)果顯示，pm2.5吸入會(huì)引起大鼠肺巨噬細(xì)胞增多、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡間質(zhì)增厚，連續(xù)暴露8周產(chǎn)生的病理改變明顯強(qiáng)于4周(圖2)。給藥4周時(shí)，巨噬細(xì)胞略有降低、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡間質(zhì)增厚減輕；給藥8周雖有巨噬細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但值得注意的是全部大鼠未見肺泡間質(zhì)增厚，與模型組比較差異顯著。4.3.4虎杖苷減輕pm2.5導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與肺蛋白泄露為了確定虎杖苷對(duì)pm2.5對(duì)肺氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，我們?cè)诖笫筮B續(xù)4周、8周吸入空氣細(xì)顆粒物染毒的試驗(yàn)中，對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(mda)水平、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)和超氧化物歧化酶(sod)活力以及肺泡灌洗液中總蛋白(tp)含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸入pm2.5大鼠肺泡灌洗液(balf)mda水平呈時(shí)間依賴性增高(表10)，8周時(shí)肺內(nèi)gsh-px活力顯著降低(表11)，表明隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，氧化應(yīng)激損傷加重；給藥能明顯降低mda水平(p<0.01)，升高gsh-px活力。另一方面，血清中pm2.5作用后mda水平4周明顯升高，且虎杖苷作用明顯，8周機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)(表10)；虎杖苷可顯著提高機(jī)體抗氧化酶gsh-px和sod活力(表11，12)。此外，為了闡明氧化應(yīng)激損傷積累，我們測(cè)定了大鼠balf中tp含量(表13)。與對(duì)照組相比，pm2.5引起大鼠balf中tp泄露呈時(shí)間依賴性增高，而給藥組的tp含量相比于模型組在數(shù)值上有降低。上述結(jié)果均說明連續(xù)服用虎杖苷4周和8周，可以有效提高機(jī)體抗氧化損傷能力，降低空氣細(xì)顆粒物造成的模型大鼠肺氧化應(yīng)激和蛋白漏出。表10.balf與血清中mda水平結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組平均值的倍數(shù)表示，*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比；##p<0.01,與pm2.5組相比。表11.肺與血清中g(shù)sh-px活力水平結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組平均值的倍數(shù)表示，#p<0.05，與pm2.5組相比。表12.血清中sod活力水平結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組平均值的倍數(shù)表示，*p<0.05，與對(duì)照組相比；#p<0.05，與pm2.5組相比。表13.balf中總蛋白含量結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組平均值的倍數(shù)表示，*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比。4.3.5虎杖苷減輕pm2.5所致肺部炎癥pm2.5連續(xù)暴露8周會(huì)引起大鼠肺白細(xì)胞(wbc)、淋巴細(xì)胞(lym)、單核細(xì)胞(mon)、中性粒細(xì)胞(neut)、嗜酸性粒細(xì)胞(eos)和嗜堿性粒細(xì)胞(bas)數(shù)明顯增高(表14)。與染毒組相比，給藥使wbc、mon、bas顯著降低，lym、neut和eos雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但數(shù)值上亦低于pm2.5暴露大鼠。結(jié)果說明虎杖苷能明顯降低pm2.5引起的肺部炎細(xì)胞數(shù)，減輕炎癥反應(yīng)。表14給藥8周balf中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(109/l，*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比；#p<0.05，##p<0.01,與pm2.5組相比。4.3.6虎杖苷調(diào)節(jié)pm2.5所致的肺神經(jīng)酰胺代謝異常脂質(zhì)代謝紊亂與炎癥反應(yīng)有關(guān)。pm2.5吸入染毒引起大鼠肺和血清中多種神經(jīng)酰胺代謝異常(圖3)，觀察到血清和肺均有脂質(zhì)明顯改變，并且隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)脂代謝紊亂加重。給藥組4周和8周均觀察到與pm2.5組相反的改變，特別是血清中多項(xiàng)神經(jīng)酰胺水平趨向于接近對(duì)照組，表明虎杖苷抑制了pm2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果表明，pm2.5誘發(fā)大鼠與炎癥反應(yīng)相關(guān)的脂質(zhì)代謝異常，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，毒性作用也隨之增大?；⒄溶赵谌径境跗诟深A(yù)能明顯改善脂質(zhì)代謝作用，然而毒性作用增大后藥物干預(yù)作用則減弱。4.3.7虎杖苷調(diào)節(jié)pm2.5所致的炎癥相關(guān)基因表達(dá)改變?cè)诒狙芯恐校覀兺ㄟ^測(cè)定肺組織炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵mrna以更清楚地描述pm2.5所致機(jī)體炎癥反應(yīng)應(yīng)答。pm2.5導(dǎo)致肺炎癥因子tnf-αmrna表達(dá)明顯升高，而虎杖苷作用能顯著降低其表達(dá)(表15)，該作用4周強(qiáng)于8周。pm2.5吸入染毒4周誘導(dǎo)肺內(nèi)前炎性細(xì)胞因子il-1βmrna表達(dá)，虎杖苷組從數(shù)值上低于染毒大鼠，8周各組雖無顯著差異，但數(shù)值上依然低于染毒大鼠。此外，pm2.5暴露4周引起的炎癥抑制因子il-10mrna表達(dá)水平降低，而虎杖苷能明顯升高il-10；而8周這種作用有所降低。上述結(jié)果說明，染毒初期虎杖苷能顯著降低pm2.5引起的肺部炎癥反應(yīng)。表15虎杖苷和pm2.5對(duì)肺部炎癥因子表達(dá)的影響*p<0.05，**p<0.01,與對(duì)照組相比；#p<0.05，##p<0.01,與pm2.5組相比。當(dāng)前第1頁12