本發(fā)明屬于醫(yī)用材料，涉及一種載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白納米人工骨。

背景技術(shù)：

慢性創(chuàng)傷性骨髓炎多為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌感染，這些耐藥細(xì)菌可以在細(xì)胞表面產(chǎn)生多糖蛋白復(fù)合物，形成生物膜包裹細(xì)菌，保護(hù)細(xì)菌。要殺滅保護(hù)在生物蛋白膜內(nèi)的細(xì)菌，到達(dá)骨髓炎病灶的抗生素必須對上述致病細(xì)菌敏感，而且病灶局部抗生素濃度必須高于致病菌最低抑菌濃度許多倍，全身靜脈滴注抗生素難以達(dá)到這樣的治療要求。與此同時，骨髓炎病灶清除后，會殘留留空腔，需要植骨材料填充骨腔。

為了彌補全身用藥的不足，以及同時達(dá)到植骨的作用，各國學(xué)者對載抗生素人工骨進(jìn)行了多年研究。目前臨床應(yīng)用較多的載抗生素人工骨是醫(yī)用型caso4，它由全球最大的骨科生物材料生產(chǎn)公司wright研制，其基礎(chǔ)晶體是α-半水硫酸鈣，水溶性抗生素能夠和它結(jié)合成固體植入物，而不影響抗菌效果。因此臨床上多將萬古霉素或慶大霉素與α-半水硫酸鈣混合，制成載萬古霉素/載慶大霉素硫酸鈣人工骨，廣泛應(yīng)用于治療骨髓炎患者。

但是載萬古霉素硫酸鈣人工骨只針對金黃色葡萄球等革蘭氏陽性菌感染的骨髓炎，載慶大霉素人工骨也只對普通的非耐藥革蘭氏陰性菌感染骨髓炎有效；對于耐藥型大腸桿菌、鮑曼不動桿菌等革蘭氏陰性菌感染的骨髓炎，上述兩種載抗生素人工骨并不敏感，而上述耐藥型革蘭氏陰性菌感染的骨髓炎在臨床上占了將近42％。所以國際上流行通用的載萬古霉素和慶大霉素硫酸鈣人工骨已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了，臨床上治療耐藥型革蘭氏陰性菌感染骨髓炎的需要。為了針對大腸桿菌、鮑曼不動桿菌等耐藥型革蘭氏陰性感染的骨髓炎，國內(nèi)外曾有學(xué)者在硫酸鈣人工骨中加入新型抗生素泰能，即亞胺培南/西司他?。灰驗閬啺放嗄?西司他丁是碳青霉烯類抗生素，它對革蘭氏陰性菌敏感，尤其是對大腸桿菌、鮑曼不動桿菌等骨髓炎中的耐藥菌臨床有效率達(dá)93％。學(xué)者也希望通過在人工骨中加載亞胺培南，達(dá)到治療耐藥型革蘭氏陰性菌感染骨髓炎的目的。但是，將泰能(亞胺培南/西司他丁)加載至硫酸鈣，合成載抗生素硫酸鈣人工骨并不簡單。因為，亞胺培南與α-半水硫酸鈣混合后不能凝固成型，而是變成粉末；而粉末狀載亞胺培南硫酸鈣人工骨放置于患者骨髓炎病灶中，一經(jīng)骨髓腔內(nèi)血液沖刷，立即流失；無法達(dá)到緩釋抗生素，治療骨髓炎的效果。

而且，載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨還有一個致命缺點就是：其人工骨的化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)與人類天然骨組織并不一致，并不能替代自身骨組織植骨。因為，人類自身天然骨組織由有機大分子i型膠原蛋白和無機礦物質(zhì)羥基磷灰石鈣晶體生物礦化組成；羥基磷灰石鈣晶體呈片狀鑲嵌在膠原纖維中，沿著膠原纖維的長軸縱向生物礦化。而美國wright公司所研發(fā)的載抗生素半水硫酸鈣人工骨，其分子方程式為1/2h2o.caso4，只是單純的無機物，不含有有機大分子i型膠原蛋白，更不用說i型膠原蛋白與羥基磷灰石鈣生物礦化的分子結(jié)構(gòu)；無論是其化學(xué)成分，還是分子結(jié)構(gòu)都與天然骨組織相去甚遠(yuǎn)。因此，如何研發(fā)與人類自體骨組織化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)接近的，i型膠原蛋白/羥基磷灰石鈣骨移植材料，成為全世界骨組織工程學(xué)學(xué)者孜孜以求的目標(biāo)。

國外有學(xué)者用皮膚、肌腱等軟組織上的i型膠原蛋白進(jìn)行生物礦化，以合成i型膠原蛋白/羥基磷灰石鈣人工骨材料，但是其生物礦化程度不如人體自身骨組織。因為，雖然骨膠原蛋白與皮膚、肌腱等軟組織上的膠原蛋白同屬于i型膠原蛋白，都由[α1(i)]2α2(i)構(gòu)成，但是每條肽鏈上的氨基酸殘基上卻存在著差異，骨i型膠原蛋白含有大量的磷酸絲氨酸殘基、乳酸根以及谷氨酸殘基；由于鈣的電荷與離子半徑之比較大，易與磷酸絲氨酸的磷酸基氧、羧基谷氨酸的羧基氧，以及乳酸根的糖羥基氧結(jié)合；從而富集高濃度鈣離子，成為羥基磷灰石晶核形成和生長的部位。而肌腱等軟組織上的i型膠原蛋白含這類氨基酸殘基較少，所以用皮膚、肌腱等組織提取的i型膠原蛋白進(jìn)行生物礦化，其膠原內(nèi)的礦化程度也低于天然骨組織。因此本發(fā)明不用肌腱等軟組織上的i型膠原蛋白進(jìn)行生物礦化，而是直接從骨組織中提取i型膠原蛋白，骨膠原蛋白所含有的現(xiàn)成磷酸絲氨酸殘基、乳酸根以及谷氨酸殘基，可以直接為生物礦化提供晶核，從而促進(jìn)膠原的生物礦化。

國際上膠原的提取方法主要有：堿法、酸法、鹽法、酶法。(1)堿法提?。河捎趬A容易造成i型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)上的肽鍵水解，因此得到的水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量較小，甚至是明膠，而非膠原。水解嚴(yán)重時，還會產(chǎn)生d型、l型氨基酸消旋混合物。因為不對稱碳原子經(jīng)過對稱狀態(tài)的中間階段，發(fā)生消旋現(xiàn)象，并轉(zhuǎn)變?yōu)閐型和l型的等物質(zhì)量的混合物。其中，若d型氨基酸多于l型氨基酸，則會抑制l型氨基酸的吸收。而有些d型氨基酸是有毒的，有的甚至有致癌、致畸和致突變作用。因此堿法不適合用于生物醫(yī)用材料的膠原蛋白的提取。(2)鹽法提取：常用的中性鹽有氯化鈉、乙酸鈉、氯化鉀、檸檬酸鹽。而一般情況下，可采用不同濃度的氯化鈉對提取的膠原蛋白進(jìn)行鹽析，以沉淀出不同類型的膠原蛋白。有些中性鹽會降低i型膠原蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性，鹽法提取膠原蛋白也不能保證其三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此這種方法受到一定的限制。(3)酸法提取：就是利用低濃度的酸性條件破壞膠原分子間的希夫堿和鹽鍵，將失去交聯(lián)的膠原分子溶解出來，從而提取膠原。這樣提取的膠原蛋白稱為酸溶性膠原蛋白。常用的酸溶劑集中于乙酸。但是酸處理后膠原的溶解量很少，酸法提取膠原的產(chǎn)率過低，不適合生物醫(yī)用材料的大批量生產(chǎn)。(4)酶法提取：是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶等膠原酶在一定的反應(yīng)條件下提取膠原蛋白，酶只作用于膠原蛋白的非螺旋端肽，不會改變其三螺旋結(jié)構(gòu)，保證了i型膠原分子完整穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。故本發(fā)明用酶法提取骨膠原。

而且從i型膠原蛋白的免疫原性來看，其免疫原性來源于三點，一是α螺旋多肽鏈中脯氨酸-羥脯氨酸-甘氨酸的重復(fù)序列；二是α螺旋多肽鏈三維空間結(jié)構(gòu)；以上兩點各個物種之間差別非常微小，最主要的免疫原性還是來自第三點：i型膠原蛋白分子鏈兩端的非螺旋結(jié)構(gòu)，即-n端殘基和-c端殘基。而酶法提取膠原，恰恰可以水解切除i型膠原蛋白分子鏈兩端的-n端殘基和-c端殘基，大大降低了i膠原蛋白分子的抗原性。尤其是在酸性條件下，用胃蛋白酶處理膠原，不僅使膠原肽鏈的末端非螺旋區(qū)水解，而且還可促使被切除末端肽的膠原分子更加可溶，提高膠原蛋白的產(chǎn)率。所以本發(fā)明選擇在酸性條件下，以胃蛋白酶水解提取i型膠原蛋白，并且選擇以豬股骨皮質(zhì)骨作為i型膠原蛋白的來源，因為豬與人類的各系統(tǒng)器官以及基因組相近，使提取的i型膠原蛋白免疫原性更小。

因此本發(fā)明通過胃蛋白酶，水解豬骨；豬骨酶解成骨膠原蛋白；接著加載泰能(亞胺培南/西司他丁)，然后對骨膠原蛋白進(jìn)行生物礦化，從而形成載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨，以針對骨髓炎耐藥型革蘭氏陰性致病菌的感染，以及植骨的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對目前臨床上應(yīng)用的載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨，其化學(xué)成分和分子機構(gòu)與人類天然骨組織不符；而且無法加載針對耐藥型革蘭氏陰性致病菌敏感的抗生素，亞胺培南/西司他丁。同時，針對目前國際上制備仿生骨的i型膠原蛋白，多從皮膚、肌腱等軟組織中提取，而非真正從骨組織中提取。本發(fā)明通過胃蛋白酶，水解豬骨；豬骨酶解成骨膠原蛋白；接著加載泰能(亞胺培南/西司他丁)，然后將對骨膠原蛋白進(jìn)行生物礦化，從而形成載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨。其化學(xué)成分和分子機構(gòu)與天然骨組織一致，并能釋放出對骨髓炎耐藥型革蘭氏陰性致病菌敏感的抗生素。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白納米人工骨，主要由泰能加載在羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白納米人工骨構(gòu)成，其中羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白納米人工骨為羥基磷灰石晶體沿著骨膠原纖維礦化生長，經(jīng)生物礦化最終形成仿生骨；其中骨膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，即d-band結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步地，泰能與羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白納米人工骨的質(zhì)量比為7～10:100。

進(jìn)一步地，骨膠原纖維與羥基磷灰石晶體的質(zhì)量比為0.5～1:4。

上述載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白納米人工骨，采用以下方法制備而成：

步驟(1)、骨膠原蛋白的制備

將新鮮富含骨膠原蛋白的組織脫脂、脫鈣處理，破碎后得到所需的骨料；

將預(yù)處理后的骨料加入到ph值為3的0.1m醋酸溶液中，酶解得到透明、黏稠的骨膠原蛋白；骨料與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1g：10～20ml；

酶解條件是每克骨料加入200～250mg胃蛋白酶，酶解溫度為30～37℃，酶解時間為30～60天；

步驟(2)、加載泰能：

將步驟(1)獲得的骨膠原蛋白與泰能溶液混合，充分?jǐn)嚢韬笾糜?7℃恒溫箱中，靜置24小時，獲得加載泰能的骨膠原蛋白。

所述的泰能溶液為每0.5～1g泰能與100ml0.9wt％生理鹽水混合而成；

骨膠原蛋白與泰能溶液的體積比為10～9：1；

步驟(3)、骨膠原蛋白膠體的制備：

將步驟(2)獲得的加載泰能的骨膠原蛋白，經(jīng)氨氣擴散1小時，然后再放入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)；交聯(lián)1小時后，骨膠原蛋白自組裝成果凍樣膠體；最后將膠體放置在去離子水中浸泡1小時，接著再反復(fù)沖洗3遍，洗去多余的戊二醛，得到加載泰能的骨膠原蛋白膠體。

加載泰能的骨膠原蛋白與戊二醛的質(zhì)量體積比為1g：10～20ml。

交聯(lián)溫度為20～25℃。

步驟(4)、生物礦化：

將步驟(3)獲得的載泰能的骨膠原蛋白膠體浸泡在礦化液中，進(jìn)行生物礦化，礦化7～9天，從而形成載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨。

礦化液的配置：鈣液25ml倒入燒杯中，滴入paa濃度350ug/ml；滴加1m的hcl，調(diào)節(jié)ph至7.4。然后緩慢滴入磷液25ml，約16滴/分鐘，配置礦化液。

25ml鈣液由以下組分構(gòu)成：10mmcacl2.2h2o、150mmnacl、50mm.tris、0.02wt％nan3；

25ml磷液:6mmna2hpo4；

抑菌圈實驗顯示：將上述制備得到的載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨放置在耐藥型革蘭氏陰性菌大腸桿菌的培養(yǎng)基中，在載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨周圍形成抑菌圈。在模擬體液緩釋實驗中：載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨，緩釋的亞胺培南藥物濃度為1ug/ml,是亞胺培南/西司他丁對大腸桿菌的最低抑菌濃度0.125ug/ml的8倍，遠(yuǎn)大于最低抑菌濃度。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明通過胃蛋白酶，酶解豬骨；使豬骨水解成i型膠原蛋白，此i型膠原蛋白適合羥基磷灰石鈣的生物礦化，而且酶解切除了i型膠原蛋白分子鏈兩端的-n端殘基和-c端殘基，大大降低了i膠原蛋白分子的抗原性。而且載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨，所含的膠原蛋白直接從骨組織提取，而且能組裝成膠原纖維，此膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，即d-band結(jié)構(gòu)；與人類骨組織的i型膠原蛋白纖維的d-band結(jié)構(gòu)一致，并能促進(jìn)生物礦化。

2.人類自身骨組織是由有機大分子i型膠原蛋白和無機羥基磷灰石鈣組成，在分子結(jié)構(gòu)上，羥基磷灰石鈣晶體是以i型膠原蛋白纖維為模板，鑲嵌在膠原纖維分子間隙，沿著膠原纖維的長軸縱向礦化生長。而本發(fā)明，先是合成與人類自身骨組織中i型膠原蛋白纖維的d-band結(jié)構(gòu)一致的，i型膠原蛋白膠體。然后，模擬生物礦化，羥基磷灰石晶體沿著膠原蛋白纖維礦化生長，最終形成生物礦化仿生骨。其化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)與人類自身骨組織一致，可以作為植骨材料，填充骨髓病灶清除后殘留的空腔。

3.針對耐藥型革蘭氏陰性致病菌感染的難治型骨髓炎，將藥敏高度敏感的碳青霉烯類抗生素(亞胺培南/西司他丁)與人工骨結(jié)合；合成載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨。此人工骨可以緩釋出亞胺培南，抑制大腸桿菌等耐藥型革蘭氏陰性致病菌的感染；從而彌補了目前臨床上使用的載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨，不能涵蓋骨髓炎所有菌譜的缺點。

附圖說明

圖1為載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨抑菌實驗結(jié)果；

圖2為載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨的透射電子顯微鏡圖；

圖3為載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨的電子衍射圖像。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的分析。

實施例1：

步驟(1)、骨膠原蛋白的制備

1.1將新鮮豬股骨，去除兩端關(guān)節(jié)的周圍軟組織，截取長骨，再去除骨膜、骨端松質(zhì)骨，刮除骨髓，用水清洗去除骨中大量的脂肪和血紅蛋白，剩余管狀長骨。清洗后的骨料在密閉的脫脂容器中，控制溫度60～65℃，采用石油醚逆流循環(huán)的方式回流3～4h，除去骨料中的油脂。

1.2脫鈣：將步驟1.1處理后的豬骨放入0.5～1mol/l鹽酸中脫鈣，每1g豬骨顆粒，加入10～20ml鹽酸；每隔48～72小時換一次鹽酸，經(jīng)過14～16天脫鈣，骨料軟化，將脫鈣軟化后的骨料再剪成一塊塊小碎片。

1.3脫脂：將碎骨料裝在密閉的脫脂容器中，控制溫度60～65℃，采用石油醚逆流循環(huán)的方式回流3～4h，除去骨料中剩余的油脂，得到脫鈣脫脂的骨料。

1.4酶解：將脫鈣脫脂的骨顆粒，放在ph值＝3的0.1m醋酸溶液中，加入胃蛋白酶。每1g豬骨顆粒，浸泡在20ml醋酸溶液中，加入200～250mg胃蛋白酶；靜置在溫度30～37度的恒溫箱中，酸性條件下，酶解豬骨30～60天；骨顆粒酶解成為透明、黏稠的骨膠原蛋白(圖3)。

步驟(2)、加載泰能：

取0.5～1g泰能，與100ml0.9％nacl混合；泰能溶解于生理鹽水中，形成泰能溶液。取9～10ml骨膠原蛋白與1ml泰能溶液混合，充分?jǐn)嚢韬?；放置?0～37度恒溫箱中，靜置24～48小時；泰能加載至骨膠原蛋白。

步驟(3)、骨膠原蛋白膠體的制備：

將加載了泰能的骨膠原蛋白，經(jīng)氨氣擴散1～2小時，然后再放入0.05％戊二醛進(jìn)行交聯(lián)；每1ml載泰能骨膠原蛋白浸泡在戊二醛中，交聯(lián)1小時后，骨膠原蛋白自組裝成果凍樣膠體；最后將膠體放置在去離子水中浸泡1小時，接著再反復(fù)沖洗3遍，洗去多余的戊二醛，完成膠體的制備。

步驟(4)、生物礦化：

吸取已經(jīng)配好的礦化液倒入小培養(yǎng)皿中，將載泰能骨膠原蛋白膠體浸泡在礦化液中，每5ml骨膠原蛋白膠體加入50ml礦化液，進(jìn)行生物礦化；礦化7天，從而形成載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨。

礦化液的配置：鈣液25ml倒入燒杯中，滴入paa濃度350ug/ml；滴加1m的hcl，調(diào)節(jié)ph至7.4。然后緩慢滴入磷液25ml，約16滴/分鐘，配置礦化液。

25ml鈣液由以下組分構(gòu)成：10mmcacl2.2h2o、150mmnacl、50mm.tris、0.02wt％nan3；

25ml磷液:6mmna2hpo4

抑菌圈實驗顯示：將上述制備得到的載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨放置在耐藥型革蘭氏陰性菌大腸桿菌的培養(yǎng)基中，在載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨周圍形成抑菌圈(圖1)。在模擬體液緩釋實驗中：載泰能羥基磷灰石-酶解骨膠原蛋白人工骨，緩釋的亞胺培南藥物濃度為1ug/ml,是亞胺培南/西司他丁對大腸桿菌的最低抑菌濃度0.125ug/ml的8倍，遠(yuǎn)大于最低抑菌濃度。

圖2透射電子顯微鏡顯示：本實施例制備得到的人工骨膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，即d-band結(jié)構(gòu)；與天然骨組織的i型膠原蛋白纖維的d-band結(jié)構(gòu)一致。

圖3電子衍射圖像顯示：本實施例制備得到的人工骨內(nèi)羥基磷灰石鈣晶體形成，每個亮環(huán)對應(yīng)一個羥基磷灰石鈣晶面，依次是002,211。人工骨在透射電子顯微鏡下顯示：羥基磷灰石晶體嵌入膠原蛋白纖維內(nèi)部縱向生長，其分子結(jié)構(gòu)與人類自身骨組織一致。

上述實施例并非是對于本發(fā)明的限制，本發(fā)明并非僅限于上述實施例，只要符合本發(fā)明要求，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。