本發(fā)明屬于基因工程藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療肺癌藥物中的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥已經(jīng)成為人類死亡的重要原因，2005年至2015年間癌癥發(fā)病率增加了33％。世界衛(wèi)生組織(who)發(fā)表的《全球癌癥報告2014》預(yù)測全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長態(tài)勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年將達到2400萬人。其中，肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均居于首位，僅在2012年全球幾乎有160萬人死于肺癌。中國腫瘤登記中心2015年報顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率在中國也均居于首位，中國新增肺癌病例七十多萬，死亡人數(shù)有六十多萬。大部分肺癌患者發(fā)現(xiàn)較晚，只適用藥物治療，肺癌的傳統(tǒng)治療方法包括局部治療(包括手術(shù)治療、放射治療等)和全身性治療(包括傳統(tǒng)化療、分子靶向藥物治療等)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究取得了巨大進步，發(fā)明了吉非替尼、厄洛替尼等眾多靶向藥物，使得肺癌在放療、化療、手術(shù)治療方面取得了一定進展，但整體預(yù)后還是較差。2015年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國肺癌患者5年生存率僅為16.1％。因此尋找治療肺癌的新方法，也成為了科學(xué)家們亟待解決的問題。現(xiàn)有技術(shù)表明，甲硫氨酸依賴是絕大部分腫瘤細胞的特性，表現(xiàn)為腫瘤細胞對甲硫氨酸的過分需求，在去除甲硫氨酸或以其前體--同型半胱氨酸替代的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，細胞增殖受到抑制；而在甲硫氨酸存在的環(huán)境下則能正常生長，其中包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等十多種惡性腫瘤細胞。但是，正常細胞不存在甲硫氨酸依賴性。造成甲硫氨酸缺乏的方法主要包括去除膳食中的甲硫氨酸，或者利用甲硫氨酸酶分解甲硫氨酸。然而單獨限制飲食中甲硫氨酸的攝入來降低甲硫氨酸水平效果有限，而長期限制甲硫氨酸的攝入會引起機體營養(yǎng)不良、代謝障礙。相比于飲食限制甲硫氨酸攝入，利用甲硫氨酸酶(methioninase)不會引發(fā)過度的代謝問題，并具抗腫瘤效應(yīng)。沙門菌屬是一群在人和動物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性、侵襲性細胞內(nèi)兼性厭氧菌。其中，已知菌株vnp20009是一種高腫瘤靶向性、安全性以及具有抗腫瘤效應(yīng)的載體。它對惡性黑色素瘤、肺癌等多種小鼠實體瘤模型有顯著的抑制腫瘤生長效果。美國進行的兩項ⅰ期臨床研究表明其可以用于人體，具有安全性，但是沒有觀察到抗腫瘤效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療肺癌藥物中的新應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了所述的基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療肺癌藥物中的應(yīng)用。進一步的，所述肺癌包括肺部原生腫瘤、肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)腫瘤以及肺癌轉(zhuǎn)移腫瘤。進一步的，所述肺癌包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌等。所述非小細胞肺癌起源于上皮細胞，是肺癌的主要類型，包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細胞肺癌或未分化癌。鱗癌是各種類型肺癌中最為常見，約占50％，患病年齡大多在50歲以上，男性占多數(shù)大。多起源于較大的支氣管常為中央型肺癌，對放化療治療敏感度不及未分化癌。腺癌，起源于支氣管粘膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管的粘液腺，女性相對多見。早期一般沒有明顯的臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時可發(fā)生局部侵潤或血行轉(zhuǎn)移，臨床易轉(zhuǎn)移至肝、腦和骨等器官，還可累及胸膜引起胸腔積液。腺癌對放射治療敏感度差。腺鱗癌和大細胞癌，惡性程度較高，分化程度低，容易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，治療效果差，預(yù)后不良。目前治療肺大細胞癌臨床多以綜合治療為主，單純手術(shù)或放化療效果差。未分化癌，發(fā)病率僅次于鱗癌多見于男性，發(fā)病年齡較輕，未分化癌惡性度高生長快，而且較早地出現(xiàn)淋巴和血行廣泛轉(zhuǎn)移，對放射和化學(xué)療法較敏感，在各型肺癌中預(yù)后最差。小細胞癌又稱小細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，是肺癌中惡性程度最高的一型。此型肺癌生長速度快，轉(zhuǎn)移早，常轉(zhuǎn)移至腦、肝、骨、腎上腺等臟器,存活期大多不超過1年。手術(shù)切除效果差，但對放化療敏感,但放化療常常伴有強烈的毒副作用和并發(fā)癥，預(yù)后較差。優(yōu)選的，所述基因工程菌vnp20009-m的最低有效施用劑量為3.5*107cfu/m2。所述基因工程菌vnp20009-m用于癌癥預(yù)防和治療的給藥方式可通過多種途徑進行給藥，包括但不限于：口服給藥、局部給藥、注射給藥(包括但不限于經(jīng)靜脈、腹膜、皮下、肌肉、瘤內(nèi)給藥)等。本發(fā)明還公開了基因工程菌vnp20009-m在制備甲硫氨酸酶劑中的應(yīng)用。所述基因工程菌vnp20009-m具有較高的甲硫氨酸酶活性，可作為甲硫氨酸酶劑的制備之用。上述甲硫氨酸酶劑的給藥方式可通過多種途徑進行給藥，包括但不限于：口服給藥、局部給藥、注射給藥(包括但不限于經(jīng)靜脈、腹膜、皮下、肌肉、瘤內(nèi)給藥)等。如現(xiàn)有技術(shù)中已知的，本發(fā)明上述基因工程菌vnp20009-m為已知菌株，其性能、形狀、構(gòu)建方法均如中國專利cn105983103a中所記載。所述基因工程菌vnp20009-m為克隆有l(wèi)-methioninase基因的減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009。進一步的，所述的基因工程菌vnp20009-m為攜帶了質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009，其中，所述質(zhì)粒上克隆有l(wèi)-methioninase基因。所述質(zhì)粒包括但不限于psvsport質(zhì)粒、ptrc99a質(zhì)粒、pcdna3.1質(zhì)粒、pbr322質(zhì)?；騪et23a質(zhì)粒。所述的基因工程菌vnp20009-m按照如下方法構(gòu)建得到：將l-methioninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到l-methioninase表達質(zhì)粒，將lmethioninase表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009，即得。最為優(yōu)選的是，在構(gòu)建基因工程菌vnp20009-m的過程中，當(dāng)選用psvsport質(zhì)粒時，將l-methioninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到l-methioninase表達質(zhì)粒，然后將lmethioninase表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌vnp20009中得到基因工程菌。其中，所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400v，電阻400ω，電容25μf，放電時間4ms。本發(fā)明公開了所述基因工程菌vnp20009-m在現(xiàn)有基礎(chǔ)上用于治療肺癌的新應(yīng)用，所述基因工程菌vnp20009-m能夠有效殺傷肺癌腫瘤細胞，消除肺癌腫瘤病灶，對于原發(fā)性肺癌、肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、以及肺癌轉(zhuǎn)移至其他部位的腫瘤細胞，都具有較好的殺傷效果，治療效果較佳；而且所述基因工程菌對人體無明顯毒副作用，為肺癌的治療提供了安全有效的新途徑。附圖說明為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中，圖1為質(zhì)粒psvsport-l-methioninase酶切鑒定1％瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為本發(fā)明是westernblot鑒定methioninase表達結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明檢測沙門氏菌中methioninase活性結(jié)果圖；圖4為實施例2中患者脖頸處新生病灶狀況；圖5為實施例2中患者腫塊部位活檢細胞涂片；圖6為實施例2中患者治療3周后腫塊狀況；圖7為實施例2中患者治療5周后腫塊狀況；圖8為實施例2中患者治療12周后原病灶部位的狀況；圖9為實施例2中患者治療1周后腫塊內(nèi)部的細胞學(xué)涂片；圖10為實施例2中患者治療3周后腫塊內(nèi)部的細胞學(xué)涂片。具體實施方式實施例1基因工程菌vnp20009-m的構(gòu)建本發(fā)明所述基因工程菌vnp20009-m的構(gòu)建方法和過程如中國專利cn105983103a中實施例中所記載。(1)構(gòu)建表達l-methioninase基因的質(zhì)粒。先合成l-methioninase(genbank：l43133.1)基因亞克隆至puc57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，接著通過kpni和hindiii酶切位點亞克隆至psvsport質(zhì)粒(invitrogen)，得到psvsport-l-methioninase表達質(zhì)粒。具體構(gòu)建過程如下：將psvsport質(zhì)粒用kpni和hindiii雙酶切，酶切體系為：2μg質(zhì)粒dna，3μl10×buffer，1.5μlkpni酶，1.5μlhindiii酶，加入ddh2o補足體積至30μl，37℃溫浴3h。然后將酶切體系在1％的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出4.1kb大小的dna條帶，用膠回收純化試劑盒純化dna。通過全基因合成得到l-methioninase編碼區(qū)域dna片段亞克隆至puc57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，用kpni和hindiii雙酶切，酶切體系為：3μg質(zhì)粒dna，3μl10×buffer，1.5μlkpni酶，1.5μlhindiii酶，加入ddh2o補足體積至30μl，37℃溫浴3h。然后將酶切體系在1％的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.2kb大小的dna條帶，用膠回收純化試劑盒純化dna。將psvsport(kpni/hindiii)和l-methioninase編碼區(qū)域dna片段(kpni/hindiii)連接，連接反應(yīng)中加入2μl載體、6μl插入片段、1μlt4dna連接酶，16℃溫浴16h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到e.colidh5α(takara)的感受態(tài)細胞中。取一管50μl的dh5α感受態(tài)細胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μl上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30min；42℃熱擊60s，后冰上靜置2min；加入500μl無抗性的lb液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)1h后涂布在含氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)基平板上，過夜培養(yǎng)?？寺∩L出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒dna，用kpni和hindiii酶切鑒定，陽性克隆中可得到4.1kb、1.2kb的兩條dna條帶，如圖1所示。再通過測序進一步確定陽性克隆的序列完全正確。(2)構(gòu)建攜帶質(zhì)粒的vnp20009菌和攜帶克隆有l(wèi)-methioninase的基因的質(zhì)粒的vnp20009菌。將psvsport和psvsport-l-methioninase表達質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至vnp20009菌株(ys1646，atcc號202165)，分別命名為vnp20009-v和vnp20009-m。具體構(gòu)建過程如下：將感受態(tài)細菌vnp20009置于冰上，待其融化后移入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，向其中加入2μl質(zhì)粒，輕彈混勻，于冰上孵育1min。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，條件設(shè)置為電壓2400v，電阻400ω，電容25μf，放電時間4ms。電擊完立刻加入1mlsoc培養(yǎng)基，輕輕混勻。37℃震蕩培養(yǎng)1h；用移液器將細菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的lb-o培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37℃溫箱培養(yǎng)16h。vnp20009-v和vnp20009-m用lb-o培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確。取1×108沙門菌用蛋白裂解液提取蛋白，進行10％sds-page電泳，再穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至pvdf膜，bsa室溫封閉1h后，tbst漂洗3×5min，加入兔抗l-methioninase抗體(1：1000)，4℃孵育過夜。tbst漂洗3次，每次5min再加hrp標(biāo)記的抗兔二抗(1：10000)，室溫孵育1h，tbst漂洗3次，每次5min，ecl化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果如圖2所示，在分子量約43kd處有特異性條帶，說明vnp20009-m與vnp20009、vnp20009-v相比，l-methioninase表達量顯著提高。將l-甲硫氨酸和吡哆醛分別與vnp20009-v和vnp20009-m菌體混合，37℃孵育10min后用50％三氯乙酸終止，離心取上清，與3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(mbth)充分混勻，50℃孵育30min后，測定320nm處的吸光值，以每分鐘催化轉(zhuǎn)化1μmolα-酮丁酸的酶量定義為1個酶活性單位。結(jié)果顯示(如圖3所示)，沙門菌vnp20009-m的甲硫氨酸酶活性比vnp20009-v高10倍?？梢?，所構(gòu)建基因工程菌沙門菌vnp20009-m具有較高的甲硫氨酸酶活性，可作為甲硫氨酸酶劑的制備之用。實施例2基因工程菌vnp20009-m的抗腫瘤效果1)、過往病史及診斷臨床一男性患者，73歲，行胸腔鏡下右肺下葉鱗癌根治術(shù)后5個月，發(fā)現(xiàn)脖頸處新生腫塊(如圖4所示)，測量脖頸處病灶腫塊大小約為8cm×9cm。腫塊部位活檢經(jīng)細胞涂片鑒定為癌細胞(如圖5所示)，且骨骼ect顯示多處骨代謝活躍，胸部ct檢查報告胸骨破壞伴腫塊形成。根據(jù)患者既往治療及相關(guān)檢查，診斷患者右肺下葉鱗癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但是臨床上已經(jīng)沒有標(biāo)準(zhǔn)治療方案。2)治療方案將稀釋后的vnp20009-m均勻多點注入腫瘤部位，第一次給予6*107cfu(約為3.5*107cfu/m2)。間隔一周后，繼續(xù)進行第二次給藥，藥物總量提高至9*107cfu(約為5*107cfu/m2)。同樣采取瘤內(nèi)注射，均勻多點注射藥物。間隔一周，進行第三次給藥，與第二次相同的方法和劑量。間隔10天，進行第四次給藥，藥物濃度提高到6*107cfu/m2，瘤內(nèi)給藥。間隔10天，繼續(xù)進行第五次給藥，與第四次相同的方法和劑量。具體實施方案見下表1。表1治療實施方案次數(shù)時間劑量10天3.5*107cfu/m227天5*107cfu/m2314天5*107cfu/m2424天6*107cfu/m2534天6*107cfu/m23)療效3.1病灶大小變化治療前測量脖頸處病灶腫塊大小約為8cm×9cm(如圖4)。治療后3周后，腫塊有明顯縮小(如圖6所示)。治療5周以后(5次治療結(jié)束)，腫塊基本消失(如圖7所示)。治療后12周，脖頸鎖骨部位，即原病灶部位無異常變化(如圖8所示)。3.2腫塊內(nèi)部的變化治療前，腫塊內(nèi)部是囊性結(jié)構(gòu)，經(jīng)細胞學(xué)涂片分析發(fā)現(xiàn)較多重度異形細胞，即腫瘤細胞(如圖5所示)。治療后1周(治療1次)，腫塊明顯軟化(如圖9所示)，經(jīng)細胞學(xué)涂片發(fā)現(xiàn)含有大量中性粒細胞和少量腫瘤細胞。治療后10天(治療2次)，抽取積液約40ml；治療后2周(治療2次)，腫塊內(nèi)部進一步液化，抽取積液約90ml；治療后3周(治療3次)，腫瘤已經(jīng)縮小(如圖10所示)，繼續(xù)抽取積液約45ml，經(jīng)細胞學(xué)涂片發(fā)現(xiàn)含有大量炎性細胞和極少量腫瘤細胞，并且觀察到炎性細胞包繞在腫瘤細胞外周。治療后1個月(治療4次)，腫瘤進一步縮小，抽取積液減少到20ml左右。5次治療結(jié)束以后，檢測無積液，腫塊消除。以上結(jié)果說明本發(fā)明所述基因工程菌vnp20009-m注射到腫瘤病灶內(nèi)部，能夠引發(fā)局部炎癥細胞浸潤，進而發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。3.3副反應(yīng)每次治療當(dāng)日，注射后9-10小時，患者發(fā)熱38度左右，物理降溫可恢復(fù)正常體溫。當(dāng)日有時伴有10分鐘左右惡心嘔吐。除此以外，無其他異常感覺。治療期間，檢查肝、腎功能各項指標(biāo)，結(jié)果見下表2所示。結(jié)果顯示，患者肝、腎功能各項指標(biāo)都在正常范圍。以上結(jié)果說明vnp20009-m對人體無明顯毒性。表2患者各項檢測指標(biāo)結(jié)果項目治療前治療1周治療2周治療5周治療12周參考值丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶22.125.938.723.318.10--60.0u/l天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶14.213.81616.2150--40.0u/l總膽紅素10.227.988.528.6811.142.00-20.50umol/l堿性磷酸酶98.374.2100.8110.9108.345--125u/l白蛋白36.635.537.1839.844.240.00-55.00g/l尿素4.783.654.935.844.751.70-8.30mmol/l肌酐6165.24848.853.742.0--104.0umol/l血小板352361406296281100--30010*9/l鈉132130.3134.6133135137--147mmol/l以上數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明所述基因工程菌vnp20009-m用于治療肺癌，能夠有效殺傷肺鱗癌細胞，消除腫瘤病灶，而且對人體無明顯毒副作用。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。當(dāng)前第1頁12