專利名稱:β-內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因其表達(dá)產(chǎn)物其組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及抗生素耐藥酶基因的分離,其融合基因的制備,及耐藥酶基因及融合基因表達(dá)產(chǎn)物的分離,含有該耐藥酶蛋白及融合蛋白的組合物,及其在醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用。具體的,本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺酶,氨基糖苷鈍化酶的編碼基因的分離,β-內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因的制備,及其表達(dá)產(chǎn)物的分離,含有該耐藥酶蛋白融合蛋白的組合物,及其在醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用,涉及抗生素治療過程中,保護(hù)腸道、陰道、口腔、呼吸道等微生態(tài)區(qū)域的穩(wěn)定性,消除特定環(huán)境,如醫(yī)療場(chǎng)所,藥廠中藥物的污染,以及作為動(dòng)物源食品的預(yù)處理添加劑,以降解其中所含有的抗菌藥物。更具體的,本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺酶,氨基糖苷乙?;D(zhuǎn)移酶的編碼基因的分離,β-內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷乙?;D(zhuǎn)移酶融合基因的制備,該基因及其融合基因表達(dá)產(chǎn)物的分離,含有該耐藥酶蛋白及融合蛋白的組合物及其在醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用。具體而言,保護(hù)微生態(tài)區(qū)域的正常微生態(tài)菌群(如陰道、腸道、口腔等)不被治療藥物所殺滅、避免微生態(tài)菌群失調(diào)所致的抗菌素伴聯(lián)性疾病(如偽膜性腸炎、陰道炎、口腔炎以及其它亞臨床性疾病),并防止因藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株、以及其它毒副作用的發(fā)生;對(duì)某些特定環(huán)境(如醫(yī)療場(chǎng)所、藥廠等)中殘留的抗菌藥物進(jìn)行降解與清除,消除抗菌藥物所造成的化學(xué)性與生物性污染(如環(huán)境耐藥菌的增加與傳播等),同時(shí),還包括以上述酶制劑作為動(dòng)物源食品的預(yù)處理添加劑,以降解其中所含有的抗菌藥物(如人工飼養(yǎng)的動(dòng)物源食品的預(yù)處理等)。
背景技術(shù):
1、機(jī)體微生態(tài)菌群及其耐藥性正常微生物群寄居于機(jī)體的體表與體腔內(nèi),形成了完整的微生態(tài)體系(Microeologic system)。
抗生素治療已是最常用的醫(yī)療防治措施。但是在這一過程中,抗菌藥物的代謝是全身性的,即腸道、陰道、口腔、呼吸道等微生態(tài)區(qū)域也有足以抑制或殺滅其敏感菌株的藥物濃度。這些防治藥物同樣能夠大量抑制或殺滅上述區(qū)域正常的非致病性菌群,從而導(dǎo)致局部或全身的微生態(tài)平衡失調(diào),誘發(fā)各種各樣的抗菌素伴聯(lián)性疾病如艱難芽孢梭菌(Clostridium difficile)過度繁殖引發(fā)的偽膜性腸炎、抗菌素伴聯(lián)性腹瀉、陰道炎和某些亞臨床性疾病等。這些非感染部位對(duì)抗菌素敏感的菌群被大量地殺滅,留下了耐藥性菌群,今后一旦發(fā)生內(nèi)源性感染,其治療難度的增加是無法預(yù)期的,這是目前嚴(yán)重困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一。簡(jiǎn)言之,在以抗菌素進(jìn)行預(yù)防和治療期間,抗菌藥物對(duì)非感染部位的微生態(tài)菌群既有大量殺滅而誘發(fā)各種并發(fā)癥的危險(xiǎn),也有使這些區(qū)域微生物菌群耐藥性大幅度增加的作用。
二.環(huán)境微生態(tài)菌群及其耐藥性外環(huán)境的微生態(tài)菌群構(gòu)成十分復(fù)雜,不同區(qū)域存在構(gòu)成各異的微生態(tài)環(huán)境,其微生物種群的組成和生物學(xué)特征不盡相同。例如,在醫(yī)療和藥廠等特定環(huán)境中的微生物群表現(xiàn)出對(duì)藥物的耐受性高于其它外環(huán)境者,主要原因是由于這些區(qū)域的抗菌藥物殘留量高于其它環(huán)境。防止醫(yī)院內(nèi)感染和減少特定環(huán)境中藥物的污染已成為全球性的公共衛(wèi)生和環(huán)保問題。
與環(huán)境相關(guān)的如食品、飼料等也與機(jī)體和環(huán)境微生態(tài)菌群的失調(diào)與耐藥性形成有著密切的關(guān)系,例如,在人工飼養(yǎng)各類動(dòng)物(如禽類、豬、牛、羊、魚、鱉、蝦、蟹等)的飼料中,大多具有較高含量的不同抗菌藥物,因此,這些動(dòng)物的排泄物中含有大量的耐藥性微生物菌群與抗菌藥物,既對(duì)環(huán)境造成了生物性和化學(xué)性污染、也引發(fā)了環(huán)境微生態(tài)菌群中的耐藥性菌株大量增加,再者,這些飼養(yǎng)性動(dòng)物一旦加工成食品,因其具有較高含量的抗菌藥物,對(duì)人體的微生態(tài)菌群也構(gòu)成了平衡失調(diào)和耐藥性菌株增加的潛在威脅。所以,各種食品、飼料的抗菌藥物殘留量控制,已是發(fā)達(dá)國家制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要指標(biāo)。
三.抗生素耐藥酶及其對(duì)于抗生素分子的失活作用然而,任何一種抗生素使用不久,針對(duì)此種抗生素的耐藥機(jī)制隨即出現(xiàn)。其中耐藥酶是主要機(jī)制。
抗菌素耐藥酶是以其功能定義的各種酶的統(tǒng)稱,通過水解、酯化、乙?;?、磷?;?、核苷化等作用,使抗菌藥物分子失去抗菌活性。這類酶可以由質(zhì)粒介導(dǎo)和染色體編碼,具有不同的基因型,同一菌體內(nèi)可以同時(shí)存在不同機(jī)制的編碼或介導(dǎo)酶,可以是位于菌細(xì)胞外層周質(zhì)區(qū)的“胞內(nèi)酶”,也可以是排泌至菌細(xì)胞外的“胞外酶”。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌素耐藥酶主要有對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物有滅活作用的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase,BLA),對(duì)氨基糖苷類藥物(Aminoglycosides)有滅活作用的某些鈍化酶(modifyingenzymes,AME)、如乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyltransferases,AAC)、核苷轉(zhuǎn)移酶(adenylyltransferases或nucteolidyl transferases,AAD)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(Phosphotransferases,APH),對(duì)氯霉素有滅活作用的乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chloramphenicol acetyltransferases,CAC);對(duì)紅霉素(Erythromycin)、林可霉素(Lincomycin)等具有滅活作用的酯化酶(Macrolides esterase,MES)等。
四.現(xiàn)有技術(shù)狀況WO 88/07865,A61K 35/74公開了一種藥物組合物,其中加入能夠產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶樣活性物質(zhì)的活大腸埃希菌。該活性菌來源于經(jīng)體外培養(yǎng)的人類糞便分離株,所用活菌在體外培養(yǎng)能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,以保護(hù)腸道正常菌叢不被β-內(nèi)酰胺藥物破壞,該專利忽略了耐藥菌對(duì)人體腸道所造成的耐藥菌增加、耐藥性傳播等生物污染問題。
WO 93/13795,A61K 37/54公開了以天然菌株產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶或酰胺酶(amidases)制成腸溶性緩釋膠囊,在β-內(nèi)酰胺類抗菌素治療期間,用以保護(hù)腸道正常菌群和防止藥物的毒副作用。
發(fā)明內(nèi)容
一.發(fā)明概述及機(jī)制本發(fā)明涉及耐藥性菌株的篩選,特別是具備β-內(nèi)酰胺酶,或氨基糖苷鈍化酶,特別是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的耐藥性菌株的篩選。來自耐藥性菌株的β-內(nèi)酰胺酶或氨基糖苷鈍化酶,特別是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因的分離;含有該編碼β-內(nèi)酰胺酶,及氨基糖苷鈍化酶基因的表達(dá)質(zhì)粒及含有β-內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在受體細(xì)胞中的表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物的純化,該表達(dá)產(chǎn)物及分離自天然抗性株的耐藥酶作為工具酶,在兩種及兩種以上抗菌素的聯(lián)合治療期間,通過耐藥酶對(duì)非感染部位抗菌藥物的水解,乙?;?、磷酸化、核苷化、酯化等作用,使到達(dá)這些部位的抗菌藥物得到減少或清除。應(yīng)用于特定外環(huán)境,以消除其中的抗菌藥物(如醫(yī)療場(chǎng)所、藥廠等特定區(qū)域)。在將含有高劑量抗菌藥物人工動(dòng)物飼料喂養(yǎng)動(dòng)物加工成食品之前,給予抗菌素耐藥酶制劑,以消除其中的抗菌藥物。
本發(fā)明所涉及的抗菌藥物耐藥酶,可以是天然菌或重組的工程菌發(fā)酵液獲取的胞外酶、也可以是發(fā)酵后濃集菌獲取的胞內(nèi)酶;還可以是富含這些耐藥酶的生物性組織或細(xì)胞的提取酶。耐藥酶的表達(dá)菌株(或生物性組織、或細(xì)胞),可以是天然篩選株,也可以是通過基因工程重組或改造株。其編碼基因所表達(dá)的酶既可以是染色體酶(Chromosomal enzymes),也可以是質(zhì)粒酶(Plasmid enzymes),酶蛋白表達(dá)形式可以是單一的純化酶,也可以由重組基因所編碼的融合酶蛋白形式。(一)β-內(nèi)酰胺酶及其作用機(jī)制凡能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N-?;苌锓肿又袃?nèi)酰胺環(huán)的酶,均為β-內(nèi)酰胺酶。目前為止,在β-內(nèi)酰胺酶的家族中已發(fā)現(xiàn)約200余種亞型(種)??砂炊喾N分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其分類,例如,基于底物輪廓或底物譜、基因編碼位置、氨基酸序列、等電點(diǎn)(Isoelectric point,pI)、理化性質(zhì)等分類,各種分類方法均有應(yīng)用和引述,例如,按照其底物譜可分為青霉素酶(penicillnase)、頭孢菌素酶(cephalosporinase)、廣譜酶(broad-spectrum enzymes)和超廣譜酶(extended-spectrum enzymes);Ambler,RP等根據(jù)酶的氨基酸序列差異,將其分為A、B、C、D四種類型Bush,K等根據(jù)底物譜、分子類型、抑制特性等,將其分為1、2、3、4群,其中,2群和3群又可以分成許多亞群,大部分的超廣譜酶屬于2be群和Ambler A類。簡(jiǎn)要表述于表1。
表1 細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶分類方案Bush-被抑制Jacoby- 分子優(yōu)先底物 代表酶Medeiros 類型 CA EDTA群革蘭陰性菌產(chǎn)生的AmpC酶;MIR 1,1C頭孢菌素 --MOX 1,CMY 1,BIL 1 LAT 12aA 青霉素 +- 革蘭陽性菌產(chǎn)生的青霉素酶2bA 青霉素、頭孢菌素 +- TEM 1,TEM 2,SHV 1TEM 3-TEM 29,TEM 42,TEM 43,青霉素、窄譜和超TEM 46-TEM 52,SHV 2-SHV 9,PER2be A 廣譜頭孢菌素及 +-1單酰胺類CTX-M1,產(chǎn)酸克雷伯氏菌K1TEM 3-TEM 41,TEM 44,TEM 45,TRC2br A 青霉素 ±-12cA 青霉素、羧芐西林 +- PSE 1,PSE 3,PSE 42dD 青霉素、氯唑西林 ±- OXA 1-OXA 21,PSE 2(OXA 10)2eA 頭孢菌素 +- 普通變形菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)頭孢菌素酶青霉素、頭孢菌 陰溝腸桿菌的NMC 1和IMI 1,粘2fA +-素、碳青霉烯類 質(zhì)沙雷菌的Sme 1大部份β-內(nèi)酰嗜麥芽假單胞菌的L1,脆弱擬桿菌3aB 胺類、包括碳青霉 -+的CcrA,粘質(zhì)沙雷菌的IMP 1烯類嗜水氣單胞菌的CphA,芳香黃桿菌3bB 碳青霉烯類 -+的PCM 14 ND 青霉素 -? 洋蔥假單胞菌的青霉素酶注CA克拉維酸;EDTA乙二胺四乙酸;ND未測(cè)定;
目前已經(jīng)確認(rèn)的200余種β-內(nèi)酰胺酶中,理化性質(zhì)上表現(xiàn)為分子量范圍約為1.3-5.0萬道爾頓,等電點(diǎn)(pI)范圍約為4.3-0.5,表現(xiàn)出同功酶的特征(如TEM1和TEM2型僅在第39位由賴氨酸取代谷氨酰胺),酶動(dòng)力學(xué)特征(水解底物的速率服從于V=Vmax×[S]/Km+[S]),以及酶抑制劑特征等。(二)氨基糖苷類抗菌素及其耐藥酶氨基糖苷類抗菌素的分子結(jié)構(gòu)中都有一個(gè)氨基環(huán)醇和一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基糖分子,由配糖鍵相連。該類藥物可由微生物發(fā)酵獲取,如鏈霉菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的鏈霉素、小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)生的慶大霉素等等,也有化學(xué)合成的如卡那霉素的半合成衍生物丁胺卡那霉素(Amikacin)等,臨床廣泛應(yīng)用的達(dá)數(shù)十種之多,如鏈霉素(Streptomycin)、卡那霉素(Kanamycin)、慶大霉素(Gentamicin)、妥布霉素(Tobramycin)、丁胺卡那霉素(Amikacin)、新霉菌(Neomycin)、核糖霉素(Ribostamycin)、巴龍霉素(Paromomycin)、福提霉素(Fortimicin)、地貝卡星(Dibekacin)、異帕米星(Isepamicin)、達(dá)地米星(Dactimicin)、小諾霉素(Micronomicin)、大觀霉素(Spectinomycin)等等。這類抗菌素的性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣,抗菌機(jī)制是作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體,抑制蛋白質(zhì)合成,既有抑菌作用,又有強(qiáng)大的殺菌作用。這類藥物又稱為靜止期殺菌劑。
在微生物對(duì)該類藥物的耐藥性機(jī)制中,產(chǎn)生鈍化酶是重要原因,主要有三類酶,每類酶又包括多種異構(gòu)酶,總數(shù)已高達(dá)數(shù)十種之多。這些酶在底物譜(或底物輪廓)、pI、分子量、酶活中心的氨基酸序列、編碼基因等方面存在一定的差異,但是,在功能上均是通過鈍化氨基糖苷類分子中的游離羥基或游離氨基而使藥物分子失去抗菌活性,表現(xiàn)為乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)-使藥物分子中的游離氨基乙酰化,核苷轉(zhuǎn)移酶(AAD)-使藥物分子中的游離羥基核苷化,磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)-使藥物分子中的游離羥基磷酸化。氨基糖苷類藥物主要鈍化酶的種類和底物譜見表2,并將上述兩類耐藥酶的機(jī)制綜述于表3
表2主要氨基糖苷類鈍化酶的種類及其作用底物鈍化酶種類酶標(biāo)記(異構(gòu))底物譜乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(2’) 慶大霉素、妥布霉素、奈替米星AAC(6’) 卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、奈替米星AAC(3) 慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、西索米星核苷轉(zhuǎn)移酶AAD(4’) 妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素AAD(2”) 慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、西索米星AAD(3”) 鏈霉素、大觀霉素AAD(6) 鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3’)-I,II, 卡那霉素、新霉素IIIAPH(3”) 鏈霉素APH(2”) 慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、西索米星APH(5”) 核糖霉素APH(6) 鏈霉素APH(2’) 慶大霉素、丁胺卡那霉素表3 主要抗菌藥物的耐藥性機(jī)制藥物類型 主要耐藥機(jī)制 耐藥酶舉例耐藥酶滅活 β-內(nèi)酰胺酶類,如青霉素β-內(nèi)酰胺類青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的低親 酶、頭孢菌素酶、廣譜酶、
合力 超廣譜酶等。
外膜孔蛋白(通道蛋白)變異耐藥酶滅活 乙酰轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷類核糖體(靶位)耐受 磷酸轉(zhuǎn)移酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)不當(dāng) 核苷轉(zhuǎn)移酶等二.發(fā)明詳述菌株本發(fā)明的一方面提供了具有耐藥性的菌株。
發(fā)明人從臨床樣本獲取的大腸埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、銅綠假單胞菌(P.aeruginose)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、弗勞地枸椽酸菌(C.freundii)等二十余株多重耐藥性抗生素抗性菌株中,篩選出具有高表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性或氨基糖苷鈍化酶活性菌株,特別是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的菌株。
多核苷酸(一)本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供編碼β-內(nèi)酰胺酶多肽的多核苷酸,特別是編碼此處命名為ESBL的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述多核苷酸包括一段陳述于SEQ ID NO1,的序列,或者其編碼基本具有β-內(nèi)酰胺酶活性的活性多肽的變體。
SEQ ID NO1的多核苷酸,是來自肺炎克雷伯菌菌株編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)的多核苷酸。
本發(fā)明編碼β-內(nèi)酰胺酶多肽的多核苷酸,例如陳述于SEQ IDNO1的多核苷酸序列,可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法得到,例如使用本發(fā)明的肺炎克雷伯菌菌株細(xì)胞作為起始材料,從細(xì)菌中分離總DNA,用來自部分序列的放射性標(biāo)記的寡聚核苷酸探測(cè)總DNA克隆文庫。然后,通過雜交條件,可以辨別出攜有與探針DNA同源的DNA的克隆。通過使用按多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測(cè)序引物,對(duì)經(jīng)雜交鑒定的單個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,有可能對(duì)多核苷酸序列向兩個(gè)方向進(jìn)行擴(kuò)增,以確定全長基因序列。例如,方便起見,使用由質(zhì)??寺≈苽涞淖冃缘碾p鏈DNA進(jìn)行測(cè)序。Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.和Sambrook等,在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULAR CLONE,A LABORATORYMANUAL),第二版;冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社,冷泉港,紐約(1989)中對(duì)合適的方法進(jìn)行了描述。
此外,陳述于SEQ ID NO1的DNA序列,包含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框架,該蛋白質(zhì)具有陳述于SEQ ID NO2中的大約氨基酸殘基數(shù)目,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地推導(dǎo)其分子量。
本發(fā)明提供的一種分離出的多核苷酸,該多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列組成(a)一種多核苷酸序列,該多核苷酸序列與SEQ ID NO1就SEQ ID NO1全長而言,分別有至少70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選有85%同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,甚至更優(yōu)選至少95%的同一性,更優(yōu)選至少97-99%的同一性或者完全同一;或者(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列,該多肽與SEQ IDNO2的氨基酸序列分別就SEQ ID NO2全長而言有至少70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選至少85%同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,甚至更優(yōu)選至少95%的同一性,更優(yōu)選至少97-99%的同一性或者100%同一。
本發(fā)明提供了一種多核苷酸序列,其全長與SEQ ID NO1的編碼序列(開放閱讀框架)同一。本發(fā)明也提供了一段編碼成熟多肽或者其片段的序列本身,以及閱讀框架中有另一段編碼序列,例如編碼前導(dǎo)序列或者分泌序列,前蛋白質(zhì)序列,或原蛋白質(zhì)序列,或前原蛋白質(zhì)序列的序列的編碼成熟多肽或者其片段的編碼序列。本發(fā)明的多核苷酸也包括至少一段非編碼序列,例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非編碼序列,例如轉(zhuǎn)錄但并不翻譯的序列,終止信號(hào)(例如rho-依賴的終止信號(hào)和rho-不依賴的終止信號(hào)),核糖體結(jié)合位點(diǎn),Kozak序列,穩(wěn)定mRNA的序列,內(nèi)含子,以及多腺苷酸化信號(hào)。
多核苷酸序列也可以包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如,可以編碼一段有助于純化融合多肽的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中,標(biāo)記序列是6xHN標(biāo)記物,有助于純化與之融合的多肽序列。
本發(fā)明的多核苷酸也包括但不局限于,包含結(jié)構(gòu)基因和控制基因表達(dá)的天然結(jié)合序列的多核苷酸。
本發(fā)明還包括這樣的核苷酸序列,其因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼SEQ ID NO2的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶多肽的核苷酸序列,換言之,它可以是一段編碼SEQ ID NO2的多肽的序列,該序列是遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果。
(二)本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供編碼氨基糖苷鈍化酶,特別是乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽的多核苷酸,特別是編碼此處命名為aaC2的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述多核苷酸包括一段陳述于SEQ ID NO3,的序列,或者其變體。
SEQ ID NO3的多核苷酸,是來自大腸埃希菌菌株編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶多核苷酸。
本發(fā)明編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽的多核苷酸,例如陳述于SEQ ID NO3的多核苷酸序列,可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法得到,例如使用本發(fā)明的大腸埃希菌菌株細(xì)胞作為起始材料,從細(xì)菌中分離總DNA,用來自部分序列的放射性標(biāo)記的寡聚核苷酸探測(cè)總DNA克隆文庫。然后,通過雜交條件,可以辨別出攜有與探針DNA同源的DNA的克隆。通過使用按多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測(cè)序引物,對(duì)經(jīng)雜交鑒定的單個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,有可能對(duì)多核苷酸序列向兩個(gè)方向進(jìn)行擴(kuò)增,以確定全長基因序列。例如,方便起見,使用由質(zhì)??寺≈苽涞淖冃缘碾p鏈DNA進(jìn)行測(cè)序。Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.和Sambrook等,在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULAR CLONE,A LABORATORY MANUAL),第二版;冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社,冷泉港,紐約(1989)中對(duì)合適的方法進(jìn)行了描述。
此外,陳述于SEQ ID NO3的DNA序列,包含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框架,該蛋白質(zhì)具有陳述于SEQ ID NO4中的大約氨基酸殘基數(shù)目,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地推導(dǎo)其分子量。
本發(fā)明提供的一種分離出的多核苷酸,該多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列組成(a)一種多核苷酸序列,該多核苷酸序列與SEQ ID NO3就SEQ ID NO3全長而言,分別有至少70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選有85%同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,甚至更優(yōu)選至少95%的同一性,更優(yōu)選至少97-99%的同一性或者完全同一;或者(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列,該多肽與SEQ ID NO4的氨基酸序列分別就SEQ ID NO4全長而言有至少70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選至少85%同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,甚至更優(yōu)選至少95%的同一性,更優(yōu)選至少97-99%的同一性或者100%同一。
本發(fā)明提供了一種多核苷酸序列,其全長與SEQ ID NO3的編碼序列(開放閱讀框架)同一。本發(fā)明也提供了一段編碼成熟多肽或者其片段的序列本身,以及閱讀框架中有另一段編碼序列,例如編碼前導(dǎo)序列或者分泌序列,前蛋白質(zhì)序列,或原蛋白質(zhì)序列,或前原蛋白質(zhì)序列的序列的編碼成熟多肽或者其片段的編碼序列。本發(fā)明的多核苷酸也包括至少一段非編碼序列,例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非編碼序列,例如轉(zhuǎn)錄但并不翻譯的序列,終止信號(hào)(例如rho-依賴的終止信號(hào)和rho-不依賴的終止信號(hào)),核糖體結(jié)合位點(diǎn),Kozak序列,穩(wěn)定mRNA的序列,內(nèi)含子,以及多腺苷酸化信號(hào)。
多核苷酸序列也可以包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如,可以編碼一段有助于純化融合多肽的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中,標(biāo)記序列是6xHN標(biāo)記物,有助于純化與之融合的多肽序列。
本發(fā)明的多核苷酸也包括但不局限于,包含結(jié)構(gòu)基因和控制基因表達(dá)的天然結(jié)合序列的多核苷酸。
本發(fā)明還包括這樣的核苷酸序列,其因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼SEQ ID NO4的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽的核苷酸序列,換言之,它可以是一段編碼SEQ ID NO4的多肽的序列,該序列是遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果。
多肽(一)本發(fā)明一方面提供了肺炎克雷伯菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)多肽,以及其基本具有β-內(nèi)酰胺酶活性的變體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了(a)一種分離出的多肽,或其基本具有β-內(nèi)酰胺酶活性的片段,該多肽包含一段氨基酸序列,這段氨基酸序列與SEQ ID NO2有至少70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選有至少85%同一性,更優(yōu)選有至少90%的同一性,更優(yōu)選至少95%的同一性,最優(yōu)選至少97-99%的同一性或者完全同一;(b)一種由分離出的多核苷酸編碼的多肽,或其基本具有β-內(nèi)酰胺酶活性的片段,該多核苷酸包含一段多核苷酸序列,這段多核苷酸序列與SEQ ID NO1,就SEQ ID NO1全長而言,分別有70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選有至少85%同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,甚至更優(yōu)選至少95%的同一性,更優(yōu)選至少97-99%的同一性或者完全同一;(c)上述多肽的變體,即通過保守氨基酸置換而與原多肽不同的多肽,由此一個(gè)殘基被另一個(gè)具有相似特性的殘基所置換。典型的這種置換發(fā)生在丙氨酸,纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸之間;絲氨酸和蘇氨酸之間;酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間;天冬酰胺和谷氨酰胺之間;以及堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間;或者芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間。
優(yōu)選的片段包括,例如包含部分SEQ ID NO2氨基酸序列或其變體的截?cái)喽嚯模缫幌盗邪被?和/或羧基-末端氨基酸序列的殘基。由宿主細(xì)胞或者在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明多肽的降解形式也是優(yōu)選的。
特別優(yōu)選的是其中的幾個(gè),5-10,1-5,1-3,1-2或1個(gè)氨基酸以任意組合被置換、刪除或者添加的變體。
本發(fā)明的多肽,可以以“成熟的”蛋白質(zhì)形式存在或者以其例如前體形式存在。包含一段額外的氨基酸序列常常是有利的,這種額外的氨基酸序列包括分泌或者前導(dǎo)序列,原序列(pro-sequence)。
本發(fā)明的多肽可以用任何合適的方式制備。這樣的多肽包括分離出的天然存在的多肽,重組產(chǎn)生的多肽,合成產(chǎn)生的多肽,或者這些方法結(jié)合產(chǎn)生的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
其中的幾個(gè),少數(shù),5-10個(gè),1-5個(gè),1-3個(gè),2個(gè),1個(gè)氨基酸或沒有氨基酸,以任意組合被置換、修飾,刪除和/或添加。其中特別優(yōu)選的是不改變ESBL多肽的性質(zhì)和活性的沉默置換、刪除和添加。
(二)本發(fā)明一方面提供了大腸埃希菌菌株的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽,以及其變體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了(d)一種分離出的多肽,或其基本具有氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的片段,該多肽包含一段氨基酸序列,這段氨基酸序列與SEQ IDNO4有至少70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選有至少85%同一性,更優(yōu)選有至少90%的同一性,更優(yōu)選至少95%的同一性,最優(yōu)選至少97-99%的同一性或者完全同一;(e)一種由分離出的多核苷酸編碼的多肽,或其基本具有氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的片段,該多核苷酸包含一段多核苷酸序列,這段多核苷酸序列與SEQ ID NO3,就SEQ ID NO3全長而言,分別有70%同一性,優(yōu)選有80%同一性,更優(yōu)選有至少85%同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,甚至更優(yōu)選至少95%的同一性,更優(yōu)選至少97-99%的同一性或者完全同一;(f)上述多肽的變體,即通過保守氨基酸置換而與原多肽不同的多肽,由此一個(gè)殘基被另一個(gè)具有相似特性的殘基所置換。典型的這種置換發(fā)生在丙氨酸,纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸之間;絲氨酸和蘇氨酸之間;酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間;天冬酰胺和谷氨酰胺之間;以及堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間;或者芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間。
優(yōu)選的片段包括,例如包含部分SEQ ID NO4氨基酸序列或其變體的截?cái)喽嚯模缫幌盗邪被?和/或羧基-末端氨基酸序列的殘基。由宿主細(xì)胞或者在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明多肽的降解形式也是優(yōu)選的。
特別優(yōu)選的是其中的幾個(gè),5-10,1-5,1-3,1-2或1個(gè)氨基酸以任意組合被置換、刪除或者添加的變體。
本發(fā)明的多肽,可以以“成熟的”蛋白質(zhì)形式存在或者以其例如前體形式存在。包含一段額外的氨基酸序列常常是有利的,這種額外的氨基酸序列包括分泌或者前導(dǎo)序列,原序列(pro-sequence)。
本發(fā)明的多肽可以用任何合適的方式制備。這樣的多肽包括分離出的天然存在的多肽,重組產(chǎn)生的多肽,合成產(chǎn)生的多肽,或者這些方法結(jié)合產(chǎn)生的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
其中的幾個(gè),少數(shù),5-10個(gè),1-5個(gè),1-3個(gè),2個(gè),1個(gè)氨基酸或沒有氨基酸,以任意組合被置換、修飾,刪除和/或添加。其中特別優(yōu)選的是不改變AAC多肽的性質(zhì)和活性的沉默置換、刪除和添加。
融合蛋白另一方面,本發(fā)明涉及遺傳工程制備的包含本發(fā)明多肽或者其片段的融合蛋白,這些蛋白質(zhì)可以化學(xué)結(jié)合,也可以作為重組融合蛋白表達(dá),融合蛋白與非融合蛋白相比,可以增加在表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)量。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,該融合蛋白通過遺傳工程制備,具體而言,發(fā)明人構(gòu)建了包含氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的表達(dá)載體,通過將此載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,通過本領(lǐng)域技術(shù)熟練者熟知的方法制備本發(fā)明的重組多肽。
組合物本發(fā)明也涉及這樣的組合物,該組合物包含此處討論的抗生素抗性菌和/或多核苷酸和/或多肽。例如,這種組合物包括,治療有效量的本發(fā)明的抗生素耐藥菌和/或多肽和/或多核苷酸以及可藥用載體或者賦形劑。
本發(fā)明藥物組合物可以以任何有效方便的方式給藥,例如其中包括局部用藥,口服,肛門用藥,陰道用藥,靜脈內(nèi)用藥,腹膜內(nèi)用藥,肌內(nèi)用藥,皮下用藥,鼻內(nèi)用藥或皮內(nèi)用藥途徑,其形式可以是常用的無毒性的藥物上可接受的載體混合制成片劑、丸劑、膠囊、栓劑、溶液、乳劑、混懸劑、注射劑、軟膏、涂抹劑、滴眼液、洗劑、凝膠、霜?jiǎng)┖腿我馄渌m用的劑型等等。這種載體可以包括但是不局限于鹽水,緩沖液,葡萄糖,水,甘油,乙醇和它們的混合物。制劑應(yīng)當(dāng)適合用藥的方式。
本發(fā)明的環(huán)保制劑包括液態(tài)、固態(tài)、粉劑、微膠囊劑、顆粒制劑。就其屬性而言,包括消毒劑、清洗劑等。
本發(fā)明的化合物可以組合藥學(xué)上可接受的緩釋基質(zhì)例如生物可降解性聚合物以形成緩釋制劑。緩釋基質(zhì)選自生物可兼容性材料例如脂質(zhì)體、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(羥基乙酸的聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和羥基乙酸的共聚物)聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、多氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。優(yōu)選的生物可降解性基質(zhì)是聚丙交酯和聚乙交酯之一或者為聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和羥基乙酸的共聚物)。
局部給藥方式包括給藥至皮膚、粘膜和肺以及眼睛的表面。局部給藥的組合物包括吸入劑,可以制備成干粉,所述干粉可以高壓密封,也可以不加壓。如果是對(duì)眼局部給藥,本發(fā)明的化合物在可藥用的眼用載體中釋放,可藥用的眼用載體包括例如軟膏、植物油或膠囊包封材料。
本發(fā)明的化合物可以加壓密封,并含有壓縮氣體例如氮?dú)夂鸵够瘹怏w拋射劑。液化拋射劑基質(zhì)和真正的總組合物優(yōu)選這樣的形式活性成分不在非常大的程度上溶解。該加壓密封的組合物還可以含有表面活性劑例如液體或固體非離子表面活性劑或者可以是固體陰離子表面活性劑。優(yōu)選應(yīng)用鈉鹽形式的固體非離子表面活性劑。
直腸或陰道給藥組合物優(yōu)選栓劑,其制備方式是將本發(fā)明的化合物同合適的非刺激性載體或輔料例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟,它們?cè)谑覝叵聻楣腆w,但在體溫下為液體,因此在直腸或陰道中溶解,釋放出活性化合物。
陰道給藥組合物還優(yōu)選泡騰劑。其制備方式是將本發(fā)明的化合物同合適的非刺激性載體或輔料及發(fā)泡劑,如碳酸氫鈉等在陰道環(huán)境下產(chǎn)生氣泡的藥劑混合。
本發(fā)明的組合物還含有助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、增溶劑和著色劑以及香料。優(yōu)選的,含有酶穩(wěn)定劑。
圖1描述機(jī)體與環(huán)境微生態(tài)菌群的保護(hù)、耐藥性菌群,及其相互之間的關(guān)系。
圖2描述本發(fā)明所涉及的技術(shù)路線。
圖3表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜說明pPROTet.E 6×HN是Clontech公司產(chǎn)品,為融合蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)。Plteto-1雜合型啟動(dòng)子-操縱子;RBS核糖體結(jié)合位點(diǎn);6×HN表位標(biāo)志序列;EK site腸激酶酶切位點(diǎn);T1轉(zhuǎn)錄終止序列;ColE1復(fù)制起始子;t0轉(zhuǎn)錄終止序列;Cmr氯霉素耐藥基因。該系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)具有強(qiáng)效順式作用元件Plteto-1;融合蛋白中的6×HN tag可易被商品化的免疫親和層析試劑分離純化;可利用腸激酶得到天然蛋白;具有Cmr基因。
圖4、表達(dá)產(chǎn)物的SDS凝膠電泳照片。
以下實(shí)例是用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的,這些技術(shù),除了另外詳細(xì)描述的以外,對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是熟知的和常規(guī)的。實(shí)施例是說明性的,但是不限制本發(fā)明。
實(shí)施例11、具有β-內(nèi)酰胺酶活性肺炎克雷伯菌的篩選用E-Test方法(E-試驗(yàn)試劑盒為瑞典AB Biodisc.Co.產(chǎn)品)對(duì)40株β-內(nèi)酰胺酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶陽性的多重耐藥性臨床分離菌株進(jìn)行篩選,從病人樣本分離到肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株,發(fā)酵擴(kuò)增并分離了部份BLA(參考文獻(xiàn)Edited byV.Lorian.Antibioticin Laboratory Medicine.2nd.Williams &Wilkins,Baltimore,1986,陸永綏、陳秀樞等,六種β-內(nèi)酰胺酶定性試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)及其臨床應(yīng)用,中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志1993.16328;孫長貴、陳漢美等,評(píng)價(jià)三種篩選方法檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及其臨床應(yīng)用,中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志1999.22228)),評(píng)價(jià)其底物譜與酶的比活力。結(jié)果證明,同一菌株可以表達(dá)不同的酶型,不同酶型之間的底物譜及其水解能力存在一定的差異。見表6。
表6、四類底物譜命名的β-內(nèi)酰胺酶底物譜與活力底物 青霉素酶 頭孢菌素酶 廣譜酶超廣譜酶Penicillin 2+1+ 3+ 3+Oxacillin1+-1+ 3+Carbenicillin1+-1+ 3+Cephalothin 1+3+ 2+ 2+Cefuroxime - -1+ 2+Cefotaxime - -1+ 2+Moxalactam - -- 2+Aztreonam - -1+ 1+Imipenem - -- 3+注“1+”代表以各種藥物為底物、酶活力近似為1,000 IU/mg酶蛋白;國際單位定義為37℃、pH4.0-8.5的條件下,每分鐘水解或滅活1μmol底物為一個(gè)單位。
實(shí)施例2酶在體內(nèi)滅活β-內(nèi)酰胺藥物及其保護(hù)正常微生物菌群的效力,9只日本大耳白家兔,分三組(3只/組)。空白組不給藥,給予等體積的無菌生理鹽水;對(duì)照組和試驗(yàn)組分別靜脈大劑量(0.3克/kg體重)給予頭孢氨噻肟(Cefotaxime),每日兩次,連續(xù)三天;試驗(yàn)組在使用抗菌素的同時(shí),立即直腸給予β-內(nèi)酰胺酶制劑(為廣譜和超廣譜酶的混合制劑);三組受試兔同樣條件飼養(yǎng)與護(hù)理,于用藥當(dāng)日起,每天采糞樣作腸道厭氧菌總數(shù)和腸桿菌總數(shù)的定量分析,連續(xù)四日;結(jié)果證明試驗(yàn)組與空白組之間菌群總數(shù)定量結(jié)果差異不顯著(P>0.05);而對(duì)照組菌群總數(shù)定量明顯減少,與試驗(yàn)組和空白組相比,差異非常顯著(P<0.01);上述結(jié)果證明,β-內(nèi)酰胺酶混合酶制劑在藥物治療期具有顯著的保護(hù)腸道菌群與微生態(tài)平衡的作用。
實(shí)施例3.具有氨基糖苷類藥物鈍化酶活性的大腸埃希菌菌株的分離用E-Test方法對(duì)40株β-內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷酶陽性的多重耐藥性臨床分離菌株進(jìn)行篩選,從臨床樣本中分離大腸埃希菌菌株,發(fā)酵擴(kuò)增,分離獲取了乙酶轉(zhuǎn)移酶(AAC)、核苷轉(zhuǎn)移酶(AAD)和磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH),對(duì)其體外滅活該類抗菌藥物的能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表7。
表7、三種氨基糖苷類藥物鈍化酶不同型別的底物譜抗 菌 藥物酶型 慶大霉素 卡那霉素妥布霉素 丁胺卡那霉素(Geniamicin)(Kanangcin)(Tobramycin) (Aamikacin)乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(2’) 2+ - + -AAC(6’) - 2++ 2+AAC(3’) 3+ 2+2+ 2+核苷轉(zhuǎn)移酶AAD(4’) - 2+2+ 2+AAD(2”) 2+ 2+2+ ±磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3’) - 2+- +APH(2’) 2+ + - 2+注“1+”代表以各種藥物為底物、酶活力近似為500 IU/mg酶蛋白;單位定義同表6。
實(shí)施例4酶在體內(nèi)滅活氨基糖苷類藥物及其保護(hù)正常微生物菌群的效力,為了評(píng)價(jià)該類酶在體內(nèi)滅活氨基糖苷類藥物的能力,我們以三組酶(AAC、AAD、APH)的混合酶制劑(包括不同類型),對(duì)9只日本大耳白家兔進(jìn)行平行對(duì)照試驗(yàn),分三組(3只/組)。設(shè)空白組不給藥,給予等體積的生理鹽水;對(duì)照組給藥,但不給予酶制劑;試驗(yàn)組給藥后立即直腸給予酶制劑;給予藥物為丁胺卡那霉素(Amikacin)、靜脈給藥,每次2片,劑量為0.3克/kg體重,連續(xù)三天,于用藥當(dāng)日起,每日采集糞樣作腸桿菌總數(shù)定量計(jì)數(shù),連續(xù)四日。結(jié)果證明對(duì)照組與空白組、試驗(yàn)組相比,腸桿菌總數(shù)非常顯著地減少(P<0.01),說明靜脈給藥已導(dǎo)致腸道的腸桿菌被大量被殺滅;而試驗(yàn)組和空白組之間腸桿菌總數(shù)相差不顯著(P>0.05),說明酶制劑對(duì)靜脈用藥后的腸道菌群具有顯著地保護(hù)作用。
實(shí)施例5從耐藥菌肺炎克雷伯菌菌株分離超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBL基因1.從耐藥菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株提取總DNA(參考文獻(xiàn)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》,科學(xué)出版社,199939頁)。
2.用于擴(kuò)增超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)基因的引物的設(shè)計(jì)根據(jù)美國gene bank of 027199 Kebsiella pneumoniae plasmidpkk50-2 EXTEND3ED SPECTRUM BETA-LACTAMATASE(BLAtem-52)genecompletete cds公布的信息,設(shè)計(jì)了以下一對(duì)引物上游引物218-2395’GGT GGTGGCGGCGGATCTAGTATTCAACATTTTCGTGTCG 3’(g gatcc)BamHI中間接頭(link)下游引物1040-10623’CGACTCTATCCACGGAGTGACTA TCTAGAGCA 5’XbaI(t ctaga)其中,下劃線的堿基表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
3.經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)基因取1微克步驟1中獲得的DNA,按照Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.和Sambrook等,在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULAR CLONE,ALABORATORY MANUAL),第二版;冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社,冷泉港,紐約(1989)的方法擴(kuò)增ESBL基因。
實(shí)施例6從大腸埃希菌(Escherichia coli.)菌株分離氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶aacC2-Link基因。
1.從大腸埃希菌(Escheri chia coli.)菌株分離總DNA,2.根據(jù)美國gene bankgi|45769|emb|X54723.1|PRAACC2E.coliR-plasmid aacC2 gene foraminoglycos ide-(3)-N-acetyl transferase設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶aacC2基因的引物aacC2-Link上游引物822-8435’ACGC CATACGCGGAAGGCAATAACGG3’SalI(g tcgac)下游引物1657-16793’CGAGAACGCTCGGAAGTCCAATCCCACCGCCACCTAGACCGCCACCA CCA 5’中間接頭(link) BamHI其中,連接aacC2和ESBL的中間接頭是一含15個(gè)氨基酸的短肽(Gly4Ser)3,在其編碼序列5′GGTGGCGGTGGATCTGGCGGTGGT GGTGGCGGCGGATCT3′中后部。設(shè)計(jì)出一個(gè)BamHI位點(diǎn),(利用簡(jiǎn)并性)aacC2-Link下游引物和ESBL上游引物的合成均起始于此位點(diǎn)4.經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶aacC2-Link基因取1微克步驟1中獲得的DNA,按照Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.和Sambrook等,在分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULAR CLONE,ALABORATORY MANUAL),第二版;冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社,冷泉港,紐約(1989)的方法擴(kuò)增aacC2基因。
實(shí)施例7具有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的融合蛋白的生產(chǎn)1.質(zhì)粒pPaacC2-L的構(gòu)建將aacC2-link的SalI/BamHI酶切產(chǎn)物與pPROTet.E的BamHI/SalI酶切產(chǎn)物(大片段)按正確的讀碼框進(jìn)行連接.
2構(gòu)建質(zhì)粒pPALE將重組質(zhì)粒pPaacC2-L再進(jìn)行BamHI/XbalI酶切,將其大片段與ESBL的BamHI/XbalI酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接,構(gòu)建質(zhì)粒pPALE。
實(shí)施例8融合蛋白的原核表達(dá)將pPALE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌DH5aPRO E.coli(Clontech公司產(chǎn)品)-,以LB+氯霉素(20微克/毫升)進(jìn)行抗性篩選.選獲高效表達(dá)菌,命名為CWL888。通過發(fā)酵、色譜純化(Clontech公司產(chǎn)品TALONTMPurification Kit(#K1253-1)獲得純品(見圖8),純化融合蛋白的分子量為65 KD、等電點(diǎn)為(pI)7.8、氨基酸序列如下述。該重組性融合酶以氨芐青霉素、丁胺卡那霉素為底物的比活分別為≥2,000IU/mg酶蛋白和≥1,000 IU/mg酶蛋白。
實(shí)施例9超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBL基因的測(cè)序測(cè)序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer,以5’&3’PROTetSequencing Primers為測(cè)序引物,序列見SEQ ID No1。
實(shí)施例10AAC基因的測(cè)序測(cè)序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer,5’& 3’PROTetSequencing Primers為測(cè)序引物,序列見SEQ ID No3。
實(shí)施例11本發(fā)明的融合基因的測(cè)序測(cè)序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer,5’& 3’PROTetSequencing Primers為測(cè)序引物,序列見SEQ ID No5。實(shí)施例12.500mg的腸溶性膠囊,每個(gè)膠囊含有融合蛋白(BLA+AAC)4mg胰蛋白酶抑制劑 120mg低聚果糖(FOS)350mg硬脂酸鎂 26mg實(shí)施例13.500mg的陰道泡騰片,每片含有融合蛋白(BLA+AAC)2mg胰蛋白酶抑制劑 18mg硼酸 120mg碳酸氫鈉 60mg低聚果糖(FOS)200mg硬脂酸鎂100mg實(shí)施例14.500mg的陰道泡騰片,每片含有BLA 1mgAME 1mg胰蛋白酶抑制劑 18mg硼酸 120mg碳酸氫鈉 60mg低聚果糖(FOS)200mg硬脂酸鎂 100mg實(shí)施例15.20%微膠囊(microcapsulation)顆粒劑(顆粒直徑1.0-2.5mm),含融合蛋白(BLA+AAC)20g酶蛋白酶抑制劑 30g硬脂酸鎂 50g實(shí)施例16.20%微膠囊(microcapsulation)顆粒劑(顆粒直徑1.0-2.5mm),含AME 20g酶蛋白酶抑制劑 30g硬脂酸鎂 50g實(shí)施例17.20%微膠囊(microcapsulation)顆粒劑(顆粒直徑1.0-2.5mm,含BLA 10gAME 10g酶蛋白酶抑制劑 30g硬脂酸鎂 50g實(shí)施例18.急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)一、材料和動(dòng)物1.受試物實(shí)施例14的陰道泡騰片,樣品為淺乳黃色粉狀。
2.動(dòng)物ICR小白鼠20只,體重18-22g,由昆明醫(yī)學(xué)院省重點(diǎn)天然藥物藥理試驗(yàn)室提供(動(dòng)物合格證號(hào)滇實(shí)動(dòng)證第9806號(hào))。二、方法1.檢驗(yàn)依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》第三版第一分冊(cè)3.4急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。
2.試驗(yàn)方法取20只動(dòng)物,雌雄各半,灌胃前動(dòng)物禁食12h,一次經(jīng)口灌胃,連續(xù)觀察14天,記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。三、試驗(yàn)結(jié)果陰道泡騰片對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果動(dòng)物性別劑量 動(dòng)物數(shù) 死亡動(dòng)物數(shù)死亡率(mg/kg.bw) (只) (只)(%)雌 5000 100 0雄 5000 100 0受試動(dòng)物在觀察期間,未見動(dòng)物有明顯中毒癥狀,未見死亡。半數(shù)致死量LD50>5000mg/kg.bw四、結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)條件下,受試物陰道泡騰片對(duì)受試動(dòng)物小白鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)按急性毒性LD50劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定為實(shí)際無毒。
2.動(dòng)物日本大耳白兔4只,雌雄各半,體重2.4kg-2.8kg,由昆明醫(yī)學(xué)院提供,合格證號(hào)云動(dòng)管第9903號(hào)。二、方法1.檢驗(yàn)依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》第三版第一分冊(cè)3.7眼刺激試驗(yàn)。
2.方法取受試物0.1g濕潤后置于受試動(dòng)物一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi),使眼被動(dòng)閉合4s,用生理鹽水沖洗5min。于滴眼后6h、24h、48h、4d、7d用肉眼觀察動(dòng)物眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷和恢復(fù)情況。另一側(cè)眼作為正常對(duì)照。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰道泡騰片對(duì)大白兔眼睛刺激試驗(yàn)結(jié)果動(dòng)物 觀察 眼刺激性反應(yīng)積分編號(hào) 部位 6h 24h 48h72h 4d 7d樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 01結(jié)膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 02結(jié)膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 03結(jié)膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 04結(jié)膜4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總分4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0各時(shí)間積分指 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0數(shù)染毒后前7天最高積分指數(shù) 1四、結(jié)論在本試驗(yàn)條件下,受試物陰道泡騰片對(duì)大白兔眼刺激試驗(yàn)按眼刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定為無刺激性。
2.動(dòng)物日本大耳白兔4只,雌雄各半,體重2.1kg-2.4kg,由昆明醫(yī)學(xué)院提供,動(dòng)物合格證號(hào)云動(dòng)管第9903號(hào)。二、方法1.檢驗(yàn)依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》第三版第一分冊(cè)3.6皮膚刺激試驗(yàn)。
2.試驗(yàn)前24h,將大白兔背部脊柱兩側(cè)的毛剪掉,去毛范圍約3×3cm2。取受試物0.5g直接涂抹于預(yù)先潤濕的一側(cè)皮膚上。用潔凈紗布覆蓋,再用無刺激性膠布固定。另一側(cè)為空白對(duì)照。4h后取掉紗布,用溫水除去殘留受試物,于除去受試物后1h、24h、48h觀察皮膚局部反應(yīng),進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰道泡騰片對(duì)家兔皮膚一次刺激反應(yīng)評(píng)分
在觀察期間,試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)受試物作用部位未見紅斑,水腫和其它毒性作用。四、結(jié)論在本實(shí)施條件下,受試物陰道泡騰片對(duì)受試動(dòng)物大白兔皮膚刺激試驗(yàn)按皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)判定為無刺激性。實(shí)施例21 小鼠髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)一、材料和動(dòng)物1.受試物實(shí)施例14的陰道泡騰片,樣品為淺乳黃色粉狀。
2.陽性物環(huán)磷酰胺。由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。
3.動(dòng)物昆明種小白鼠,由中科院昆明動(dòng)物研究所提供(動(dòng)物合格證號(hào)滇實(shí)動(dòng)證第9712號(hào))。二、方法1.檢驗(yàn)依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》第三版第一分冊(cè)3.11.4小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)。
2.試驗(yàn)方法,選用體重25-30g小白鼠50只,隨機(jī)分為5組,每組10只,雌雄各半。設(shè)3個(gè)劑量組和陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40mg/kg.bw),采用30h二次灌胃法,于第二次染毒后6h取材,用小牛血清沖洗骨髓腔,常規(guī)制片染色鏡檢,每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)中微核細(xì)胞數(shù),計(jì)算不同性別動(dòng)物微核率。三、試驗(yàn)結(jié)果陰道泡騰片小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果
采用X2檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),各劑量組微核細(xì)胞率與陰性對(duì)照組比較差異無顯著性,p>0.05,各劑量組間無劑量反應(yīng)關(guān)系。四、結(jié)論在本試驗(yàn)條件下,受試物陰道泡騰片對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無致微核作用。
序列表<110>陳秀樞<120>β-內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶基因,其融合基因及表達(dá)產(chǎn)物,其組合物,在醫(yī)學(xué)及環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用<130><140><141>2002/02/11<160>6<170>Patentln Vers.2.0<210>1<211>1620<212>DNA<213>肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)<400>11 ataaaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgctta tttttatagg ttaatgtcat61 gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc121 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg181 gtaaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt ttcgtgtcgc241 ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt301 gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct361 caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac421 ttttaaagtt ctgctatgtg gtgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact481 cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttaag tactcaccag tcacagaaaa541 gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga601 taacactgct gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt661 tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga721 agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gacgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg781 caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat841 ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat901 tgctgataaa tctggagcca gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc961 agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga1021 tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc<210>2<211>268<212>PRT<213>肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)<400>2MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVKYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGASERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW<210>3<211>1620<212>DNA<213>大腸埃希菌(E.coli)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)1 tttggtactc tcagaatacc cttttgagtt cgtttttgtg ccaacagaac agcccgtagg61 taaatctcgg agcatttcag gaagtgtctg tgtgagttga atctgaatggcagttaatat121 tttagtggtc aaggtcttag gcgagttgaa tgcagggcga cctcgttttttggcaggcgg181 ttttacaaca ggagggagaa ctattttctc aacaccttcg cgtgctggaatcatggttgc241 atcacggact aatatgaccg attaacgtat ccgcaagatt ggacttcaccatctgctcat301 gaacgcgagt ggttagttta cgcgctgcaa attcagcaaa aacacggctaaatgtccctt361 cgctgggtag ttttttatac agattgaagc cgcaaattcg ccgcaatctacgatcaactt421 ctaggcgttc aatcaagccc cgtgtggtga cgataccaag ttcagcttttgcaataaaag
481 gcacatgcca aagcgcagcg gtcagcagga ggtcttccca cagcacacccttgatattgg541 tataccaagg attcgatgtc actccactcg agcacacgaa taatgcgttcgagctttgag601 ctgatgccgt cctaaatcgg ctgcgactaa aggaataagt tcgtattgtaaggcttgaaa661 ccgttgtttg agaaaagggc ttaatgtagt attcatgctg tagatgttagggtgttggtt721 tagaagctca ttttaacatc tacaactttt ttcaaaaaat gttaattcaggctgtttgtg781 gagttttgca agtgcctcga tttagaggag atatcgcgat gcatacgcggaaggcaataa841 cggaggcgct tcaaaaactc ggagtccaaa ccggtgacct attgatggtgcatgcctcac901 ttaaagcgat tggtccggtc gaaggaggag cggagacggt cgttgccgcgttacgctccg961 cggttgggcc gactggcact gtgatgggat acgcatcgtg ggaccgatcaccctacgagg1021 agactcgtaa tggcgctcgg ttggatgaca aaacccgccg tacctggccgccgttcgatc1081 ccgcaacggc cgggacttac cgtgggttcg gcctgctgaa tcagtttctggttcaagccc1141 ccggcgcgcg gcgcagcgcg caccccgatg catcgatggt cgcggttggtccactggctg1201 aaacgctgac ggagcctcac aagctcggtc acgccttggg ggaagggtcgcccgtcgagc1261 ggttcgttcg ccttggcggg aaggccctgc tgttgggtgc gccgctaaactccgttaccg1321 cattgcacta cgccgaggcg gttgccgata tccccaacaa acggcgggtgacgtatgaga1381 tgccgatgct tggaagcaac ggcgaagtcg cctggaaaac ggcatcggattacgattcaa1441 acggcattct cgattgcttt gctatcgaag gaaagccgga tgcggtcgaaactatagcaa1501 atgcttacgt gaagctcggt cgccatcgag aaggtgtcgt gggctttgctcagtgctacc1561 tgttcgacgc gcaggacatc gtgacgttcg gcgtcaccta tcttgagaagcatttcggaa1621 ccactccgat cgtgccagca cacgaagtcg ccgagtgctc ttgcgagccttcaggttaga1681 ggccgtcgac aatgataatc tggatcaacg gacctttcgg cgcgggaaagacgacgctcg1741 ctgagcggtt gcgcgatcgg cgttccaaat cgctgatctt tgaccccgaggaaatcgggt1801 tcgttgtgaa agaaacggtc cccatgccgg cgagcggaga ctatcaggatctcctattat1861 gcaattaatc caaaaactgc ccagaaagtt aataatctag aattctttcccttgagtatt1921 caaaggaact tctaataaat attattcaag aaaataaaca atctattcaaaaaattgaag1981 aaatattaca taccataata cctgttcagt tatctgaaga ttctgaaaatgaatatcaac2041 gagtgctgtc aaaatcaata aatgcagcat ttaaaaactg cggagccaaagaaggagaaa2101 ttattcaagg gcaacacata aataagttag tagaatgtct actagaagaattaactcctt2161 ggataaatca taacatcaag aaatagacca ttaattgaac caatttcttaaagttctagt2221 agtcacatct agctgctttg aaatttcaat attccccata ccctgctttt taa<210>4<211>491<212>PRT<213>大腸埃希菌(E.coli)“MHTRKAITEALQKLGVQTGDLLMVHASLKAIGPVEGGAETVVAALRSAVGPTGTVMGYASWDRSPYEETRNGARLDDKTRRTWPPFDPATAGTYRGFGLLNQFLVQAPGARRSAHPDASMVAVGPLAETLTEPHKLGHALGEGSPVERFVRLGGKALLLGAPLNSVTALHYAEAVADIPNKRRVTYEMPMLGSNGEVAWKTASDYDSNGILDCFAIEGKPDAVETIANAYVKLGRHREGVVGFAQCYLFDAQDIVTFGVTYLEKHFGTTPIVPAHEVAECSCEPSG<210>5<211>1748<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<223>斜體下劃線為LinkCATACGCGGAAGGCAATAACGGAGGCGCTTCAAAAACTCGGAGTCCAAACCGGTGACCTATTGATGGTGCATGCCTCACTTAAAGCGATTGGTCCGGTCGAAGGAGGAGCGGAGACGGTCGTTGCCGCGTTACGCTCCGCGGTTGGGCCGACTGGCACTGTGATGGGATACGCATCGTGGGACCGATCACCCTACGAGGAGACTCGTAATGGCGCTCGGTTGGATGACAAAACCCGCCGTACCTGGCCGCCGTTCGATCCCGCAACGGCCGGGACTTACCGTGGGTTCGGCCTGCTGAATCAGTTTCTGGTTCAAGCCCCCGGCGCGCGGCGCAGCGCGCACCCCGATGCATCGATGGTCGCGGTTGGTCCACTGGCTGAAACGCTGACGGAGCCTCACAAGCTCGGTCACGCCTTGGGGGAAGGGTCGCCCGTCGAGCGGTTCGTTCGCCTTGGCGGGAAGGCCCTGCTGTTGGGTGCGCCGCTAAACTCCGTTACCGCATTGCACTACGCCGAGGCGGTTGCCGATATCCCCAACAAACGGCGGGTGACGTATGAGATGCCGATGCTTGGAAGCAACGGCGAAGTCGCCTGGAAAACGGCATCGGATTACGATTCAAACGGCATTCTCGATTGCTTTGCTATCGAAGGAAAGCCGGATGCGGTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCATCGAGAAGGTGTCGTGGGCTTTGCTCAGTGCTACCTGTTCGACGCGCAGGACATCGTGACGTTCGGCGTCACCTATCTTGAGAAGCATTTCGGAACCACTCCGATCGTGCCAGCACACGAAGTCGCCGAGTGCTCTTGCGAGCCTTCAGGTTAG AGTATTCAACATTTTCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGTGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTAAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCTGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGACGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCAGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGAT<210>6<211>583<212>PRT<213>人工序列<223>斜體下劃線為LinkHTRKAITEALQKLGVQTGDLLMVHASLKAIGPVEGGAETVVAALRSAVGPTGTVMGYASWDRSPYEETRNGARLDDKTRRTWPPFDPATAGTYRGFGLLNQFLVQAPGARRSAHPDASMVAVGPLAETLTEPHKLGHALGEGSPVERFVRLGGKALLLGAPLNSVTALHYAEAVADIPNKRRVTYEMPMLGSNGEVAWKTASDYDSNGILDCFAIEGKPDAVETIANAYVKLGRHREGVVGFAQCYLFDAQDIVTFGVTYLEKHFGTTPIVPAHEVAECSCEPS IQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVKYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGASERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW
權(quán)利要求
1.一種β內(nèi)酰胺酶基因,它是SEQ.ID.NO 1,及其能夠編碼具有β內(nèi)酰胺酶活性的多肽的變體。
2.權(quán)利要求1的β內(nèi)酰胺酶基因,它分離自肺炎克雷伯菌菌株。
3.一種氨基糖苷鈍化酶基因,它是SEQ.ID.NO 3,及其能夠編碼具有氨基糖苷鈍化酶活性的多肽的變體。
4.權(quán)利要求3的氨基糖苷鈍化酶基因,它分離自權(quán)利要求大腸埃希菌菌株。
5.一種β內(nèi)酰胺酶,它是SEQ.ID.NO 2,及其具有β內(nèi)酰胺酶活性的多肽的變體。
6.權(quán)利要求5的β內(nèi)酰胺酶,它分離自肺炎克雷伯菌菌株。
7.一種氨基糖苷鈍化酶,它是SEQ.ID.NO 4,及其具有氨基糖苷鈍化酶活性的多肽的變體。
8.權(quán)利要求7的氨基糖苷鈍化酶,它分離自大腸埃希菌菌株。
9.由權(quán)利要求1或2的基因編碼的蛋白,及其具有β內(nèi)酰胺酶活性的多肽的變體。
10.由權(quán)利要求3或4的基因編碼的蛋白,及其具有氨基糖苷鈍化酶活性的多肽的變體。
11.β內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因,它是SEQ ID NO5,或其能夠編碼具有β內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶活性的變體.
12.一種融合蛋白,它由權(quán)利要求11的融合基因編碼,它是SEQ.ID.NO 6。
13.一種多肽,它是權(quán)利要求12的融合蛋白的具有β內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶活性的變體。
14.一種藥物組合物,它含有一種或多種權(quán)利要求5-13之任一的蛋白,及藥學(xué)上可接受的載體。
15.權(quán)利要求14的組合物在制備用于失活β內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素的制劑中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求15的應(yīng)用,該組合物是用于失活β內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素的陰道泡騰片。
17.權(quán)利要求15或16的應(yīng)用,其中,該制劑用于保護(hù)非感染部位的正常微生物菌群免受殺滅。
18.權(quán)利要求15的應(yīng)用,其中,該制劑用于特定環(huán)境中的殘留抗菌藥物的清除。
19.權(quán)利要求15的應(yīng)用,其中,該制劑用于動(dòng)物源食品的預(yù)處理,以降解其中所含的抗生素。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗生素耐藥酶基因的分離,其融合基因的制備,及耐藥酶基因及融合基因表達(dá)產(chǎn)物的分離,含有該耐藥酶蛋白及融合蛋白的組合物,及其在醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用。具體的,本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺酶,氨基糖苷鈍化酶的編碼基因的分離,β-內(nèi)酰胺酶/氨基糖苷鈍化酶融合基因的制備,及其表達(dá)產(chǎn)物的分離,含有該耐藥酶蛋白融合蛋白的組合物,及其在醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P15/02GK1438315SQ02105038
公開日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2002年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月11日
發(fā)明者陳秀樞 申請(qǐng)人:陳秀樞