專利名稱：重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型的建立及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾酶對(duì)抗生素的體外代謝模型，具體地涉及重組氨基糖苷類雙功能修飾酶對(duì)氨基糖苷類抗生素的體外代謝模型及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氨基糖苷類抗生素是一大類在臨床上具有重要意義的純天然或半合成的多價(jià)陽離子化合物。隨著此類抗生素在臨床上的應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)其耐藥性逐漸增強(qiáng)，其主要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生修飾酶，通過O-磷酸化，N-乙?；蚈-腺苷化共價(jià)修飾抗生素，使此類抗生素的抗菌活性大大降低，甚至失效。
氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6′)-APH(2″)是革蘭氏陽性菌(主要是腸球菌和金葡菌)中最常見的修飾酶，它同時(shí)具有乙?；土姿峄D(zhuǎn)移酶活性，使幾乎所有種類的氨基糖苷類抗生素對(duì)含該雙功能酶的菌株高度耐藥，并且使之與青霉素等作用于細(xì)胞壁的抗生素的協(xié)同作用消失。該雙功能修飾酶基因通常與轉(zhuǎn)座子(如糞腸球菌中的Tn5281和金葡菌中的Tn4001)相連，加速耐藥基因在菌種之間的傳播。
對(duì)糞腸球菌和金葡菌中的aac(6′)-aph(2″)基因進(jìn)行的克隆和測序發(fā)現(xiàn)，其開放閱讀框包括1475個(gè)堿基，編碼479個(gè)氨基酸。雙功能修飾酶N端表現(xiàn)乙?；?AAC，aminoglycoside acetyltransferases)活性，C端表現(xiàn)磷酸化酶(APH，aminoglycoside phosphotransferases)活性。Daigle DM的研究發(fā)現(xiàn)，雙功能修飾酶具有強(qiáng)大的底物修飾功能，可通過N-乙?；琌-乙?；騉-磷酸化修飾抗生素，并且磷酸化反應(yīng)可發(fā)生于多個(gè)位點(diǎn)。
常用的檢測氨基糖苷類抗生素被修飾酶修飾的方法有磷酸纖維素試紙粘貼法，偶聯(lián)檢測系統(tǒng)(因氨基糖苷類抗生素大多數(shù)無明顯紫外吸收)，以及采用質(zhì)譜、核磁等分析方法檢測修飾后產(chǎn)物。磷酸纖維素試紙粘貼法需要用到放射性物質(zhì)，毒性大且價(jià)格貴；偶聯(lián)檢測系統(tǒng)因需要偶聯(lián)另一個(gè)反應(yīng)，最終檢測結(jié)果受偶聯(lián)反應(yīng)的影響，此外，如果反應(yīng)發(fā)生在兩個(gè)或多個(gè)部位，產(chǎn)生多個(gè)產(chǎn)物，也無法區(qū)分；而質(zhì)譜、核磁等分析方法需要昂貴的儀器和專業(yè)人員操作，不便于普及，僅適合用于后續(xù)驗(yàn)證階段。高效液相色譜檢測法曾被Lovering AM用于氨基糖苷類乙酰化酶和磷酸化酶的分型。本發(fā)明的發(fā)明人首次提出用高效液相色譜的方法來評(píng)價(jià)氨基糖苷類抗生素的雙功能修飾酶穩(wěn)定性，該方法在國內(nèi)外未見到相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種重組大腸埃希氏菌及由其誘導(dǎo)表達(dá)得到的重組氨基糖苷類雙功能修飾酶。本發(fā)明的又一目的是提供一種重組氨基糖苷類雙功能修飾酶的體外代謝模型，本發(fā)明還公開了這種模型在篩選氨基糖苷類雙功能修飾酶穩(wěn)定性抗生素和氨基糖苷類雙功能修飾酶抑制劑中的應(yīng)用。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明所述的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC1667含有重組質(zhì)粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)，該質(zhì)粒上插有氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)。該菌株的保藏日期為2006年04月05日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號(hào)CGMCC1667。
由本發(fā)明所述的重組大腸埃希氏菌CGMCC1667誘導(dǎo)表達(dá)得到的氨基糖苷類雙功能修飾酶。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，包括以下步驟(1)用重組大腸埃希氏菌CGMCC1667誘導(dǎo)表達(dá)氨基糖苷類雙功能修飾酶，制備酶提取物；(2)酶提取物和氨基糖苷類抗生素在孵育體系中進(jìn)行磷酸化或乙酰化反應(yīng)；(3)取步驟(2)中得到的反應(yīng)混合物用衍生化試劑進(jìn)行衍生化，離心，取上清進(jìn)行高效液相色譜檢測，計(jì)算氨基糖苷類抗生素的被修飾百分率，評(píng)價(jià)其對(duì)雙功能修飾酶的穩(wěn)定性。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，其中氨基糖苷類抗生素包括天然的和半合成的氨基糖苷類抗生素。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，其中步驟(2)中孵育體系為磷酸化反應(yīng)測試組每100μL體系中含1～100μmolTris.Cl(pH7.5～8.0)，0.1～10.0μmol MgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，0.1～10.0μmolATP，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；磷酸化反應(yīng)對(duì)照組每100μL體系中含1～100μmol Tris.Cl(pH7.5～8.0)，0.1～10.0μmol MgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；乙?；磻?yīng)測試組每100μL體系中含1～100μmol Tris.Cl(pH7.0～7.8)，0.1～10.0μmol MgCl2，10～500nmol acetyl CoA，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；乙?；磻?yīng)對(duì)照組每100μL體系中含1～100μmolTris.Cl(pH7.0～7.8)，0.1～10.0μmol MgCl2，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；孵育溫度為30～40℃，孵育時(shí)間為0.5～24小時(shí)。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，其中衍生化試劑選自鄰苯二甲醛、丹磺酰氯、1-氟-2，4-二硝基苯、9-芴基甲基氯甲酸酯、異硫氰酸苯酯中的一種或多種。優(yōu)選地，所述的衍生化試劑為鄰苯二甲醛衍生化試劑。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，其中高效液相檢測條件為色譜柱為C8或C18反相色譜柱(150～250×3.9～4.6mm，4～10μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸＝50～75∶20～45∶5(體積/體積)，其中加入庚烷磺酸鈉1～5g/L，或?yàn)榧状肌?0～500mM醋酸鹽(pH3.0～7.5)＝80～20∶20～80(體積/體積)；流速為0.5～2.0mL/min；柱溫為30～50℃；檢測波長為300～400nm。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，在高效液相色譜檢測后，分別比較磷酸化反應(yīng)測試組和磷酸化反應(yīng)對(duì)照組，乙?；磻?yīng)測試組和乙?；磻?yīng)對(duì)照組，計(jì)算抗生素的被修飾百分率，評(píng)價(jià)氨基糖苷類抗生素對(duì)雙功能修飾酶的穩(wěn)定性。相同條件下，被修飾百分率越高，穩(wěn)定性越差。
在本發(fā)明中，通過如下公式計(jì)算氨基糖苷類抗生素的被修飾百分率
M%=(Ac-At)AC×100%]]>其中M為抗生素的被修飾百分率，Ac為對(duì)照組中測得的抗生素峰面積，At為測試組中測得的抗生素峰面積。
本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型在篩選氨基糖苷類雙功能修飾酶穩(wěn)定性抗生素和氨基糖苷類雙功能修飾酶抑制劑中的應(yīng)用。
(三)有益效果本發(fā)明所述的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型具備以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明應(yīng)用PCR和DNA重組技術(shù)，得到含氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)的重組大腸埃希氏菌，可以快速、大量制備高含量的重組氨基糖苷類雙功能修飾酶，該酶同時(shí)具有乙酰化和磷酸化兩種修飾作用，滿足研究抗生素體外代謝的需要；(2)本發(fā)明建立的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型具有方法簡便、快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，并可區(qū)分原型和代謝產(chǎn)物，根據(jù)抗生素代謝與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以為抗生素結(jié)構(gòu)修飾提供依據(jù)。
(3)本發(fā)明建立的氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型既可用于高通量篩選對(duì)雙功能修飾酶穩(wěn)定的氨基糖苷類抗生素和雙功能修飾酶抑制劑，又可用于評(píng)價(jià)新藥對(duì)雙功能修飾酶的穩(wěn)定性。
本發(fā)明所述的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC1667，保藏日期為2006年04月05日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC1667。


圖1重組質(zhì)粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)的圖譜，其中黑色的部分表示氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)；圖2威大霉素(VDM)磷酸化反應(yīng)測試組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例10，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威大霉素峰，2為威大霉素磷酸化反應(yīng)后的產(chǎn)物峰；圖3威大霉素(VDM)磷酸化反應(yīng)對(duì)照組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例10，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威大霉素峰；圖4威替米星(VTM)磷酸化反應(yīng)測試組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例10，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威替米星峰，2為威替米星磷酸化反應(yīng)后的產(chǎn)物峰；圖5威替米星(VTM)磷酸化反應(yīng)對(duì)照組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例10，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威替米星峰；圖6威大霉素(VDM)乙酰化反應(yīng)測試組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例11，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威大霉素峰，2、3為威大霉素乙?；磻?yīng)后的產(chǎn)物峰；圖7威大霉素(VDM)乙?；磻?yīng)對(duì)照組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例11，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威大霉素峰；圖8威替米星(VTM)乙?；磻?yīng)測試組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例11，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威替米星峰，2、3為威替米星乙?；磻?yīng)后的產(chǎn)物峰；圖9威替米星(VTM)乙?；磻?yīng)對(duì)照組高效液相色譜檢測圖譜，對(duì)應(yīng)實(shí)施例11，其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間，縱坐標(biāo)表示電壓，1為威替米星峰。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)的克隆(1)從臨床分離E.faecalis HH22中提取總DNA將E.faecalis HH22接種于含15μg/mL慶大霉素的腦心湯培養(yǎng)基中，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，離心2.5mL菌液富集菌體，用500μLSTE洗滌沉淀2次，而后加入500μL STE重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度2mg/mL，37℃保溫1h，然后加入250μL的2％SDS溶液，振蕩混勻，加入終濃度為200μg/mL的蛋白酶K溶液，55℃溫浴30min，酚/氯仿/異戊醇抽提至無變性蛋白存在。上清加入1/10體積的3M NaAc、等體積異丙醇，常溫下沉淀基因組DNA。
(2)PCR擴(kuò)增目的基因?qū)⒉襟E(1)所獲得的E.faecalis HH22的基因組DNA作為PCR的模板。根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中雙功能修飾酶基因的序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)引物引物15’-TCCCAT ATG AAT ATA GTT GAA ATG-3’；引物25’-CCT CGA GAT CTT TATAAG TCC TTT-3’，擴(kuò)增得到雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)。
實(shí)施例2目的DNA片段的克隆、測序分析(1)將所得的雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)TA克隆于pGEM-T載體用DNA純化試劑盒將實(shí)施例1所獲得的雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)純化，并用Taq酶對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端加A反應(yīng)，然后將加A產(chǎn)物與pGEM-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物。
(2)制備感受態(tài)細(xì)胞挑單菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；將0.5mL過夜培養(yǎng)物接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.3；培養(yǎng)物冰浴10min，4℃、4100rpm離心10min，沉淀用0.6倍體積的冰預(yù)冷的CaCl2洗一次，而后加入0.04倍體積的冰預(yù)冷的CaCl2懸浮，置于冰上待用。
(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞向10μL連接產(chǎn)物中加入100μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴20min，之后42℃水浴熱擊50S，再迅速移至冰浴中冷卻2min，然后加入900μL LB培養(yǎng)基，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)1.5h，取菌液涂布氨芐/IPTG/X-gal平皿，37℃過夜培養(yǎng)，挑取白斑，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。鑒定正確的送測序公司測序。
實(shí)施例3雙功能修飾酶基因蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建(1)目的片段連接入表達(dá)載體利用目的DNA片段克隆時(shí)引入的酶切位點(diǎn)NdeI、XhoI，將其從pGEM-T載體上切下來，連接到經(jīng)相同酶處理后的蛋白表達(dá)載體pET-30a(+)上，轉(zhuǎn)化至實(shí)施例2中所述方法獲得的CaCl2法制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板，挑選陽性克隆，并提取質(zhì)粒酶切鑒定，并送測序公司測序。
(2)轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主用構(gòu)建好的蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)轉(zhuǎn)化用實(shí)施例2所述方法制備的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞；涂布卡那霉素抗性平板，篩選陽性克隆，并提取質(zhì)粒酶切鑒定，得大腸桿菌CGMCC1667。
實(shí)施例4氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物的制備(1)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含有質(zhì)粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)的大腸桿菌CGMCC1667接種于含50μg/mL卡那霉素的2mL TB液體培養(yǎng)基中，37℃活化過夜；按1∶50的比例將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于50mL卡那霉素抗性TB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6，加入終濃度為1mM的IPTG，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)6h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并用SDS-PAGE電泳檢測。
(2)制備酶提取物將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液4℃離心收集菌體，用0.85％NaCl洗滌2次，加入0.4倍體積的冰冷裂解緩沖液[20mM Tris.Cl(pH7.6)，1mM EDTA(pH 8.0)，2mMDTT]懸浮菌體，加入溶菌酶至2mg/mL，冰上放置30min，超聲(超聲1S，間歇4S，共破碎1min，此時(shí)有少量完整細(xì)胞存在)破碎，4℃，12000g×1h離心，上清液即為酶提取物。
實(shí)施例5鄰苯二甲醛衍生化試劑的配制稱量鄰苯二甲醛100mg，用0.5mL甲醇溶解，然后加入0.4M硼酸(調(diào)pH至10.4)9.5mL，巰基乙酸0.2mL，混勻即可。
實(shí)施例6檢測威大霉素(VDM)對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性(1)取實(shí)施例4制備的氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物，與威大霉素(VDM)在如下孵育體系中進(jìn)行磷酸化反應(yīng)磷酸化反應(yīng)測試組(100μL體系)1μmol Tris.Cl(pH7.5)，0.1μmol MgCl2，0.1μmol Na2HPO4，0.1μmol ATP，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；磷酸化反應(yīng)對(duì)照組(100μL體系)1μmol Tris.Cl(pH7.5)，0.1μmol MgCl2，0.1μmol Na2HPO4，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；孵育溫度為30℃，孵育時(shí)間為0.5小時(shí)。
(2)高效液相色譜檢測，計(jì)算抗生素的被修飾百分率取步驟(1)中得到的反應(yīng)混合物100μL，加異丙醇100μL，鄰苯二甲醛衍生化試劑100μL，在25℃衍生化5分鐘，離心，取上清進(jìn)行高效液相檢測。
高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C8反相色譜柱(150×3.9mm，4μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸＝50∶20∶5，加庚烷磺酸鈉1g/L；流速為0.5mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為300nm。
比較磷酸化反應(yīng)測試組和磷酸化反應(yīng)對(duì)照組，用如下公式計(jì)算威大霉素的被修飾百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>結(jié)果被修飾百分率為67.87％。
實(shí)施例7檢測威大霉素(VDM)對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性(1)取實(shí)施例4制備的氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物，與威大霉素(VDM)在如下孵育體系中進(jìn)行乙酰化反應(yīng)乙酰化反應(yīng)測試組(100μL體系)1μmol Tris.Cl(pH7.0)，0.1μmol MgCl2，10nmol acetyl CoA，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；乙酰化反應(yīng)對(duì)照組1μmol Tris.Cl(pH7.0)，0.1μmol MgCl2，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；孵育溫度為40℃，孵育時(shí)間為24小時(shí)。
(2)進(jìn)行高效液相色譜檢測，計(jì)算抗生素的被修飾百分率取步驟(1)中得到的反應(yīng)混合物100μL，加入異丙醇100μL和鄰苯二甲醛衍生化試劑100μL，在25℃衍生化5分鐘，離心，取上清進(jìn)行高效液相色譜檢測。
高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C8反相色譜柱(150×3.9mm，4μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸＝50∶20∶5，加庚烷磺酸鈉1g/L；流速為0.5mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為300nm。
比較乙酰化反應(yīng)測試組和乙?；磻?yīng)對(duì)照組，用如下公式計(jì)算威大霉素的被修飾百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>結(jié)果被修飾百分率為46.32％。
實(shí)施例8檢測奈替米星(NTM)對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性(1)取實(shí)施例4制備的氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物，與奈替米星(NTM)在如下孵育體系中進(jìn)行磷酸化反應(yīng)磷酸化反應(yīng)測試組(100μL體系)100μmol Tris.Cl(pH8.0)，10.0μmolMgCl2，10.0μmol Na2HPO4，10.0μmol ATP，500nmol奈替米星(NTM)，20μL酶提取物；磷酸化反應(yīng)對(duì)照組(100μL體系)100μmol Tris.Cl(pH8.0)，10.0μmolMgCl2，10.0μmol Na2HPO4，500nmol奈替米星(NTM)，20μL酶提取物；孵育溫度為30℃，孵育時(shí)間為10小時(shí)(2)高效液相色譜檢測，計(jì)算抗生素的被修飾百分率取步驟(1)中得到的反應(yīng)混合物20μL，加入異丙醇20μL和鄰苯二甲醛衍生化試劑20μL，在70℃衍生化30分鐘，離心，取上清進(jìn)行高效液相檢測。
高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C18反相色譜柱(250×4.6mm，10μm)；流動(dòng)相為甲醇∶500mM醋酸鈉(pH3.0)＝80∶20；流速為2.0mL/min；柱溫為50℃；檢測波長為400nm。
比較磷酸化反應(yīng)測試組和磷酸化反應(yīng)對(duì)照組，用如下公式計(jì)算奈替米星的被修飾百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>結(jié)果被修飾百分率為18.22％。
實(shí)施例9檢測奈替米星(NTM)對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性(1)取實(shí)施例4制備的氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物，與奈替米星(NTM)在如下孵育體系中進(jìn)行乙酰化反應(yīng)乙?；磻?yīng)測試組(100μL體系)100μmol Tris.Cl(pH7.8)，10.0μmolMgCl2，500nmol acetyl CoA，500nmol奈替米星，20μL酶提取物；乙酰化反應(yīng)對(duì)照組100μmol Tris.Cl(pH7.8)，10.0μmol MgCl2，500nmol奈替米星，20μL酶提取物；孵育溫度為30℃，孵育時(shí)間為10小時(shí)。
(2)高效液相色譜檢測，計(jì)算抗生素的被修飾百分率取步驟(1)中得到的反應(yīng)混合物20μL，加入異丙醇20μL和鄰苯二甲醛衍生化試劑20μL，在70℃衍生化30分鐘，離心，取上清進(jìn)行高效液相檢測。
高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C18反相色譜柱(250×4.6mm，10μm)；流動(dòng)相為甲醇∶500mM醋酸鉀(pH3.0)＝80∶20；流速為2.0mL/min；柱溫為50℃；檢測波長為400nm。
比較乙酰化反應(yīng)測試組和乙?；磻?yīng)對(duì)照組，用如下公式計(jì)算奈替米星的被修飾百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>結(jié)果被修飾百分率為34.58％。
實(shí)施例10威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性比較(1)取實(shí)施例4制備的氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物，分別與威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)在如下孵育體系中進(jìn)行磷酸化反應(yīng)磷酸化反應(yīng)測試組的組成為

磷酸化反應(yīng)對(duì)照組不加ATP，用1.4μL的ddH2O代替。
孵育溫度為37℃，孵育時(shí)間為13h。
(2)高效液相色譜檢測，計(jì)算抗生素的被修飾百分率取步驟(1)中得到的反應(yīng)混合物50μL，加入異丙醇50μL和鄰苯二甲醛衍生化試劑50μL，在60℃衍生化10分鐘，離心，取上清進(jìn)行高效液相檢測。
高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C18反相色譜柱(150×3.9mm，4μm)；流動(dòng)相為甲醇∶50mM醋酸銨(pH5.0)＝60∶40；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；檢測波長為330nm。
比較磷酸化反應(yīng)測試組和磷酸化反應(yīng)對(duì)照組，用如下公式計(jì)算抗生素的被修飾百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>結(jié)果如下

由結(jié)果可見，對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶磷酸化活性的穩(wěn)定性順序?yàn)?
威替米星＞威大霉素。
觀察高效液相檢測的圖譜發(fā)現(xiàn)，威大霉素測試組(附圖2)與對(duì)照組(附圖3)相比，威大霉素峰1顯著降低，并且出現(xiàn)大的磷酸化反應(yīng)后產(chǎn)物峰2，說明威大霉素被磷酸化的百分率大，穩(wěn)定性差；而威替米星測試組(附圖4)與對(duì)照組(附圖5)相比，威替米星峰降低的幅度小，并且只出現(xiàn)了很小的磷酸化反應(yīng)后產(chǎn)物峰2，說明威替米星被磷酸化的百分率很小，穩(wěn)定性好。
實(shí)施例11威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶的穩(wěn)定性比較(1)取實(shí)施例4制備的氨基糖苷類雙功能修飾酶提取物，與威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)在如下孵育體系中進(jìn)行乙酰化反應(yīng)乙?；磻?yīng)測試組的組成為

乙?；磻?yīng)對(duì)照組不加acetyl CoA，用6.5μL ddH2O代替。
孵育溫度為37℃，孵育時(shí)間為13h。
(2)高效液相色譜檢測，計(jì)算抗生素的被修飾百分率取步驟(1)中得到的反應(yīng)混合物50μL，加入異丙醇50μL和鄰苯二甲醛衍生化試劑50μL，在60℃衍生化10分鐘，離心，取上清進(jìn)行高效液相檢測。
高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C18反相色譜柱(150×3.9mm，4μm)；流動(dòng)相為甲醇∶50mM醋酸銨(pH5.0)＝60∶40；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；檢測波長為330nm。
比較乙酰化反應(yīng)測試組和乙?；磻?yīng)對(duì)照組，用如下公式計(jì)算抗生素的被修飾百分率
M%=(Ac-At)AC×100%]]>結(jié)果如下

由結(jié)果可見，對(duì)氨基糖苷類雙功能修飾酶乙?；钚缘姆€(wěn)定性順序?yàn)橥婷仔牵就竺顾亍?br> 觀察高效液相檢測的圖譜發(fā)現(xiàn)，威大霉素測試組(附圖6)與對(duì)照組(附圖7)相比，威大霉素峰1明顯降低，并且出現(xiàn)較大的乙?；磻?yīng)后產(chǎn)物峰2和3，說明威大霉素被乙?；陌俜致瘦^大，穩(wěn)定性較差；而威替米星測試組(附圖8)與對(duì)照組(附圖9)相比，威替米星峰降低的幅度小，并且只出現(xiàn)了很小的乙?；磻?yīng)后產(chǎn)物峰2和3，說明威替米星被乙酰化的百分率小，穩(wěn)定性好。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)<130>重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型及其應(yīng)用<160>1<170>Patent In version 3.3<210>1<211>1440<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1atgaatatag ttgaaaatga aatatgtata agaactttaa tagatgatga ttttcctttg60atgttaaaat ggttaactga tgaaagagta ttagaatttt atggtggtag agataaaaaa120tatacattag aatcattaaa aaaacattat acagagcctt gggaagatga agtttttaga180gtaattattg aatataacaa tgttcctatt ggatatggac aaatatataa aatgtatgat240gagttatata ctgattatca ttatccaaaa actgatgaga tagtctatgg tatggatcaa300tttataggag agccaaatta ttggagtaaa ggaattggta caagatatat taaattgatt360
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權(quán)利要求
1.一種重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC1667，其特征在于它含有重組質(zhì)粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)，該質(zhì)粒上插有氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸埃希氏菌誘導(dǎo)表達(dá)得到的氨基糖苷類雙功能修飾酶。
3.一種重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，它包括以下步驟(1)用權(quán)利要求1所述的重組大腸埃希氏菌誘導(dǎo)表達(dá)氨基糖苷類雙功能修飾酶，制備酶提取物；(2)酶提取物和氨基糖苷類抗生素在孵育體系中進(jìn)行磷酸化或乙?；磻?yīng)；(3)取步驟(2)中得到的反應(yīng)混合物用衍生化試劑進(jìn)行衍生化，離心，取上清進(jìn)行高效液相色譜檢測，計(jì)算氨基糖苷類抗生素的被修飾百分率，評(píng)價(jià)其對(duì)雙功能修飾酶的穩(wěn)定性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模型，其特征在于所述的氨基糖苷類抗生素包括天然的和半合成的氨基糖苷類抗生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模型，其特征在于在步驟(2)中的孵育體系為磷酸化反應(yīng)測試組每100μL體系中含1～100μmol Tris.Cl，0.1～10.0μmolMgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，0.1～10.0μmol ATP，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；磷酸化反應(yīng)對(duì)照組每100μL體系中含1～100μmolTris.Cl，0.1～10.0μmol MgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；乙?；磻?yīng)測試組每100μL體系中含1～100μmol Tris.Cl，0.1～10.0μmol MgCl2，10～500nmol acetyl CoA，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；乙?；磻?yīng)對(duì)照組每100μL體系中含1～100μmol Tris.Cl，0.1～10.0μmol MgCl2，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；孵育溫度為30～40℃，孵育時(shí)間為0.5～24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模型，其特征在于所述的衍生化試劑選自鄰苯二甲醛、丹磺酰氯、1-氟-2，4-二硝基苯、9-芴基甲基氯甲酸酯、異硫氰酸苯酯中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的模型，其特征在于所述的衍生化試劑為鄰苯二甲醛衍生化試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模型，其特征在于步驟(3)中高效液相色譜檢測條件為色譜柱為C8或C18反相色譜柱；流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸＝50～75∶20～45∶5(體積/體積)，其中加入庚烷磺酸鈉1～5g/L，或?yàn)榧状?0～500mM醋酸鹽＝80～20∶20～80(體積/體積)；流速為0.5～2.0mL/min；柱溫為30～50℃；檢測波長為300～400nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模型在篩選氨基糖苷類雙功能修飾酶穩(wěn)定性抗生素和氨基糖苷類雙功能修飾酶抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組大腸埃希氏菌CGMCC1667及由其誘導(dǎo)表達(dá)得到的重組氨基糖苷類雙功能修飾酶，還提供了一種重組氨基糖苷類雙功能修飾酶的體外代謝模型，并公開了這種模型在篩選氨基糖苷類雙功能修飾酶穩(wěn)定性抗生素和氨基糖苷類雙功能修飾酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的模型可同時(shí)研究重組雙功能修飾酶對(duì)抗生素的乙?；土姿峄瘍煞N修飾作用，具有方法簡便、快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，并可區(qū)分原型和代謝產(chǎn)物，既可用于高通量篩選對(duì)雙功能修飾酶穩(wěn)定的新氨基糖苷類抗生素和雙功能修飾酶抑制劑，又可用于評(píng)價(jià)新藥對(duì)雙功能修飾酶的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101078007SQ20061008150
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者游雪甫, 李聰然, 蔣建東, 楊信怡, 洪斌, 王躍明, 肖春玲, 孫承航 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所