本發(fā)明屬于組合物領(lǐng)域，更具體地，涉及一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物。

背景技術(shù)：

膿腫分枝桿菌(mycobacteriumabscessus，mab)是屬于非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，ntm)分類中的迅速生長(zhǎng)的菌類，其主要引起肺部、皮膚和皮下軟組織感染，可以在免疫缺陷的病人中傳播，能引起包括囊胞性纖維癥，纖維化支氣管擴(kuò)張，慢性阻塞性肺炎等肺部疾病。相關(guān)調(diào)查研究表明，在ntm引起的肺病中，mab感染所占比例為82％，mab可以引起散在的和爆發(fā)性的流行，近年來(lái)已經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，有報(bào)道指出，過(guò)去的十年中，在中國(guó)、美國(guó)和澳大利亞由于mab引起的感染人數(shù)呈上升的趨勢(shì)。

mab對(duì)多種抗生素天然耐藥，只有極少數(shù)藥物對(duì)其具有殺菌或抑菌活性，這使得目前mab感染難以治療。1990年，克拉霉素(clarithromycin，clr)被列為mab的主要治療藥物，然而clr在治療過(guò)程中極易產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥，特別是采用clr單一治療時(shí)，誘導(dǎo)耐藥往往使治療失敗。已有研究將clr、氨基糖苷類的頭孢西丁(cefoxitin，fox)以及阿米卡星(amikacin，amk)聯(lián)用治療由mab引起的疾病，但是該療法的治愈率僅有50％左右，并且副作用極大，復(fù)發(fā)率高，且臨床治療周期往往需要2～6個(gè)月，但是藥物的副作用往往不允許這么長(zhǎng)時(shí)間的療程。

氯法齊明(clofazimine，cfz)是人工合成化合物，最初是麻風(fēng)病的治療藥物，后來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)其抗其他分枝桿菌的活性，現(xiàn)為耐多藥結(jié)核病(mdr-tb)的二線口服藥物。然而，由于其在治療時(shí)會(huì)有時(shí)滯性，需要很長(zhǎng)的治療周期，且藥物副作用大，長(zhǎng)期治療會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的色素沉積以及心臟毒性。此外，cfz對(duì)mab的抑菌效果并不理想，最小抑制濃度(miniuminhibitationconcentration,mic)往往超過(guò)1.5μg/ml，目前對(duì)于cfz是否能有效治療mab感染，仍有待檢驗(yàn)。

吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物是一種具有良好的體外抗結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，簡(jiǎn)稱結(jié)核菌)活性的新型化合物，其抗結(jié)核菌的mic低于0.1μg/ml，部分達(dá)到0.003μg/ml，對(duì)臨床分選的耐多藥結(jié)核菌(mdr-tb)菌株具有很強(qiáng)的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在20mg/kg/d的劑量下，可有效抑制小鼠體內(nèi)結(jié)核菌生長(zhǎng)；然而，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)mab的最低抑菌濃度超過(guò)了50μg/ml，已經(jīng)可以判斷其不能單獨(dú)用于治療mab感染。

綜上，開(kāi)發(fā)一種起效快、不反彈、療效好的治療mab感染的藥物，具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在制備氯法齊明抗菌增效劑中的應(yīng)用；

本發(fā)明的目的之二在于提供一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在制備氯法齊明抗菌增效劑中的應(yīng)用。

作為上述應(yīng)用的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在制備氯法齊明抗膿腫分枝桿菌增效劑中的應(yīng)用。

作為上述應(yīng)用的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物為吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯或醚或其立體異構(gòu)體或其前藥分子。

作為上述應(yīng)用的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物的主體結(jié)構(gòu)式如下：

其中，r1基團(tuán)為：5-ome；r2基團(tuán)為：me；r3基團(tuán)為：

一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物，其活性成分含有：

(a)氯法齊明；和

(b)吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物；和/或

(c)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

上述組合物的優(yōu)選，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素中的一種或多種。

上述組合物的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物為吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯或醚或其立體異構(gòu)體或其前藥分子。

上述組合物的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物的主體結(jié)構(gòu)式如下：

其中，r1基團(tuán)為：5-ome；r2基團(tuán)為：me；r3基團(tuán)為：

上述組合物的優(yōu)選，治療膿腫分枝桿菌感染的組合物其活性成分按重量份含有：吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物1～25份，氯法齊明20～100份。

上述組合物的優(yōu)選，治療膿腫分枝桿菌感染的組合物活性成分按重量份含有：吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物1.5～2.5份、氯法齊明2～3份、克拉霉素或羅紅霉素15～25份。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物可用于制備氯法齊明抗膿腫分枝桿菌增效劑，研究發(fā)現(xiàn)，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物體外單獨(dú)使用不能抑制膿腫分枝桿菌，氯法齊明體外單獨(dú)使用的最低抑菌濃度為2.5μg/ml，二者聯(lián)用具有協(xié)同效果，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)低濃度的吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物即可增強(qiáng)氯法齊明抗膿腫分枝桿菌的效果。

本發(fā)明的治療膿腫分枝桿菌感染的組合物，其活性成分含有氯法齊明和/或大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，以及增效劑吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物；胞內(nèi)活性檢測(cè)和小鼠體內(nèi)活性檢測(cè)表明：吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物和氯法齊明存在協(xié)同作用；此外，無(wú)論是單獨(dú)使用克拉霉素，還是克拉霉素和阿米卡星聯(lián)合使用，都極易產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥，導(dǎo)致膿腫分枝桿菌感染的治療效果下降，所需治療周期也被大大延長(zhǎng)，使用氯法齊明、吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物以及克拉霉素或者羅紅霉素三種藥聯(lián)合使用后，不僅起效快，同時(shí)也沒(méi)有出現(xiàn)治療反彈，并且克服了現(xiàn)有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床治療易產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥，長(zhǎng)期治療效果差的弊端。

附圖說(shuō)明

圖1：cfz和tb47的分級(jí)濃度對(duì)mab藥敏檢測(cè)結(jié)果，圖中，x軸所示為相應(yīng)的cfz分級(jí)濃度，圖標(biāo)所示為相應(yīng)的tb47分級(jí)濃度，y軸所示為兩藥聯(lián)用時(shí)檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值對(duì)應(yīng)菌數(shù)；

圖2：低濃度tb47對(duì)cfz抗mab的增效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中，x軸表示檢測(cè)的不同時(shí)間點(diǎn)，準(zhǔn)備加藥前為0h，y軸所示為檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值對(duì)應(yīng)菌數(shù)；

圖3：clr、rox(roxithromycin，羅紅霉素)和cfz單用以及cfz和tb47組合使用對(duì)mab胞內(nèi)活性的檢測(cè)結(jié)果；圖中，x軸表示檢測(cè)的不同時(shí)間點(diǎn)，準(zhǔn)備加藥前為0h，y軸表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值(與存活的細(xì)菌量成正比)和0h檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值的比值；

圖4：不同藥物組合對(duì)mab胞內(nèi)活性的檢測(cè)結(jié)果；圖中，x軸表示檢測(cè)的不同時(shí)間點(diǎn)，準(zhǔn)備加藥前為0h，y軸表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值(與存活的細(xì)菌量成正比)和0h檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值的比值；

圖5：不同藥物及藥物組合對(duì)感染mab小鼠體內(nèi)活性的檢測(cè)結(jié)果；圖中，x軸表示處死小鼠檢測(cè)的不同時(shí)間點(diǎn)，準(zhǔn)備加藥前為day0，y軸表示的是小鼠肺部的菌載量；triple-drug組只有14天后的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的治療膿腫分枝桿菌感染的組合物，其活性成分含有：

(a)氯法齊明；和

(b)吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物；和/或

(c)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

其中吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物作為氯法齊明的抗菌增效劑；

其中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以選用克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等。

本發(fā)明所述的tb47為一種吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物，

tb47的主體結(jié)構(gòu)式為：

其中：r1基團(tuán)為：5-ome；r2基團(tuán)為：me；r3基團(tuán)為：

本發(fā)明的吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物可以是吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯或醚或其立體異構(gòu)體或其前藥分子。

本發(fā)明中所述的最低抑菌濃度為mic90。

本發(fā)明所用的自發(fā)光mab，為廣州市胸科醫(yī)院提供臨床菌株，申請(qǐng)人構(gòu)建的自主發(fā)光mab，專利號(hào)cn201510104936.3。

以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)例1、cfz和tb47的分級(jí)抑菌濃度實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)分組

tb47分級(jí)濃度為12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0μg/ml；

cfz(cfz)分級(jí)濃度為10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.62μg/ml、0μg/ml；

按上述兩種藥物的分級(jí)濃度一一相互組合聯(lián)合給藥；

上述所用cfz、tb47溶解于二甲基亞砜(dmso)中待用。

2.實(shí)驗(yàn)步驟

(1)mab的培養(yǎng)

將自發(fā)光mab接入5ml7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，培養(yǎng)至菌液的od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，將菌液稀釋10^-6，取0.5ml鋪板7h11固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14天；從平板上挑取單菌落使用發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)相對(duì)光單位(rlu)，將確認(rèn)發(fā)光的單菌落接入50ml的7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散。培養(yǎng)至od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，使用7h9液體培養(yǎng)基稀釋至每200ul體積菌液發(fā)光值為3000～8000，用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，以校準(zhǔn)實(shí)際菌數(shù)。

(3)mab藥敏檢測(cè)

取96孔板，根據(jù)各組設(shè)計(jì)的藥物濃度，將不同藥物分別加入設(shè)計(jì)孔中；在各孔中加入200μl含有相同菌量的菌懸液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；在培養(yǎng)18小時(shí)后檢測(cè)相對(duì)發(fā)光值，相對(duì)發(fā)光值越小，說(shuō)明藥物抑菌效果越明顯，反之亦然。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明：當(dāng)cfz濃度為0μg/ml時(shí)，分級(jí)提高tb47濃度，均表明單用tb47并不能抑制mab；當(dāng)tb47濃度為0μg/ml時(shí)，cfz的最低抑菌濃度為2.5μg/ml；當(dāng)cfz和tb47聯(lián)用后，其組合最低抑菌濃度是：cfz為0.62μg/ml和tb47為0.78μg/ml。根據(jù)分級(jí)抑菌濃度(fractionalinhibitoryconcentration，fic)的計(jì)算公式，即fic指數(shù)＝mic(a組聯(lián)合)/mic(a組單用)+mic(b組聯(lián)合)/mic(b組單用)，計(jì)算其fic指數(shù)為0.3104左右，該指數(shù)小于0.5，因此可以判斷cfz和tb47存在協(xié)同作用。

實(shí)驗(yàn)例2、低濃度tb47對(duì)cfz抗mab的增效實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)分組

utreated組：給等體積的dmso，作為對(duì)照

tb47-0.078組：給藥tb47，濃度為0.078μg/ml；

cfz-2組：給藥cfz，濃度2μg/ml；

cfz-2+tb47-0.02組：給藥濃度為tb470.02μg/ml和cfz2μg/ml；

cfz-2+tb47-0.078組：給藥濃度為tb470.078μg/ml和cfz2μg/ml；

上述所用cfz、tb47溶解于dmso中待用。

2.實(shí)驗(yàn)步驟

(1)mab的培養(yǎng)

將自發(fā)光mab接入5ml7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，培養(yǎng)至菌液的od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，將菌液稀釋10^-6，取0.5ml鋪板7h11固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14天；從平板上挑取單菌落使用發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)相對(duì)光單位(rlu)，將確認(rèn)發(fā)光的單菌落接入50ml的7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散。培養(yǎng)至od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，使用7h9液體培養(yǎng)基稀釋至每200ul體積菌液的發(fā)光值為3000～8000，用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，以校準(zhǔn)實(shí)際菌數(shù)。

(2)mab藥敏檢測(cè)

取96孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組的藥物濃度，將不同藥物分別加入設(shè)計(jì)孔中，在各個(gè)孔中加入200μl含有相同菌量的菌懸液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，從給藥開(kāi)始時(shí)和培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)檢測(cè)相對(duì)發(fā)光值，相對(duì)發(fā)光值越小，說(shuō)明藥物抑菌效果越明顯，反之亦然。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明：僅0.02μg/ml的tb47即可顯著提高cfz的抑菌效果；說(shuō)明吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在很低濃度下可增強(qiáng)cfz抗mab的效果。

實(shí)驗(yàn)例3、本發(fā)明組合物的胞內(nèi)活性檢測(cè)

1.實(shí)驗(yàn)分組

untreated組：給等體積的二甲亞砜，作為對(duì)照；

tb47組：給藥tb47，濃度為1μg/ml；

cfz組：給藥cfz，濃度為2μg/ml，為其體外最低抑菌濃度；

clr組：給藥clr，濃度為4μg/ml，為其體外最低抑菌濃度；

rox組：給藥rox，濃度為4μg/ml，為其體外最低抑菌濃度；

cfz+tb47組：給藥cfz1μg/ml和tb472μg/ml；

clr+amk組：給藥clr4μg/ml和amk8μg/ml；

cfz+tb47+clr組：給藥cfz1μg/ml、tb472μg/ml和clr4μg/ml；

cfz+tb47+rox組：給藥cfz1μg/ml、tb472μg/ml和rox4μg/ml；

上述所用clr、rox、cfz、tb47溶解于dmso中待用；amk溶解于去離子水中，過(guò)濾除菌后待用。

2.實(shí)驗(yàn)步驟

(1)thp-1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與處理

調(diào)整thp-1細(xì)胞的密度為5×10⁵/ml，移取2ml置于35×10mm的培養(yǎng)皿中，加入佛波酯(pma)至終濃度為100ng/l和0.1％胎牛血清白蛋白(bsa)的無(wú)血清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，當(dāng)70～90％的細(xì)胞由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁狀態(tài)，且細(xì)胞形狀也發(fā)生明顯變化，由圓形變?yōu)樗笮危瑱E圓形或者不規(guī)則形，說(shuō)明thp-1單核細(xì)胞已被pma誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞

(2)mab的培養(yǎng)

將自發(fā)光mab接入5ml7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，培養(yǎng)至菌液的od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，將菌液稀釋10^-6，取0.5ml鋪板7h11固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14天；從平板上挑取單菌落使用發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)相對(duì)光單位(rlu)，將確認(rèn)發(fā)光的單菌落接入50ml的7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，用無(wú)菌生理鹽水重懸后，用300目的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，濾后接近形成單個(gè)存在的菌懸液，用于細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，并對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，以校準(zhǔn)實(shí)際菌數(shù)。

(3)自發(fā)光mab侵染巨噬細(xì)胞

將誘導(dǎo)分化完成的巨噬細(xì)胞用pbs清洗3次，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的自發(fā)光mab，moi為10，侵染3h。在侵染這段時(shí)間中，根據(jù)各組設(shè)計(jì)的藥物濃度，將不同藥物分別加入含0.1％胎牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)基(無(wú)雙抗)中混勻。侵染完成后，使用pbs清洗細(xì)胞3次，加入含有藥物的0.1％胎牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)基(無(wú)雙抗)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

3.檢測(cè)結(jié)果

從給藥開(kāi)始時(shí)，定時(shí)檢測(cè)相對(duì)發(fā)光值，并計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)發(fā)光值與0h檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值的比值，該比值越小說(shuō)明藥物抑菌效果越明顯，反之亦然。

檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明：tb47組與utreated組的檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明單獨(dú)使用tb47并不能抑制mab，而cfz+tb47組的檢測(cè)結(jié)果顯著低于cfz組，說(shuō)明tb47可以提高cfz的活性，二者聯(lián)用存在協(xié)同作用，并且聯(lián)用效果明顯優(yōu)于clr以及rox治療組。

檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明：clr+amk組起效遠(yuǎn)慢于cfz+tb47組、cfz+tb47+clr組和cfz+tb47+rox組，而clr+amk組和cfz+tb47組在給藥21h以后出現(xiàn)治療反彈，而cfz+tb47+clr組和cfz+tb47+rox組不僅比目前臨床上常用的治療方案起效更快，而且效果最優(yōu)，未出現(xiàn)治療反彈。

實(shí)驗(yàn)例4、本發(fā)明組合物的小鼠體內(nèi)活性檢測(cè)

1.動(dòng)物分組及給藥

選擇6周左右的balb/c-nude鼠，使用glas-col氣溶膠發(fā)生器進(jìn)行mab感染，每只小鼠感染約5000cfu，感染兩天后開(kāi)始給藥治療，給藥分組如下，每組5只小鼠：

untreated組：給等體積的0.5wt％的羧甲基維素鈉溶液，作為對(duì)照；；

cfz組：給藥cfz，灌胃量為25mg/kg；

tb47組：給藥tb47，灌胃量為20mg/kg；

cfz+tb47組：給藥灌胃量為cfz25mg/kg和tb4720mg/kg；

rox組：給藥rox，灌胃量為200mg/kg

triple-drugs組：給藥灌胃量為cfz25mg/kg、tb4720mg/kg、rox200mg/kg；

每種藥物的灌胃量為0.2ml/次/只，每天均只給藥一次；

上述clr、rox、cfz、tb47分別溶于0.5wt％的羧甲基維素鈉溶液中，超聲和震蕩處理去除團(tuán)塊后，4℃避光待用。

2.指標(biāo)檢測(cè)

在灌胃7d和14d，麻醉小鼠后頸椎脫臼法處死，取肺研磨，測(cè)定肺部的菌載量。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，cfz+tb47組的抑菌效果優(yōu)于各自單獨(dú)使用，說(shuō)明tb47和cfz在體內(nèi)聯(lián)用具有協(xié)同作用。目前認(rèn)為rox等大環(huán)內(nèi)酯類的短期療效較好，而長(zhǎng)期療效較差，因此對(duì)于triple-drugs組，主要是探究cfz+tb47能否提高rox的長(zhǎng)期療效，因此在治療7天的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)未進(jìn)行檢測(cè)，只檢測(cè)了14天后的治療結(jié)果，可以看到triple-drug組的抑菌效果顯著優(yōu)于其他任意組別，說(shuō)明在tb47和cfz聯(lián)用的基礎(chǔ)上，再加用rox或clr這類環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能進(jìn)一步增強(qiáng)療效，并且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，療效更佳，克服了現(xiàn)有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床治療易產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥，長(zhǎng)期治療效果差的弊端。