本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑。
背景技術(shù)：
：2013年，美國(guó)、德國(guó)3位科學(xué)家憑借他們所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)機(jī)制，榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。外泌體(exosomes)作為人體內(nèi)一類重要囊泡，也開(kāi)始受到越來(lái)越多的關(guān)注?？茖W(xué)家們已發(fā)現(xiàn)，外泌體會(huì)參與到免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)、凝結(jié)等重要的生物過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)通過(guò)分泌外泌體，將一些信號(hào)分子分泌到較遠(yuǎn)的組織或細(xì)胞中，以起到調(diào)控作用。2016年，中國(guó)江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院許文榮等人研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體包含的蛋白質(zhì)，能夠與皮膚再生過(guò)程中的信號(hào)分子相互協(xié)作。(文獻(xiàn)：zhang,b.,etal.(2016)."hucmscexosome-delivered14-3-3zetaorchestratesself-controlofthewntresponseviamodulationofyapduringcutaneousregeneration."stemcells.)首先，通過(guò)評(píng)估人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體治療大鼠深ⅱ度燒傷的作用，發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體在皮膚的再生重塑階段促進(jìn)wnt/β-catenin信號(hào)通路的自我調(diào)節(jié)。其次，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，有關(guān)蛋白可以通過(guò)外泌體運(yùn)輸。綜合研究結(jié)果表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體不但可作為wnt/β-catenin信號(hào)的“加速器”以促進(jìn)受損皮膚組織的再生修復(fù)，而且可通過(guò)調(diào)節(jié)yap控制皮膚再生作為該信號(hào)的“剎車”。因此，在修復(fù)老化皮膚/受損皮膚方面，具有廣闊的市場(chǎng)前景，但目前該領(lǐng)域的產(chǎn)品抗衰老效果并不理想，尋找一種抗衰老好的產(chǎn)品是目前該領(lǐng)域刻不容緩的事情。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的空白區(qū)，從而提出一種抗衰老效果好的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑，所述制劑包括如下組分：人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁；三者的重量比為1:1:10-20。優(yōu)選的，所述制劑的制備方法為：按比例稱取所述人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁，混合攪拌至透明，然后依次經(jīng)0.45μm、0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得到所述美容制劑。優(yōu)選的，所述外泌體的外膜為磷脂雙層結(jié)構(gòu)，所述外泌體內(nèi)部含有micro-rna、所述外泌體源細(xì)胞的mrna、dna和核酸中的至少一種。優(yōu)選的，所述的外泌體的獲取方法如下：a)對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)階段在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加干擾素、epo和pdgf-bb；b)對(duì)培養(yǎng)后的干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理；c)在預(yù)處理后的培養(yǎng)基的上清液中提取所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體。優(yōu)選的，所述蘆薈汁中，含有蘆薈多糖，含量為700-800mg/l。優(yōu)選的，所述外泌體為msc分化而來(lái)。優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選的，所述所述預(yù)處理的具體步驟為：1)將人傳代msc進(jìn)行無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml；2)按照106/150mm大培養(yǎng)皿接種，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至70-80％，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天；3)吸除培養(yǎng)皿中的液體，并用alpha-mem液體培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌；4)在150mm培養(yǎng)皿中再次加入20ml的alpha-mem；5)依次加入重組人干擾素、pdgf-bb和epo；7)在37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)96小時(shí)，收集得到msc培養(yǎng)液。優(yōu)選的，所述msc培養(yǎng)液中干擾素的濃度為10u/ml～600u/ml、pdgf-bb的濃度為2ng/ml～60ng/ml，epo的濃度為0.1iu/ml～5iu/ml。優(yōu)選的，所述步驟2)的預(yù)處理的具體為：1)取所述msc培養(yǎng)液的上清液，進(jìn)行離心處理，去除細(xì)胞碎片；2)然后將上清液濾膜過(guò)濾處理，去除凋亡小體，得到預(yù)處理后的上清液。優(yōu)選的，所述步驟3)具體為：1)取容積為5體積份的離心管，加入1體積份的外泌體分離試劑；2)加入4體積份的經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的上清液，充分混勻；3)靜置處理后，再進(jìn)行兩次離心處理，得到所述外泌體。本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明采用一種新型的人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體作為活性成分，可以制備得到一種有明顯效果的美容制劑，能夠在解決人的皮膚老化問(wèn)題；制作方法簡(jiǎn)便，適合即用即配，很好地利用外泌體的生物活性成分；制備成本較低，適合多次使用，可以讓使用者長(zhǎng)期保持美容效果；所用物料均為經(jīng)過(guò)國(guó)家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的藥用輔料，可以降低副作用，保證使用者的皮膚安全；具有極大的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例公開(kāi)了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑，所述制劑包括如下組分：人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁；三者的重量比為1:1:15；所述蘆薈汁中，含有蘆薈多糖，含量為750mg/l。所述制劑的制備方法為：按比例稱取所述人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁，混合攪拌至透明，然后依次經(jīng)0.45μm、0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得到所述美容制劑。實(shí)施例2本實(shí)施例公開(kāi)了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑，所述制劑包括如下組分：人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁；三者的重量比為1:1:10；所述蘆薈汁中，含有蘆薈多糖，含量為800mg/l。所述制劑的制備方法為：按比例稱取所述人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁，混合攪拌至透明，然后依次經(jīng)0.45μm、0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得到所述美容制劑。實(shí)施例3本實(shí)施例公開(kāi)了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑，所述制劑包括如下組分：人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁；三者的重量比為1:1:20；所述蘆薈汁中，含有蘆薈多糖，含量為700mg/l。所述制劑的制備方法為：按比例稱取所述人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉、甘油、蘆薈汁，混合攪拌至透明，然后依次經(jīng)0.45μm、0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得到所述美容制劑。實(shí)施例4實(shí)施例1中所提及的外泌體的獲取方法如下：a.人msc的培養(yǎng)及預(yù)處理1.材料及試劑1)人臍帶、胎盤、骨髓、脂肪或其它來(lái)源的msc，傳代次數(shù)在6代以內(nèi)均可。2)人msc無(wú)血清培養(yǎng)基3)alpha-mem4)重組人干擾素5)重組人epo6)重組人pdgf-bb7)培養(yǎng)皿(直徑150mm)8)其它耗材2.細(xì)胞培養(yǎng)1)將人傳代msc消化后計(jì)數(shù)，使用msc無(wú)血清完全培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml。2)按照106/150mm大培養(yǎng)皿接種，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至70-80％。一般需要2-3天。3)吸除培養(yǎng)皿中的液體，并用alpha-mem液體培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌。4)加入alpha-mem20ml/150mm培養(yǎng)皿。5)首先加入重組人干擾素、pdgf-bb，在37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)24小時(shí)；然后，再加入epo，在37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)72小時(shí)。重組人干擾素(終濃度為10u/ml～600u/ml)、pdgf-bb(2ng/ml～60ng/ml)及epo(0.1iu/ml～5iu/ml)。7)37℃，5％co2條件下培養(yǎng)96小時(shí)。8)收集上清進(jìn)行以下處理。如不能及時(shí)處理，將上清置于-80℃保存。b.人msc培養(yǎng)上清的預(yù)處理1.材料與試劑1)離心管等耗材。2)孔徑為1μm，0.45μm及0.22μm的濾器。2.操作步驟1)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫或4℃條件下離心2000g，10分鐘，去除細(xì)胞碎片。2)將培養(yǎng)上清或體液分別經(jīng)過(guò)直徑為1μm，0.45μm及0.22μm濾膜過(guò)濾，以去除其中可能存在的凋亡小體。c.外泌體的收獲1)取50ml離心管，加入外泌體分離試劑10ml?；蛉?50ml離心管，加入外泌體試劑50ml。2)加入經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml，充分混勻?；蚣尤肱囵B(yǎng)上清200ml。3)置于4℃過(guò)夜，或至少6小時(shí)。4)離心，2000g，30分鐘。5)移除液體，再次離心，2000g，5分鐘。6)用pipette小心吸除殘留液體。7)加入pbs或生理鹽水500μl至1ml?；蚣尤雙bs或生理鹽水2.5ml至5ml。8)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，或進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)等儀器分析。d.所得外泌體的凍干粉制備取所得外泌體，加入甘露醇(1％～15％)，混勻，過(guò)濾(0.22μm)，分裝，再放置于超低溫冰箱(-80℃)10h。然后，在10pa的真空度下進(jìn)行凍干(-50℃，24h)，得到人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉。實(shí)驗(yàn)例一、穩(wěn)定性試驗(yàn)所得美容制劑放置于-20℃條件下保存。在六個(gè)月以后觀察，無(wú)明顯變化。二、有效性測(cè)試在美容院挑選十位女士，分為兩組，其中一組試用所得美容制劑，另一組使用常規(guī)美容品。在完成一個(gè)療程(30天)以后，分析評(píng)價(jià)結(jié)果列于表1、表2。表1外泌體美容制劑試用組的用后感覺(jué)及感觀評(píng)價(jià)序號(hào)皮膚類型及狀況性別年齡段無(wú)效一般良好顯效01油性細(xì)紋女30～35√02中性皺女40～45√03中性斑女25～30√04干性細(xì)紋女25～30√05干性皺斑女40～45√表2常規(guī)美容制劑對(duì)照組的用后感覺(jué)及感觀評(píng)價(jià)序號(hào)皮膚類型及狀況性別年齡段無(wú)效一般良好顯效01油性細(xì)紋女30～35√02中性皺女40～45√03中性斑女25～30√04干性細(xì)紋女25～30√05干性皺斑女40～45√綜合表1、表2的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑，對(duì)于各種類型的皮膚狀況均有良好或顯效的效果。而相比于常規(guī)美容制劑，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的美容制劑對(duì)于中性皺和干性皺斑的皮膚問(wèn)題有更好的效果，可以舒緩女士們面對(duì)的皺紋問(wèn)題。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。當(dāng)前第1頁(yè)12