本發(fā)明主要涉及用于組織或器官修復(fù)及其再生的生物領(lǐng)域，具體是一種天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

半月板在膝關(guān)節(jié)中承擔(dān)著重要的生物力學(xué)作用，其損傷在臨床上十分常見，往往引起嚴(yán)重的功能缺失，半月板退變以及關(guān)節(jié)炎癥，難以自愈。在美國，每150萬臺(tái)膝關(guān)節(jié)手術(shù)中就有一半與半月板損傷相關(guān)，花費(fèi)巨大。目前此類手術(shù)多為同種異體半月板置換術(shù)，但是免疫排斥反應(yīng)強(qiáng)烈，生物力學(xué)性能欠佳，效果并不理想。

再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的出現(xiàn)使根治半月板損傷成為可能。它由三種重要的因素構(gòu)成包括細(xì)胞，支架以及生物活性分子。由細(xì)胞支架構(gòu)建的材料在組織工程中應(yīng)用極為廣泛，例如天然的聚合物材料，合成的膠原或蛋白支架，金屬材料等，但是它們難以完全模擬半月板的生理特性以及力學(xué)性能，限制了修復(fù)的效果。

天然組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)能夠在去除誘導(dǎo)免疫排斥的細(xì)胞的同時(shí)，保留天然的3d微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞外基質(zhì)中的有效成分包括膠原，糖胺聚糖(gag)，細(xì)胞因子等，為修復(fù)半月板缺損提供了可能。而目前性能良好的半月板脫細(xì)胞材料尚未被發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有的填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中，半月板在材料組成、結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)方面的不足以及半月板缺損的修復(fù)效果，提供一種適宜的治療半月板缺損的半月板脫細(xì)胞材料的制備方法。

為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：將哺乳動(dòng)物任意半月板組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液、有機(jī)溶劑溶液、含tritonx的pbs緩沖液、含sds的pbs緩沖液和含dna酶的pbs緩沖液處理，獲得脫細(xì)胞半月板材料；

所述的含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液質(zhì)量濃度為1％-5％，蛋白酶抑制劑含量為10kiu/ml；

所述的有機(jī)溶劑溶液為等體積比的三種溶液，氯仿和甲醇溶液、質(zhì)量濃度10％-100％的丙酮溶液或質(zhì)量濃度30％-70％的乙醇溶液；

所述的含tritonx的pbs緩沖液的質(zhì)量濃度1％-5％的tritonx-200或tritonx-100的pbs緩沖液；

所述的含sds的pbs緩沖液的質(zhì)量濃度0.5％-5％的sds的pbs緩沖液，其中混合1-20mmol/l的tris；

所述的含dna酶的pbs緩沖液中dna酶質(zhì)量濃度為0.01-0.5mg/ml。

一種天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料的制備方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

(1)取哺乳動(dòng)物全身任意半月板組織用無菌生理鹽水漂洗3次、20分鐘/次，去除血液、殘余肌肉組織、毛發(fā)和韌帶；

(2)接著在含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩8-24小時(shí)；

(3)在有機(jī)溶劑溶液中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩脫脂2-12小時(shí)；

(4)在含tritonx的pbs緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩4-15天；

(5)在含sds的pbs緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩2-8天；

(6)在含dna酶的pbs緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37℃搖床100rpm震蕩2-12小時(shí)；

(7)在無菌生理鹽水中，37℃搖床100rpm震蕩72小時(shí)，即得天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料；

混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為10kiu/ml、10kiu/ml，青霉素和鏈霉素的比例為1:1；步驟(4)-(6)中pbs緩沖液和混合抗菌液體積比分別為10:1、10:1、5:1；

步驟(2)-(6)中，每個(gè)步驟完成后均用生理鹽水沖洗5小時(shí)。

針對目前用于半月板修復(fù)和再生的骨材料及其制備方法存在的問題，發(fā)明人建立了一種天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料的制備方法，該法將哺乳動(dòng)物任意半月板組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液、有機(jī)溶劑溶液、含tritonx的pbs緩沖液、含sds的pbs緩沖液、含dna酶的pbs緩沖液處理，獲得半月板脫細(xì)胞材料。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的顯著進(jìn)步在于：

(1)本發(fā)明所采用的半月板是天然來源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材廣泛性。

(2)本發(fā)明運(yùn)用一種脫細(xì)胞方案即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對任意物種半月板組織進(jìn)行徹底去細(xì)胞化處理，更加高效便捷的獲得均一性高的脫細(xì)胞半月板材料。

(3)本發(fā)明在去除具有免疫原性的異體或異種細(xì)胞的同時(shí)，可保留原先ecm的完整性，具有良好的細(xì)胞外微環(huán)境、生化因子和生物力學(xué)性質(zhì)等，可以最大限度的模擬正常半月板的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)。

(4)本發(fā)明可以為病人訂制具有個(gè)體化、可供移殖的半月板脫細(xì)胞支架，可滿足臨床上復(fù)雜多樣的半月板缺損修復(fù)需求，也可以將其研磨制成粉末，將正常半月板組織中所含有的生化因子溶解，用于全身任意部位的骨科疾病。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的半月板大體外觀圖

圖2是半月板支架的he染色無細(xì)胞及無細(xì)胞核成分殘留圖

圖3是半月板支架的dapi染色無細(xì)胞及無細(xì)胞核成分殘留圖

圖4是半月板dna定量檢測幾乎不含有dna成分圖

圖5是半月板的膠原定量檢測保留大量膠原成分圖

圖6是半月板的masson染色膠原定性檢測保留大量膠原成分圖

圖7是半月板掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留圖

圖8是cck-8檢測不同支架浸提液濃度下mscs的增值情況圖

具體實(shí)施方案

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此

1.脫細(xì)胞半月板材料的制備與研究

(1)取材：取5個(gè)月(雌雄均可)健康豬膝關(guān)節(jié)，剪取左右兩側(cè)半月板，轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境中，用無菌生理鹽水漂洗3次、20分鐘/次，去除血液、殘余肌肉組織、脂肪和韌帶等組織；取材大小視臨床實(shí)際手術(shù)需要而定，可以選用全半月板。

(2)在1000ml含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液(質(zhì)量濃度為1％，蛋白酶抑制劑含量為10kiu/ml)中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩10小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(3)在1000ml有機(jī)溶劑溶液(等體積比的氯仿和甲醇溶液)中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩脫脂12小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(4)在1000ml含tritonx的pbs緩沖液(濃度為2％的tritonx-100)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩12天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(5)在1000ml含sds的pbs緩沖液(質(zhì)量濃度0.5％的sds的pbs緩沖液，其中混合1mmol/l的tris)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩5天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(6)在300ml含dna酶的pbs緩沖液中(dna酶濃度為0.01mg/ml)，加入60ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37℃搖床100rpm震蕩12小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(7)在無菌生理鹽水中，37℃搖床100rpm震蕩72小時(shí)，即得天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料，液氮中保存，待手術(shù)時(shí)取出。

其中，混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為10kiu/ml、10kiu/ml，青霉素和鏈霉素的比例為1:1。

對本例所得天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)、抗原成分定量檢測，結(jié)果如圖1-8。通過圖1和2顯示完全脫細(xì)胞半月板材料大體結(jié)構(gòu)保留完好，細(xì)胞外基質(zhì)保留完整，細(xì)胞核成分完全去除，無細(xì)胞及其碎片殘留；圖3dapi染色進(jìn)一步提示材料中細(xì)胞核成分呈陰性，抗原性得到完全去除；圖4的dna抗原成分定量檢測說明通過去細(xì)胞dna去除率可以達(dá)到95％以上；圖5和圖6的膠原定量和定性檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)主要膠原成分得到很好保留；圖7的掃描電鏡先是半月板微觀結(jié)構(gòu)保留完整；圖8的cck-8細(xì)胞毒性檢測表明半月板脫細(xì)胞材料無細(xì)胞毒性，生物相容性。

實(shí)施例2脫細(xì)胞半月板材料的制備和研究

(1)取材：取5個(gè)月(雌雄均可)健康豬膝關(guān)節(jié)，剪取左右兩側(cè)半月板，轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境中，用無菌生理鹽水漂洗3次、20分鐘/次，去除血液、殘余肌肉組織、脂肪和韌帶等組織；取材大小視臨床實(shí)際手術(shù)需要而定，可以選用全半月板。

(2)在1000ml含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液(質(zhì)量濃度為5％，蛋白酶抑制劑含量為10kiu/ml)中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩8小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(3)在1000ml有機(jī)溶劑溶液(質(zhì)量濃度10％-100％的丙酮溶液)中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩脫脂10小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(4)在1000ml含tritonx的pbs緩沖液(濃度為5％的tritonx-100)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩15天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(5)在1000ml含sds的pbs緩沖液(質(zhì)量濃度5％的sds的pbs緩沖液，其中混合20mmol/l的tris)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩2天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(6)在300ml含dna酶的pbs緩沖液中(dna酶濃度為0.5mg/ml)，加入60ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37℃搖床100rpm震蕩2小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(7)在無菌生理鹽水中，37℃搖床100rpm震蕩72小時(shí)，即得天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料，液氮中保存，待手術(shù)時(shí)取出。

其中，混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為10kiu/ml、10kiu/ml，青霉素和鏈霉素的比例為1:1。

實(shí)施例3脫細(xì)胞半月板材料的制備和研究

(1)取材：取5個(gè)月(雌雄均可)健康豬膝關(guān)節(jié)，剪取左右兩側(cè)半月板，轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境中，用無菌生理鹽水漂洗3次、20分鐘/次，去除血液、殘余肌肉組織、脂肪和韌帶等組織；取材大小視臨床實(shí)際手術(shù)需要而定，可以選用全半月板。

(2)在1000ml含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液(質(zhì)量濃度為3％，蛋白酶抑制劑含量為10kiu/ml)中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩24小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(3)在1000ml有機(jī)溶劑溶液(質(zhì)量濃度30％-70％的乙醇溶液)中，恒溫45℃搖床100rpm震蕩脫脂2小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(4)在1000ml含tritonx的pbs緩沖液(濃度為1％的tritonx-100)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩4天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(5)在1000ml含sds的pbs緩沖液(質(zhì)量濃度3％的sds的pbs緩沖液，其中混合15mmol/l的tris)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩2天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(6)在300ml含dna酶的pbs緩沖液中(dna酶濃度為0.2mg/ml)，加入60ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37℃搖床100rpm震蕩6小時(shí)，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；

(7)在無菌生理鹽水中，37℃搖床100rpm震蕩72小時(shí)，即得天然組織來源的半月板脫細(xì)胞材料，液氮中保存，待手術(shù)時(shí)取出。

其中，混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為10kiu/ml、10kiu/ml，青霉素和鏈霉素的比例為1:1。

實(shí)施例4脫細(xì)胞半月板材料的制備和研究

取豬半月板，步驟(4)在1000ml含tritonx的pbs緩沖液(濃度為1％的tritonx-200)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩4天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞半月板材料。

實(shí)施例5脫細(xì)胞半月板材料的制備和研究

取豬半月板，步驟(4)在1000ml含tritonx的pbs緩沖液(濃度為2％的tritonx-200)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩4天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞半月板材料。

實(shí)施例6脫細(xì)胞半月板材料的制備和研究

取豬半月板，步驟(4)在1000ml含tritonx的pbs緩沖液(濃度為5％的tritonx-200)，加入100ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45℃搖床100rpm震蕩4天，并用生理鹽水沖洗5小時(shí)；其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞半月板材料。

對實(shí)施例2-6所得脫細(xì)胞半月板材料分別進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)、抗原成分定量檢測，結(jié)果與實(shí)施例1類似，這表明脫細(xì)胞半月板材料可通過上述多種方法制得，并且對其進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)、抗原成分定量檢測均說明材料已經(jīng)完全去除細(xì)胞成分，無明顯抗原成分殘留；將其運(yùn)用于兔子一類的大動(dòng)物半月板缺損模型修復(fù)中可以達(dá)到很好的軟骨修復(fù)再生效果。脫細(xì)胞半月板材料可以作為臨床上半月板缺損移植等病人的安全可靠、有效、快速的替代材料。