本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)和生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：卵巢早衰(prematureovarianfailure,pof)是指40歲前月經(jīng)己形成規(guī)律的女性，由于卵巢功能衰退而出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、性器官萎縮等癥狀，而且常伴隨著促性腺激素水平的上升和雌激素水平的下降。卵巢早衰是婦產(chǎn)科臨床工作中的常見病和多發(fā)病，已經(jīng)成為當(dāng)今婦女不孕癥的最主要病因。目前，主要通過激素治療和免疫治療等方法恢復(fù)卵巢功能，然而上述方法只能暫時地緩解癥狀，不能有效促進(jìn)自身損傷卵巢組織的再生修復(fù)，無法根治疾病。通過注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代藥物治療和手術(shù)治療，是近年來臨床應(yīng)用中用來治療卵巢早衰的新手段。然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞必須通過骨髓穿刺才能獲取，不僅取樣困難，而且容易給患者造成一定的身體損傷，阻礙了健康人群捐獻(xiàn)骨髓的意愿。另外，骨髓中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的含量非常稀少，增殖能力較低。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑，應(yīng)用于制備治療卵巢早衰的藥物，干細(xì)胞來源方便、無創(chuàng)傷性。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑，包含：子宮內(nèi)膜干細(xì)胞、人參皂苷rb1和人參皂苷re。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrialstemcells,enscs)是一種成體干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化和高度增殖的潛能，致癌風(fēng)險低，受倫理學(xué)爭議少。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有與bmmscs相似的生物學(xué)特性，均表達(dá)cd29、cd44、cd73和cd90等間充質(zhì)干細(xì)胞特異的表面標(biāo)志，不表達(dá)cd14、cd34、cd45、cd133和stro-1等內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞表面標(biāo)志，不表達(dá)mhc-i，少量表達(dá)mhc-ii，不表達(dá)或極少表達(dá)hla-dr，說明enscs具有較低免疫原性。enscs可從經(jīng)血中無創(chuàng)獲取，增殖速度快，傳代穩(wěn)定，免疫原性低，具有較強的旁分泌能力。優(yōu)選的，所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的濃度為1.0×107～5.0×107個/ml。人參總皂苷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)有廣泛的作用，從而可提高人體力、智力的活動能力，增強機(jī)體對有害刺激的非特異性抵抗力。優(yōu)選的，所述人參皂苷rb1的濃度為0.1～2mg/l，更優(yōu)選為0.5～1.5mg/l，最優(yōu)選為1mg/ml。優(yōu)選的，所述人參皂苷re的濃度為0.1～2mg/l，更優(yōu)選為0.5～1.5mg/l，最優(yōu)選為1mg/ml。優(yōu)選的，所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑還包含：生理鹽水。本發(fā)明還提供了一種上述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑的制備方法，將子宮內(nèi)膜干細(xì)胞、人參皂苷rb1、人參皂苷re和生理鹽水混合，得到所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑。本發(fā)明還提供了上述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑或上述制備方法得到的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑在制備治療卵巢早衰藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑為注射制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑具有以下優(yōu)點：1)本發(fā)明選用子宮內(nèi)膜干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，取材方便，無創(chuàng)傷性，無倫理限制；而且所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑免疫原性低，可避免免疫排斥，安全可靠；2)本發(fā)明子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑還包含人參皂苷rb1和人參皂苷re，人參皂苷可直接增強衰老細(xì)胞的抗逆能力，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞通過旁分泌作用修復(fù)卵巢早衰組織，人參皂苷和子宮內(nèi)膜干細(xì)胞協(xié)同作用，有效抑制了卵巢早衰，大大的縮短組織修復(fù)時間；3)本發(fā)明制劑選用生理鹽水作為溶劑，其滲透壓與人體的滲透壓一致，可避免損傷卵巢組織，低溫保存下其生物活性穩(wěn)定；4)本發(fā)明子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑為注射制劑，可避免血液流動而造成制劑的損失；5)本發(fā)明制劑的制備步驟簡單，耗時短，可實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。圖1為各組卵巢組織切片的卵泡數(shù)量結(jié)果。具體實施方式通過選用子宮內(nèi)膜干細(xì)胞替代骨髓干細(xì)胞，同時優(yōu)化制劑中的組成成分，本發(fā)明提供了一種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑，應(yīng)用于制備治療卵巢早衰的藥物，干細(xì)胞存活率穩(wěn)定、來源方便、無創(chuàng)傷性，而且制劑的制備時間短、效率高。本發(fā)明對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞、人參皂苷rb1和人參皂苷re的來源不作特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞、人參皂苷rb1和人參皂苷re即可，或采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備得到的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞、人參皂苷rb1和人參皂苷re。下面將結(jié)合本發(fā)明具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行修改或者對部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。以下實施例中，所采用的人參皂苷rb1和人參皂苷re來源于陜西慧科植物開發(fā)有限公司。實施例1子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的制備1、經(jīng)咨詢同意后，根據(jù)經(jīng)血采集套裝(杭州易文賽，s-evansbiosciences)說明書收集健康女性的經(jīng)血樣品；然后將這些樣品轉(zhuǎn)移至含有雙抗(青霉素/鏈霉素)和肝素的磷酸鹽緩沖液中，4℃條件下保存，24h～48h之內(nèi)將樣品送往實驗室離心；接著取上清液并在無菌條件下快速檢測是否存在細(xì)菌污染，若為陰性則繼續(xù)分離培養(yǎng)并鑒定，表1為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的流式鑒定結(jié)果。其中，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定過程請參考下列文獻(xiàn)：周華,宋麗娜,張敏.人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定.中華中醫(yī)藥學(xué)刊[j].2014.32(8):1907-1908。表1cd73cd90cd105cd11bcd19cd34cd45hla-dr表達(dá)量98.4％97.5％99.3％1.8％1.2％1.0％0.4％1.4％實施例2(1)配方：子宮內(nèi)膜干細(xì)胞5×107個/ml；人參皂苷rb11mg/ml；人參皂苷re1mg/ml；生理鹽水補足。(2)制備：1)將人參皂苷rb1和人參皂苷re采用生理鹽水進(jìn)行溶解，得到人參皂苷溶液；其中，人參皂苷rb1和人參皂苷re的濃度均為1mg/ml；2)采用步驟1)得到的人參皂苷溶液重懸實施例1中得到的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，得到所述子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑，其中子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的濃度為5×107個/ml；3)把步驟2)得到的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞制劑分裝至注射器中，然后放到無菌的空盒里，把轉(zhuǎn)有制劑的空盒轉(zhuǎn)移至已放有冰袋的保存箱中，于0～4℃下進(jìn)行保存。實施例3子宮內(nèi)膜干細(xì)胞1×107個/ml；人參皂苷rb10.1mg/ml；人參皂苷re0.1mg/ml；生理鹽水補足。實施例4子宮內(nèi)膜干細(xì)胞2.5×107個/ml；人參皂苷rb10.5mg/ml；人參皂苷re0.5mg/ml；生理鹽水補足。實施例51、選用廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物部提供的2-3月齡、體重200±20g、具有正常動情周期的wistar雌性大鼠120只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，依次為對照組1、對照組2、對照組3和實驗組，每組各30只。構(gòu)建大鼠卵巢早衰模型：一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液(120mg/kg)和白消安溶液(12mg/kg)各0.1ml，每日8：00用棉簽輕取陰道分泌物涂片，再巴氏染色，觀察陰道脫落細(xì)胞變化，當(dāng)連續(xù)10d觀測到持續(xù)動情間期，視為卵巢早衰建模成功。其中構(gòu)建大鼠卵巢早衰模型的詳細(xì)過程參考如下文獻(xiàn)：張瑩瑩,殷惠群,倪豐.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,44(1):1-6。2、造模成功后，每只實驗大鼠腹腔注射苯巴比妥鈉60mg/kg，15min后將大鼠背部向上固定在動物手術(shù)臺上，消毒皮膚，持眼科鑷捏緊下腹部正中線皮膚，用外科剪作小的橫切口，剪刀鈍性分離充分暴露手術(shù)視野，切開筋膜，用鑷子拖出脂肪墊，卵巢。再用鑷子固定住卵巢，然后用微量注射器將表2所述制劑分別注入大鼠卵巢組織中，注射劑量為20μl/只。表23、參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要基因有很多種，其中bcl-2和bax基因?qū)κ箢惵殉差w粒細(xì)胞凋亡起決定性作用。其中，bax增高促進(jìn)細(xì)胞凋亡，bcl-2增高抑制細(xì)胞凋亡。(1)采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測實驗大鼠卵巢bax、bcl-2蛋白的表達(dá)水平，其具體過程為：取6μm厚的卵巢組織連續(xù)切片，采用sabc法行免疫組化染色，卵巢組織切片常溫干燥；20ml的30％h2o2和200ml蒸餾水混合，然后加入卵巢組織切片中，室溫10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，再用蒸餾水洗滌3次，每次5min；用微波爐進(jìn)行熱修復(fù)抗原后，用5％bsa封閉液室溫封閉30min，再分別滴加bcl-2和bax一抗的混合液(體積比為1：200)于4℃下過夜；翌日，室溫下滴加生物素化山羊抗兔igg作用10min，再滴加sabc作用30min，然后dab顯色3～10min，蘇木素復(fù)染，自來水返藍(lán)15min；常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。表3為各組實驗大鼠卵巢bax、bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果，如表3結(jié)果所示，對照組2和對照組3的bax、bcl-2蛋白表達(dá)與對照組1相比，p<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和子宮內(nèi)膜干細(xì)胞均能抑制卵巢早衰；對照組2和對照組3的結(jié)果相近，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的修復(fù)卵巢早衰的作用相近，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可有效替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為用于治療卵巢早衰的種子細(xì)胞。實驗組與對照組1相比，p<0.01，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，表明實驗組抑制卵巢早衰的效果明顯；與對照組2和對照組3相比，實驗組抑制卵巢早衰的效果較優(yōu)。表3各組卵巢bax、bcl-2蛋白的表達(dá)水平組別實驗小鼠個數(shù)baxbcl-2對照組1100.3469±0.00680.2684±0.0215對照組2100.2845±0.0042*0.2978±0.0160*對照組3100.2797±0.0063*0.2961±0.0152*實驗組100.1964±0.0059#0.3428±0.0124#*表示，與對照組相比，p<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；#表示，與對照組相比，p<0.01，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。(2)采用westernblot檢測實驗大鼠卵巢bax、bcl-2蛋白的表達(dá)水平，其具體過程為：每組各取10只大鼠頸椎脫臼處死，剝離取出雙側(cè)卵巢，將其剪碎；加入0.5ml裂解液，在冰上勻漿30min，4℃下12000g/min離心30min，取上清，采用bca法進(jìn)行蛋白定量，計算樣品蛋白濃度；按照體積比5:1的比例加入上樣緩沖液，水浴煮沸5min，冰上冷卻，得到變性后的蛋白；將變性后的蛋白等量上樣，然后進(jìn)行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳；使用濕法轉(zhuǎn)膜將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：60v轉(zhuǎn)膜2h；將pvdf膜用5％脫脂奶粉(用tbst配制)室溫封閉1h，分別加入bax(1：200)、bcl-2(1：200)和β-actin(1：200)，4℃孵育過夜，tbst洗膜10min×3次；將pvdf膜與辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的二抗(1：5000)在室溫下孵育1h，tbst洗膜10min*3次；將pvdf膜置于保鮮膜上，a、b發(fā)光液按1：1比例混合，滴加a、b混合液，經(jīng)凝膠自動分析成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，圖像采集和分析。表4為各組大鼠卵巢bax和bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果，如表4結(jié)果所示，對照組2和對照組3的bax、bcl-2蛋白表達(dá)與對照組1相比，p<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和子宮內(nèi)膜干細(xì)胞均能抑制卵巢早衰；對照組2和對照組3的結(jié)果相近，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的修復(fù)卵巢早衰的作用相近，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可有效替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為用于治療卵巢早衰的種子細(xì)胞。實驗組與對照組1相比，p<0.01，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，表明實驗組抑制卵巢早衰的效果明顯；與對照組2和對照組3相比，實驗組抑制卵巢早衰的效果較優(yōu)。表4各組大鼠卵巢bax和bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果組別實驗小鼠個數(shù)baxbcl-2對照組1101.12±0.0820.49±0.046對照組2100.84±0.051*0.67±0.063*對照組3100.93±0.047*0.72±0.059*實驗組100.52±0.026#0.95±0.038#*表示，與對照組相比，p<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；#表示，與對照組相比，p<0.01，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。4、he染色觀察卵巢組織切片每組取剩下的10只大鼠頸椎脫臼處死、斷頭、剝離并取出雙側(cè)卵巢，用4％多聚甲醛固定24h后用石蠟包埋，再連續(xù)切片，每隔20μm取一張，切片厚5μm；取20張切片，常規(guī)he染色后400倍光鏡下，觀察四組標(biāo)本的切片中各階段的卵泡情況，同時觀察卵巢中的卵泡數(shù)量。圖1為各組卵巢組織切片的卵泡數(shù)量結(jié)果。當(dāng)前第1頁12