本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及從鳳尾草中分得的七個厥素類化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鳳尾草（pterismultifidapoir.）為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物，又名井欄邊草，廣泛分布于我國各省區(qū)。鳳尾草性寒,味淡、微苦,歸大腸、肝、心經(jīng)；具有清熱利濕、消腫解毒、涼血止血之功效，用于治療肝炎、菌痢、淋濁、便血、扁桃體炎、癰腫瘡毒及濕疹等。鳳尾草所含的化學(xué)成分主要有黃酮、厥素類倍半萜（pterosin）和二萜等類型化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明鳳尾草具有很好的抗氧化、抗誘變、抗菌、抗炎及抗腫瘤作用。發(fā)明人通過對鳳尾草的系統(tǒng)化學(xué)成分研究，結(jié)合抗炎藥效活性篩選，發(fā)現(xiàn)七個具有抗炎活性的厥素類化合物。本發(fā)明公開了這七個厥素類化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所涉及的從鳳尾草（pterismultifidapoir.）中提取分離的厥素類化合物如以下通式ⅰ所示。

通式ⅰ

其中：

化合物1：乙酰蕨素b；

化合物2：蕨素z；

化合物3：2r,3s-乙酰蕨素c；

化合物4：2s,3s-乙酰蕨素c；

化合物5：2r,3r-13-羥基-蕨素l3-o-β-d-葡萄糖苷；

化合物6：蕨素c3-o-β-d-葡萄糖苷；

化合物7：蕨素q3-o-β-d-葡萄糖苷。

本發(fā)明的目的是提供通式ⅰ代表的厥素類化合物在制備抗炎中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的：取干燥鳳尾草（pterismultifidapoir.）全草經(jīng)70%乙醇回流提取，減壓濃縮得稠浸膏。將稠浸膏用水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。將乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜、sephadexlh-20凝膠柱色譜、制備高效液相色譜分離純化，溶劑重結(jié)晶得化合物1~4。將水部位經(jīng)大孔樹脂柱、聚酰胺柱、硅膠柱和sephadexlh-20凝膠柱色譜分離純化，溶劑重結(jié)晶得化合物5~7。

化合物1：淡黃色油狀物。esi-msm/z:[m+h]⁺261。¹h-nmr(cdcl3)δh:7.10(1h,s,h-4),3.56(2h,t,j=8.1hz,h-14),3.24(1h,m,h-2),3.04(2h,t,j=8.1hz,h-13),2.69(3h,s,h-12),2.54~2.66(2h,m,h-3),2.44(3h,s,h-15),2.05(3h,s,acetyl-me),1.27(3h,d,j=6.7hz,h-11).¹³c-nmr(cd3od)δ:210.0(c-1),170.8(acetyl-c=o),152.7(c-8),144.1(c-5),137.8(c-7),133.9(c-6),132.0(c-9),125.6(c-4),62.6(c-14),42.3(c-2),33.6(c-3),29.7(c-13),21.0(c-12),20.8(c-acetyl-me),16.4(c-11),13.4(c-15)。根據(jù)文獻（舒積成，潘景行，張銳，任曉靜，劉建群.鳳尾草中倍半萜類成分研究[j].中成藥,2011，33（12）：2104-2107.），確認為乙酰蕨素b。

化合物2：無色粉末。mp85-86℃。esi-msm/z:[m+h]⁺233。¹h-nmr(cd3od)δh:7.00(1h,s,h-4),3.61(2h,t,j=7.5hz,h-14),2.91(2h,t,j=7.5hz,h-13),2.67(2h,s,h-3),2.42(3h,s,h-12),2.28(3h,s,h-15),1.07(3h*2,s,h-10,11).¹³c-nmr(cd3od)δ:211.3(c-1),149.1(c-8),146.8(c-5),141.4(c-9),137.5(c-7),135.1(c-6),126.1(c-4),60.9(c-14),45.3(c-2),39.3(c-3),32.6(c-13),25.4(c-10,11),19.5(c-12),13.5(c-15)。根據(jù)文獻（舒積成，潘景行，張銳，任曉靜，劉建群.鳳尾草中倍半萜類成分研究[j].中成藥,2011，33（12）：2104-2107.），確認為蕨素z。

化合物3：白色針晶(meoh);mp141–142oc;[α]²⁰d=+51.8(meoh,c=0.3,);uv(meoh)λmaxnm(logε)257(4.02);hr-tof-ms:found277.1433[m+h]⁺,calcforc16h21o4277.1434;esi-ms(+),m/z:277[m+h]⁺,299[m+na]⁺,315[m+k]⁺,259[m+h–h2o]⁺,199[m+h–h2o-ch3cooh]⁺;esi-ms(-),m/z:275[m-h]^-,257[m-h–h2o]^-;¹h-nmr(cd3od)δh:2.77(1h,m,h-2)，5.16(1h,d,j=6.6hz,h-3)，7.38(1h,s,h-4)，1.18(3h,dd,j=2.4,6.8,h-11)，2.49(3h,s,h-12)，3.11(2h,liket,j=7.5,h-13)，4.17(2h,liket,j=7.5,h-14)，2.66(3h,s,h-15)，2.00(3h,s,h-oac)。¹³c-nmr(cd3od)δ:210.0(c-1),49.7(c-2),70.2(c-3),126.8(c-4),146.4(c-5),137.6(c-6),138.4(c-7),132.3(c-8),155.5(c-9),10.6(c-11),21.3(c-12),28.9(c-13),63.8(c-14),14.0(c-15)。根據(jù)文獻（jichengshu,jianqunliu,youquanzhong,jinghangpan,lifangliu,ruizhang.twonewpterosinsesquiterpenesfrompterismultifidapoir[j].phytochemistryletter,2012,5(2):276-279.），確認為2r,3s-乙酰蕨素c。

化合物4：白色針晶(meoh);mp126–127oc;[α]²⁰d=+83.6(meoh,c=0.2,);uv(meoh)λmaxnm(logε)256(4.08);esi-ms(+),m/z:277[m+h]⁺,299[m+na]⁺,315[m+k]⁺,259[m+h–h2o]⁺;esi-ms(-),m/z:275[m-h]^-,257[m-h–h2o]^-;¹h-nmr(cd3od)δh:2.45(1h,m,h-2)，4.69(1h,d,j=4.0hz,h-3)，7.38(1h,s,h-4)，1.30(3h,dd,j=7.4,h-10)，2.49(3h,s,h-12)，3.10(2h,liket,j=7.5,h-13)，4.17(2h,liket,j=7.5,h-14)，2.66(3h,s,h-15)，2.00(3h,s,h-oac)。¹³c-nmr(cd3od)δ:207.5(c-1),54.7(c-2),75.9(c-3),125.8(c-4),146.4(c-5),137.2(c-6),138.1(c-7),132.5(c-8),154.9(c-9),13.2(c-10),21.4(c-12),28.9(c-13),63.8(c-14),14.0(c-15)。根據(jù)文獻（jichengshu,jianqunliu,youquanzhong,jinghangpan,lifangliu,ruizhang.twonewpterosinsesquiterpenesfrompterismultifidapoir[j].phytochemistryletter,2012,5(2):276-279.），確認為2s,3s-乙酰蕨素c。

化合物5：白色粉末(meoh);mp107–108oc;[α]²⁰d=-26.6(meoh,c=0.2,);uv(meoh)λmaxnm(logε)258(4.12);hr-tof-ms:found465.1742[m+na]⁺,calcforc21h30nao10465.1731;esi-ms(-),m/z:441[m-h]^-,477[m+cl]^-,883[2m-h]^-,405[m-2h2o]^-;¹h-nmr(cd3od)δh:4.97(1h,s,h-3)，7.51(1h,s,h-4)，1.21(3h,s,h-10)，3.71(1h,d,j=11.0,h-11)，3.77(1h,d,j=11.0,h-11)，2.58(3h,s,h-12)，5.32(1h,dd,j=4.8,8.4,h-13)，3.63(1h,dd,j=4.8,11.4,h-14)，3.91(1h,dd,j=8.4,11.4,h-14)，2.76(3h,s,h-15)，4.66(1h,d,j=7.8,h-1’)，3.30(1h,m,h-2’)，3.45(1h,m,h-3’)，3.37(1h,m,h-4’)，3.39(1h,m,h-5’)，3.73(1h,dd,j=5.2,11.6,h-6’)，3.94(1h,dd,j=2.0,11.6,h-6’)。¹³c-nmr(cd3od)δ:209.3(c-1),57.4(c-2),85.0(c-3),127.4(c-4),146.4(c-5),140.8(c-6),138.8(c-7),133.2(c-8),153.3(c-9),18.7(c-10),67.1(c-11),22.3(c-12),72.8(c-13),65.6(c-14),15.2(c-15),105.6(c-1’),75.1(c-2’),77.9(c-3’)，71.7(c-4’)，78.2(c-5’)，62.7(c-6’)。根據(jù)文獻（jichengshu,jianqunliu,youquanzhong,jinghangpan,lifangliu,ruizhang.twonewpterosinsesquiterpenesfrompterismultifidapoir[j].phytochemistryletter,2012,5(2):276-279.），確認為2r,3r-13-羥基-蕨素l3-o-β-d-葡萄糖苷。

化合物6：白色粉末。esi-msm/z:[m+na]⁺419,[m+h]⁺397。¹h-nmr(cd3od)δh:7.52(1h,s,h-4),4.76(1h,d,j=3.5hz,h-3),4.61(1h,d,j=7.8hz,h-1′),3.90(1h,br.d,j=12.0hz,h-6′a),3.74(1h,dd,j=4.0,12.0hz,h-6′b),3.61(2h,t,j=7.5hz,h-14),3.24~3.45(4h,m,h-2′,3′,4′,5′),3.00(2h,t,j=7.5hz,h-13),2.74(1h,m,h-2),2.63(3h,s,h-12),2.46(3h,s,h-15),1.33(3h,d,j=7.4hz,h-11).¹³c-nmr(cd3od)δ:208.2(c-1),152.1(c-8),146.1(c-5),138.8(c-7),132.5(c-6),126.9(c-4),105.4(c-1′),84.8(c-3),78.2(c-5′),78.0(c-3′),75.3(c-2′),71.5(c-4′),62.7(c-14),61.6(c-6′),53.0(c-2),33.1(c-13),21.4(c-12),14.0(c-11,15)。根據(jù)文獻（舒積成，潘景行，張銳，任曉靜，劉建群.鳳尾草中倍半萜類成分研究[j].中成藥,2011，33（12）：2104-2107.），確認為蕨素c3-o-β-d-葡萄糖苷。

化合物7：無色油狀物。esi-msm/z:[m+na]⁺435,[m+h]⁺413。¹h-nmr(cd3od)δh:7.52(1h,s,h-4),5.33(1h,m,h-13),4.77~4.82(2h,m,h-14a,3),4.62(1h,d,j=7.8hz,h-1′),3.23~3.96(7h,m,h-14b,2′,3′,4′,5′,6′),2.77(3h,s,h-12),2.75(1h,m,h-2),2.57(3h,s,h-15),1.33(3h,d,j=7.5hz,h-11).¹³c-nmr(cd3od)δ:208.1(c-1),152.9(c-8),146.3(c-5),138.6(c-7),132.9(c-6),127.9(c-4),105.5(c-1′),84.7(c-3),78.0(c-5′),77.9(c-3′),75.2(c-2′),72.7(c-13),71.3(c-4′),65.4(c-14),62.5(c-6′),53.1(c-2),22.3(c-12),14.0(c-11,15)。根據(jù)文獻（舒積成，潘景行，張銳，任曉靜，劉建群.鳳尾草中倍半萜類成分研究[j].中成藥,2011，33（12）：2104-2107.），確認為蕨素q3-o-β-d-葡萄糖苷。

通式ⅰ代表的厥素類化合物可以來源于鳳尾草（pterismultifidapoir.）或其它植物，也可以來源于化學(xué)合成、半合成或生物轉(zhuǎn)化。

通式ⅰ代表的厥素類化合物或以其為基本活性的藥物組合物可以與藥學(xué)上合適的輔料或載體結(jié)合，采用公知方法制成注射劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、控釋制劑、緩釋制劑、納米制劑等制劑抗炎藥物。

本發(fā)明對通式ⅰ代表的厥素類化合物（1~7）進行了抗炎藥效學(xué)評價試驗。

一、化合物（1~7）對脂多糖（lps）誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細胞炎癥因子白介素1β（il-1β）過量表達的影響實驗。

1.1大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細胞的培養(yǎng)

雄性sd大鼠（180-220g）乙醚麻醉后處死，75%酒精浸泡15-20分鐘后，取出膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪碎，利用ii型膠原酶（4mg/ml）消化2h，加入含10%胎牛血清的rpmimedium1640培養(yǎng)，3天左右細胞慢慢爬出，待細胞長至融合狀態(tài)后，用0.25%胰酶（含0.1%的edta）消化2分鐘，細胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)，原代細胞3-6代用于下面的實驗。

1.2測定化合物（1~7）對lps誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細胞il-1β表達的影響

化合物（1~7）用dmso溶解，溶解后母液濃度為10mm，臨用前用磷酸鹽緩沖液（pbs）稀釋到1mm，實驗終濃度為10μm。將細胞以2×10⁶個/ml的濃度接種于48孔板，37℃，5%co2條件下培養(yǎng)至80%的融合狀態(tài)，pbs洗滌兩次。換成無血清培養(yǎng)基，加入化合物（1~7）溶液，使最終濃度為10μm，0.5h后，加入刺激劑lps（10ng/ml）。實驗分為空白組，模型組，化合物（1~7）給藥組、陽性對照藥潑尼松龍給藥組（實驗終濃度為10μm）。模型組用刺激劑lps（10ng/ml）造模，給藥組加入對應(yīng)化合物，每組6個復(fù)孔，37℃，5%co2條件下孵育24小時后，按大鼠il-1βelisa試劑盒說明要求進行測定od值，檢測波長450nm。

1.3實驗結(jié)果

見表1，結(jié)果表明，模型組il-1β表達與空白組比較有極顯著性升高（p<0.001），說明造模成功?；衔铮?~7）、潑尼松龍給藥組與模型組比較均有極顯著性差異（p<0.001），說明化合物（1~7）能顯著抑制lps誘導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)滑膜原代成纖維細胞炎癥因子il-1β的過量表達，抑制效果與陽性藥潑尼松龍相當(dāng)，說明化合物（1~7）具有明顯的抗炎活性。

表1.化合物（1~7）對lps誘導(dǎo)的滑膜原代成纖維細胞il-1β表達的影響(±s，n=6)

***與模型組比較p<0.001。

二、化合物（1~7）對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗

化合物（1~7）用2%丙二醇水溶液溶解。取昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g，隨機均分成模型組，化合物（1~7）給藥組，陽性對照藥吲哚美辛給藥組，每組10只。各給藥組按10mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給等體積2%丙二醇水溶液。連續(xù)給藥3天，末次給藥后1小時，將20μl二甲苯涂于小鼠右耳廓兩面致炎,左耳不涂為對照。1小時后將小鼠處死，剪下雙耳,用直徑6mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片,稱重。以左右耳片重量差作為腫脹度,計算抑制率。實驗結(jié)果見表2，各給藥組的平均耳腫脹度與模型組相比均有顯著性(p<0.01)差異。實驗結(jié)果表明化合物（1~7）具有顯著的抗炎活性，優(yōu)于陽性藥吲哚美辛。

表2.化合物（1~7）對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗結(jié)果(±s，n=10)

*與模型組比較p<0.01。

具體實施方式

下面通過實施例做進一步描述，但本發(fā)明并不限于實施例所述范圍。

實施例1：

取干燥鳳尾草15kg，粉碎至約60目，用70%工業(yè)乙醇在室溫下浸泡12小時后回流提取3次，每次2小時，濾過并合并濾液，減壓回收乙醇得浸膏約1550g。將浸膏加適量蒸餾水捏溶后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,減壓回收溶劑后得石油醚部位浸膏110g、乙酸乙酯部位浸膏130g、正丁醇部位浸膏310g，水部位蒸干重約950g。

取乙酸乙酯部位浸膏55g，經(jīng)硅膠(200～300目，1.5kg)柱色譜層析，以二氯甲烷-甲醇(100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1)梯度洗脫，每份收集1000ml，tlc檢測合并流份，得12個組分（fr.1~fr.12）。fr.2組份再經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮梯度洗脫，得石油醚-丙酮（10:1)洗脫流份fr.2.1~fr.2.21共21個。合并fr.2.13~fr.2.16流份，再反復(fù)經(jīng)凝膠柱色譜分離(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇1:1)，得化合物1(45mg)（甲醇重結(jié)晶）。fr.3組份再經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-丙酮梯度洗脫，得石油醚-丙酮（6:1)洗脫流份(fr.3.1~fr.3.35)共35個。合并fr.3.18~fr.3.22流份，再反復(fù)經(jīng)凝膠柱色譜分離(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇1:1)，得化合物2(9mg)（甲醇重結(jié)晶）。將硅膠柱二氯甲烷-甲醇洗脫的fr.4流份再經(jīng)硅膠柱色譜層析，以石油醚-丙酮(6:1,2:1,1:1,0:1)梯度洗脫，合并石油醚-丙酮(6:1)洗脫液再經(jīng)凝膠柱色譜分離(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇1:1)，最后經(jīng)制備高效液相色譜分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：甲醇-水60:40，檢測波長254nm)，得化合物3（36mg）（甲醇重結(jié)晶）和化合物4（24mg）（甲醇重結(jié)晶）。

取水部位浸膏共90g，經(jīng)大孔樹脂柱色譜（lsa-40型）層析，用乙醇溶液(水,20%乙醇,50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇)梯度洗脫，收集20%和70%乙醇洗脫液。將20%乙醇洗脫液用聚酰胺柱色譜分離，依次用水和95%乙醇洗脫。將聚酰胺柱水洗脫部分上200-300目硅膠層析，用氯仿-甲醇（10:1,6:1,4:1,2:1,0:1）梯度洗脫。將氯仿-甲醇（2:1）洗脫部分用制備薄層分離（展開劑氯仿-甲醇3.5:1），再經(jīng)過反復(fù)經(jīng)凝膠柱色譜分離(甲醇洗脫)，得到化合物5（25mg）（甲醇重結(jié)晶）。將大孔樹脂70%乙醇洗脫液再經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，得二氯甲烷-甲醇（5:1)洗脫流份(fr.1~fr.28)共28個，合并fr.6~fr.10流份，再反復(fù)經(jīng)凝膠柱色譜分離(洗脫劑為甲醇)，得化合物6(42mg)（甲醇重結(jié)晶），合并fr.18~fr.22流份，再反復(fù)經(jīng)凝膠柱色譜分離(洗脫劑為甲醇)，得化合物7(11mg)（甲醇重結(jié)晶）。

實施例2：

化合物1~7的片劑制備：取100mg相應(yīng)化合物與淀粉50mg，糊精50mg混合，用適量30%乙醇做濕潤劑，制成軟材，用常規(guī)方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，壓片，即得。

實施例3：

化合物1~7的膠囊劑制備：取50mg相應(yīng)化合物與淀粉60mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用適量30%乙醇做濕潤劑，制成軟材，用常規(guī)方法制粒，裝入硬膠囊中，即得。

實施例4：

化合物1~7的緩釋膠囊劑制備：取50mg相應(yīng)化合物與羥丙基甲基纖維素k15m60mg，乙基纖維素45cps20mg，乳糖20mg混合，加適量10%聚乙烯吡咯烷酮k30乙醇溶液，制成軟材，用常規(guī)方法制粒，裝入硬膠囊中，即得。