本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料涉及軟骨組織工程修復(fù)領(lǐng)域，特別涉及一種負(fù)載kartogenin的納米纖維組織工程支架的制備方法。

背景技術(shù)：

先天性氣管狹窄(cts)是指由構(gòu)成僵硬氣管后壁的完全性氣管環(huán)和缺少正常結(jié)構(gòu)的膜性氣管導(dǎo)致的氣管管腔狹窄。其發(fā)生可隨氣管黏膜下層腺體和結(jié)締組織的增生形成管腔進(jìn)一步導(dǎo)致阻塞，或因氣管插管損傷、血管環(huán)壓迫以及氣管軟化等其他原因造成阻塞。而先天性氣管狹窄在先天性心臟病(先心病)患兒中的發(fā)病率較高，文獻(xiàn)報道約為1.5％

應(yīng)用小分子化合物等方法促進(jìn)軟骨再生及軟骨修復(fù)的研究正在受到關(guān)注，為干細(xì)胞靶向修復(fù)局部軟骨缺損及軟骨再生帶來了新的希望。2012年《science》報道了一種新的小分子化合物kartogenin(kgn)，是通過高通量篩選技術(shù)從22000種分子中篩選獲得，并被證實可以選擇性誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞而促進(jìn)軟骨的產(chǎn)生，同時可抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化，當(dāng)給骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型局部注射kgn可觸發(fā)其體內(nèi)軟骨的再生，且無細(xì)胞毒性，但具體作用機(jī)制尚未清楚，可能與作用于runx1信號通路有關(guān)。目前kgn應(yīng)用于軟骨修復(fù)方面的已經(jīng)有很多研究陸續(xù)發(fā)表。至目前為止，未見有基于同軸靜電紡絲技術(shù)制備一種負(fù)載kartogenin的納米纖維組織工程支架的支架。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種負(fù)載kartogenin的納米纖維組織工程支架的制備方法。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種負(fù)載kartogenin的納米纖維組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1)：將魚膠原蛋白和聚乳酸-聚己內(nèi)酯共混物溶于溶劑中，攪拌至完全溶解后得到皮層靜電紡絲溶液；

步驟2)：用聚乳酸-聚己內(nèi)酯溶液稀釋溶于dmso中的kartogenin母液，攪拌均勻得到芯層靜電紡絲溶液；

步驟3)：將皮層靜電紡絲溶液、芯層靜電紡絲溶液分別裝入注射器中，進(jìn)行同軸靜電紡絲，然后進(jìn)行熏蒸處理，真空干燥，即得負(fù)載kartogenin的納米纖維組織工程支架。

優(yōu)選地，所述步驟1)中聚乳酸-聚己內(nèi)酯的數(shù)均分子量為30萬；魚膠原蛋白的數(shù)均分子量為30萬。

優(yōu)選地，所述步驟1)中溶劑為六氟異丙醇；攪拌時間為6-8小時。

優(yōu)選地，所述步驟1)中魚膠原蛋白與聚乳酸-聚己內(nèi)酯的重量比為25∶75。

優(yōu)選地，所述步驟1)中皮層靜電紡絲溶液的質(zhì)量濃度為12-15kg/l。

優(yōu)選地，所述步驟2)中聚乳酸-聚己內(nèi)酯溶液具體為：數(shù)均分子量為30萬的聚乳酸-聚己內(nèi)酯溶于六氟異丙醇和二氯甲烷以體積比2∶1混合的混合溶劑；聚乳酸-聚己內(nèi)酯溶液的質(zhì)量濃度為4kg/l。

優(yōu)選地，所述步驟2)中kartogenin母液的濃度為20mg/ml。

優(yōu)選地，所述步驟2)中芯層靜電紡絲溶液的濃度為3mg/ml。

優(yōu)選地，所述步驟3)中同軸靜電紡絲工藝具體為：將皮層靜電紡絲溶液裝入注射器中，在注射泵的作用下進(jìn)入同軸裝置復(fù)合毛細(xì)噴頭的內(nèi)外毛細(xì)噴絲口之間的環(huán)狀空隙處；將芯層靜電紡絲溶液裝入注射器，在注射泵的作用動下進(jìn)入同軸裝置復(fù)合毛細(xì)噴頭的內(nèi)毛細(xì)噴絲頭；開啟靜電壓發(fā)生器、注射泵，以及滾筒接收裝置的電機(jī)，進(jìn)行紡絲。所述噴絲口為同心軸的復(fù)合毛細(xì)管，所制備的納米纖維具有“芯-殼”結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述步驟3)中同軸靜電紡絲工藝參數(shù)為：紡絲噴頭采用內(nèi)層直徑0.84mm、外層直徑0.51mm的同心軸噴絲頭；注射泵的推進(jìn)速度分別為芯層0.18ml/h、殼層1.3ml/h；在同心軸噴絲頭和滾筒接收裝置之間的調(diào)節(jié)電壓為11-12kv；同心軸噴絲頭和滾筒接收裝置之間的距離為8-12cm；滾筒的轉(zhuǎn)速為800r/min。

優(yōu)選地，所述步驟3)中熏蒸處理具體為采用戊二醛熏蒸處理，戊二醛的體積濃度為25％，熏蒸時間為25min。

優(yōu)選地，所述步驟3)中真空干燥時間為48-72h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明巧妙地利用了同軸靜電紡絲技術(shù)，得到長期緩釋小分子化合物kartogenin，kartogenin能夠誘導(dǎo)間充值干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，在動物體內(nèi)kartogenin能引發(fā)干細(xì)胞的歸巢行為；kartogenin與生長因子有很好的協(xié)同效應(yīng)；

(2)操作簡單，可重復(fù)性好，經(jīng)濟(jì)效益高。

附圖說明

圖1為實施例1與對比例得到的納米纖維的掃描電鏡照片的對比圖；

圖2為實施例1與對比例得到的納米纖維的直徑纖維分布圖的對比圖；

圖3為實施例1得到的負(fù)載kartogenin的納米纖維不同比例的透射電鏡照片；

圖4為實施例1得到的負(fù)載kartogenin的納米纖維的緩釋曲線；

圖5為kartogenin濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6為骨髓間充值干細(xì)胞(bmsc)分別在對比例、實施例1上培養(yǎng)4、7天的細(xì)胞電鏡照片。

具體實施方式

為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。

實施例1

稱取魚膠原蛋白0.15g，聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.45g，溶于5ml六氟異丙醇，聚乳酸一聚己內(nèi)酯共聚物的數(shù)均分子量為30萬，以200r/min的速率磁力攪拌8小時混合均勻得到總濃度為12％(w/v)的皮層靜電紡溶液。取100μl濃度為20mg/mlkartogenin溶于7ml的4％(w/v)聚乳酸-聚己內(nèi)酯(hfip：dcm2∶1)，機(jī)械振蕩均勻得到芯層的紡絲液；將殼層靜電紡絲溶液裝入注射器，微量注射泵的推進(jìn)速度控制為1.2ml/min，將芯層靜電紡絲溶液裝入另一個注射器，微量注射泵的推進(jìn)速度控制為0.18ml/min。同軸靜電紡絲所用的同心軸芯層溶液通過的針頭直徑為0.51mm，殼層溶液通過的針頭為直徑為0.84mm，針頭與11kv的高壓相連。用鋁箔平整包纏著直徑為5cm的滾筒接收納米纖維絲，電機(jī)控制滾筒轉(zhuǎn)速800r/min，同心軸噴絲頭和滾筒接收裝置之間的距離為10cm，3到4小時后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。上述支架取下后放入密閉容器，用體積濃度為25％的戊二醛進(jìn)行蒸汽處理25min，處理完畢后真空干燥48h，去除殘留溶劑。

實施例2

稱取魚膠原蛋白0.15g，聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.45g，溶于5ml六氟異丙醇，聚乳酸一聚己內(nèi)酯共聚物的數(shù)均分子量為30萬，以200r/min的速率磁力攪拌8小時混合均勻得到總濃度為12％(w/v)的皮層靜電紡溶液。取50μl濃度為20mg/mlkartogenin溶于7ml的4％(w/v)聚乳酸-聚己內(nèi)酯(hfip：dcm2∶1)，機(jī)械振蕩均勻得到芯層的紡絲液；將殼層靜電紡絲溶液裝入注射器，微量注射泵的推進(jìn)速度控制為1.2ml/min，將芯層靜電紡絲溶液裝入另一個注射器，微量注射泵的推進(jìn)速度控制為0.2ml/min。同軸靜電紡絲所用的同心軸芯層溶液通過的針頭直徑為0.51mm，殼層溶液通過的針頭為直徑為0.84mm，針頭與11kv的高壓相連。用鋁箔平整包纏著直徑為5cm的滾筒接收納米纖維絲，電機(jī)控制滾筒轉(zhuǎn)速800r/min，同心軸噴絲頭和滾筒接收裝置之間的距離為12cm，3到4小時后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。上述支架取下后放入密閉容器，用體積濃度為25％的戊二醛進(jìn)行蒸汽處理25min，處理完畢后真空干燥48h，去除殘留溶劑。

對比例

稱取魚膠原蛋白0.15g，聚乳酸-聚己內(nèi)酯0.45g，溶于5ml六氟異丙醇，聚乳酸一聚己內(nèi)酯共聚物分子量為30萬，以200r/min的速率磁力攪拌8小時混合均勻得到總濃度為12％(w/v)的靜電紡溶液。將殼層靜電紡絲溶液裝入注射器，微量注射泵的推進(jìn)速度控制為1.2ml/min；針頭直徑為0.84mm；針頭與11kv的高壓相連；噴絲頭和滾筒接收裝置之間的距離為10cm。4小時后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。上述支架取下后放入密閉容器，用體積濃度為25％的戊二醛進(jìn)行蒸汽處理25min，處理完畢后真空干燥48h，去除殘留溶劑。