本發(fā)明屬于組織工程支架材料領(lǐng)域，涉及一種硬組織工程支架的制備方法，具體涉及一種具有基因調(diào)控功能的硬組織工程支架的制備方法。

背景技術(shù)：

骨缺損是指由先天性或后天性疾病、外傷及人口老齡化等原因而造成的骨骼缺失，是威脅人類健康和生命的嚴(yán)重病癥，骨缺損的修復(fù)研究是長期以來人們深入關(guān)注的重點課題之一。治療骨缺損的有效方法是自體骨移植、異體骨移植和人造骨移植。傳統(tǒng)的自體骨移植仍是目前最理想的骨移植材料，是骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但受到許多限制，如骨來源受限、供區(qū)損傷、植骨量不足、不能制備特殊形狀等。異體骨的移植則存在疾病傳播、生物組織相容性差和免疫排斥等諸多問題。現(xiàn)有的人工骨移植材料主要是金屬和陶瓷材料，如羥基磷灰石和磷酸三鈣等，這類骨移植材料雖然材料來源不受限制但是無法提供與真實骨骼相似的力學(xué)性能，并且缺乏生物響應(yīng)特性，容易造成手術(shù)失敗或二次手術(shù)?，F(xiàn)有的骨組織工程支架無論是在材料的組成、表面物理化學(xué)性質(zhì)還是微觀-宏觀結(jié)構(gòu)方面均存在一定的不足。一方面，缺乏從基因?qū)用嫔蠈?xì)胞在材料表面生長調(diào)控的研究；另一方面，現(xiàn)有的支架成型方法往往不能同時在微觀和宏觀層次上精確調(diào)控支架的結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重限制了骨組織工程支架材料的研究。

20世紀(jì)70年代初，美國佛羅里達大學(xué)的hench教授研制成功用于骨修復(fù)的生物活性玻璃(bioactiveglass,bg，簡稱生物玻璃bioglass)，并于90年代初將其成功應(yīng)用于骨科臨床修復(fù)骨缺損，取得良好的臨床治療效果，現(xiàn)在已被骨科臨床廣泛采用。與其它生物活性材料(如羥基磷灰石)相比，生物玻璃被認(rèn)為具有較高的生物活性和骨結(jié)合強度，主要是由于生物玻璃在人體生理環(huán)境中可以迅速通過玻璃表面的na⁺、ca²⁺元素溶出、水中h⁺進入玻璃表面首先在玻璃表面形成帶有負(fù)電的硅酸凝膠層，進一步通過誘導(dǎo)沉析和礦化作用在硅酸凝膠層上形成類骨碳酸羥基磷灰石層(hydroxyl-carbonate-apatite,hca)。研究表明生物玻璃表面的hca層的形成，可選擇性的吸附諸如纖維蛋白等血清蛋白，有利于細(xì)胞粘附及成骨細(xì)胞表型的表達，并且能直接促使骨祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，具有骨生成作用。目前，骨修復(fù)材料中所采用的生物玻璃主要以粉體為主，有學(xué)者開始研究靜電紡絲法制備無機材料的微納米纖維結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上進一步研究制備無機-有機復(fù)合的微納米纖維方法，這方面的研究正處于起步階段，例如在支架的三維結(jié)構(gòu)控制和纖維的微觀形貌控制中仍有很多需要解決的問題。

調(diào)整改善支架材料和細(xì)胞之間的作用對于骨組織工程支架的優(yōu)化設(shè)計具有重要意義。為了使細(xì)胞在材料表面有效的粘附、生長與分化，一般通過各種物理、化學(xué)和生物改性的方法使支架材料表面的親水性、粘附細(xì)胞的能力發(fā)生變化，或者通過加入生長因子(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2、轉(zhuǎn)化生長因子tgf及轉(zhuǎn)錄因子osterix等)的方法促進細(xì)胞的增殖與分化。單純通過加入生長因子的方法已經(jīng)很難滿足支架材料的設(shè)計需要，更無法實現(xiàn)對細(xì)胞生長基因的精確調(diào)控，需要開發(fā)新型的細(xì)胞生長調(diào)控方法。由于骨的快速修復(fù)依賴于成骨細(xì)胞的增殖和分化，只有先活化成骨細(xì)胞中的一個基因序列，細(xì)胞才能夠發(fā)生分裂并合成出具有礦化成骨能力的細(xì)胞外基質(zhì)，在成骨細(xì)胞對生物材料的細(xì)胞應(yīng)答中存在著一種基因控制，借助基因調(diào)控手段，能夠在分子水平上刺激細(xì)胞并產(chǎn)生特殊應(yīng)答反應(yīng)，有望設(shè)計出一種新型組織工程支架材料。

為此，有必要開發(fā)一種基因調(diào)控功能的硬組織工程支架，使其能用于快速的骨修復(fù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種生物相容性好、微納米形貌、表面結(jié)構(gòu)及介孔尺寸大小可控的、高生物活性、具有基因調(diào)控功能的硬組織工程支架及其制備方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種生物相容性好，微納米形貌、表面結(jié)構(gòu)及介孔尺寸大小可控的，高生物活性，具有基因調(diào)控功能的硬組織工程支架及其制備方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種具有基因調(diào)控功能的硬組織工程支架的制備方法，包括以下步驟：

(1)在cao-p2o5-sio2體系中加入表面活性劑水溶性三嵌段聚合物p123，采用靜電紡絲工藝制備生物玻璃微/納米級纖維，控制纖維的定向排列，獲得規(guī)則排列的纖維；將纖維在300～400℃的溫度下，燒結(jié)120～180min，得到介孔生物玻璃微/納米纖維；

(2)提取成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix)靶向基因片段，構(gòu)建目的基因質(zhì)粒，利用基因重組技術(shù)獲得質(zhì)粒dna重組體；將殼聚糖溶液和質(zhì)粒dna重組體按照質(zhì)量比2:1～5:1的比例混合，在50～100rpm的轉(zhuǎn)速下快速攪拌的條件下形成質(zhì)粒納米微球；

(3)將步驟(1)所得的生物玻璃微納米纖維和步驟(2)所得的質(zhì)粒微球按照質(zhì)量比10:1～20:1的比例混合均勻，然后加入到聚己內(nèi)酯(pcl)的有機溶液中制成乳液，將乳液加入模具中，然后冷凍成型，脫模后將成型的支架再冷凍干燥12h，最終得到復(fù)合的硬組織工程支架。

本發(fā)明的原理是：制備生物玻璃微/納米纖維后，通過高溫?zé)Y(jié)，使纖維上的表面活性劑劇烈蒸發(fā)，從而在纖維表面形成孔洞結(jié)構(gòu)，孔洞結(jié)構(gòu)的介孔生物玻璃微/納米纖維，是具有良好吸附功能的工程支架基質(zhì)；將dna重組體與殼聚糖混合，利用殼聚糖分子和dna之間的吸附力，可制備得包裹有dna粒子的殼聚糖微球，微球的表面及內(nèi)部均含有dna粒子；最后將介孔生物玻璃微/納米纖維和含有dna粒子的微球混合，微球進入到生物玻璃微/納米纖維的介孔中，定型，制成具有基因調(diào)控功能的硬組織工程支架。

進一步地，步驟(1)所述的靜電紡絲工藝參數(shù)為：靜電電壓10～25kv，接收距離5～25cm，紡絲速率0.5～5ml/h，相對濕度20％-80％。

進一步地，步驟(1)所述的靜電紡絲工藝中，要控制纖維的定向排列，可以通過采用轉(zhuǎn)速<500rpm的高速旋轉(zhuǎn)滾筒作為接收裝置而實現(xiàn)，或者通過采用兩塊水平放置的平行板電極作為接收裝置而實現(xiàn)，或者通過采用近場靜電紡絲機作為接收裝置而實現(xiàn)。

進一步地，步驟(1)所述的介孔生物玻璃微納米纖維，其表面形成有若干孔洞；所述孔洞的孔徑尺寸范圍為10～50nm。

進一步地，步驟(3)所述的冷凍成型，是將盛裝有所述乳液的模具先置于4℃冰箱中冷藏24h，然后再置于0℃冰箱中冷凍1h。

進一步地，步驟(3)所述的模具優(yōu)選為中空圓柱形的模具。

由以上方法制得的所得的硬組織工程支架，具有基因調(diào)控功能，用于作為骨骼修復(fù)等硬組織修復(fù)的應(yīng)用。

以上所述的硬組織工程支架作為骨骼修復(fù)等硬組織修復(fù)的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明所述的硬組織工程支架能夠在分子水平上刺激細(xì)胞并產(chǎn)生特殊應(yīng)答反應(yīng)；

(2)本發(fā)明所述的硬組織工程支架可實現(xiàn)對細(xì)胞生長基因的精確調(diào)控。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述的硬組織工程支架的技術(shù)路線框圖；

圖2是本發(fā)明所述的硬組織工程支架材料對細(xì)胞生長調(diào)控機制的示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定，本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

(1)在cao-p2o5-sio2體系中加入p123，靜電紡絲工藝參數(shù)為：靜電電壓10kv，接受距離10cm，紡絲速率1ml/h，相對濕度25％。高速旋轉(zhuǎn)的滾筒轉(zhuǎn)速為200rpm，獲得規(guī)則排列的微納米纖維；將纖維在300℃的溫度下，燒結(jié)120min，使纖維上的表面活性劑劇烈蒸發(fā)，從而在纖維表面形成孔洞結(jié)構(gòu)，得到介孔生物玻璃微納米纖維。

(2)提取osterix靶向基因片段，構(gòu)建目的基因質(zhì)粒，利用基因重組技術(shù)獲得質(zhì)粒dna重組體。將殼聚糖溶液和質(zhì)粒dna重組體混合，混合質(zhì)量比例范圍為2:1，利用殼聚糖分子和dna之間的吸引力，在50轉(zhuǎn)/分的快速攪拌的條件下形成質(zhì)粒納米微球。

(3)將步驟(1)所得的生物玻璃微納米纖維和步驟(2)所得的質(zhì)粒微球按照質(zhì)量比10:1的比例混合均勻，然后加入到聚己內(nèi)酯(pcl)的有機溶液中制成乳液，將乳液加入圓柱型模具中，放入4℃冰箱中24h后，再放入低溫冰箱中冷凍1h脫模，冷凍干燥12h，得到圓柱型復(fù)合組織工程支架。

實施例2

(1)在cao-p2o5-sio2體系中加入p123，靜電紡絲工藝參數(shù)為：靜電電壓15kv，接受距離15cm，紡絲速率2ml/h，相對濕度30％。高速旋轉(zhuǎn)的滾筒轉(zhuǎn)速為300rpm，獲得規(guī)則排列的微納米纖維；將纖維在300℃的溫度下，燒結(jié)120min，使纖維上的表面活性劑劇烈蒸發(fā)，從而在纖維表面形成孔洞結(jié)構(gòu)，得到介孔生物玻璃微納米纖維。

(2)提取osterix靶向基因片段，構(gòu)建目的基因質(zhì)粒，利用基因重組技術(shù)獲得質(zhì)粒dna重組體。將殼聚糖溶液和質(zhì)粒dna重組體混合，混合質(zhì)量比例范圍為3:1，利用殼聚糖分子和dna之間的吸引力，在80轉(zhuǎn)/分的快速攪拌的條件下形成質(zhì)粒納米微球。

(3)將步驟(1)所得的生物玻璃微納米纖維和步驟(2)所得的質(zhì)粒微球按照質(zhì)量比15:1的比例混合均勻，然后加入到聚己內(nèi)酯(pcl)的有機溶液中制成乳液，將乳液加入圓柱型模具中，放入4℃冰箱中24h后，再放入低溫冰箱中冷凍1h脫模，冷凍干燥12h，得到圓柱型復(fù)合組織工程支架。

實施例3

(1)在cao-p2o5-sio2體系中加入p123，靜電紡絲工藝參數(shù)為：靜電電壓20kv，接受距離20cm，紡絲速率5ml/h，相對濕度50％。高速旋轉(zhuǎn)的滾筒轉(zhuǎn)速為400rpm，獲得規(guī)則排列的微納米纖維；將纖維在380℃的溫度下，燒結(jié)150min，使纖維上的表面活性劑劇烈蒸發(fā)，從而在纖維表面形成孔洞結(jié)構(gòu)，得到介孔生物玻璃微納米纖維。

(2)提取osterix靶向基因片段，構(gòu)建目的基因質(zhì)粒，利用基因重組技術(shù)獲得質(zhì)粒dna重組體。將殼聚糖溶液和質(zhì)粒dna重組體混合，混合質(zhì)量比例范圍為3:1，利用殼聚糖分子和dna之間的吸引力，在80轉(zhuǎn)/分的快速攪拌的條件下形成質(zhì)粒納米微球。

(3)將步驟(1)所得的生物玻璃微納米纖維和步驟(2)所得的質(zhì)粒微球按照質(zhì)量比20:1的比例混合均勻，然后加入到聚己內(nèi)酯(pcl)的有機溶液中制成乳液，將乳液加入圓柱型模具中，放入4℃冰箱中24h后，再放入低溫冰箱中冷凍1h脫模，冷凍干燥12h，得到圓柱型復(fù)合組織工程支架。